CHAPITRE PREMIER

Considérations générales

sur l'hydrobilirubine, l'urobiline, la stercobiline et leurs chromogenes.

Hydrobilirubine, urobiline, stercobiline, sont les noms synonymes d’une seule et même substance : le pigment de Jaffé, dont la caractéristique spécifique est de donner en solution, soit chloroformique, soit amylique, et en présence d’un sel de zinc, une belle fluorescence verte.

En pratique, on réserve le nom d’urobiline au pigment extrait des urines, et celui de stercobiline, au pigment extrait des fèces.

Quant à l’hydrobilirubine, mot qui a l’avantage de rappeler la constitution chimique même du pigment de Jaffé, c’est le terme générique, l'appellation de groupe, désignant la famille générale des «bilines » et s'appliquant, par conséquent, tant à l’urobiline qu'à la stercobiline.

Dans les pages qui suivent, nous allons étudier, d’une part, l’hydrobilirubine extraite des urines, c'est-à-dire, lP'urobiline et son chromogène et, d'autre part, l'hydrobilirubine extraite des matières fécales, c'est-à-dire, la ster-

cobiline et son chromogene,

UROBILINE 9

1, — K.-urobiline.

L'urobiline peut se définir par sa propriété essentielle, spécifique, de donner en solution soit chloroformique, soit

amylique, une fluorescence verte par addition d’un sel de zinc.

C'est Jaffé qui découvrit ce pigment dans l’urine en 1868 et lui donna le nom d’urobiline, voulant reconnaître par là ses relations avec les pigments biliaires.

Elle répond à la formule brute C*? H#A7z:07. Au point de vue chimique, c'est une amine à fonction acide.

L’urobiline, aujourd’hui nettement différenciée, fut confondue d’abord avec d’autres corps et, en particulier, avec l’urochrome de Thudichum. Mac Munn et Jolles ont voulu distinguer deux sortes d’urobiline : l’urobiline physiologique et l’urobiline pathologique, en s’appuyant surtout sur les différences de l’analyse spectrale. Tous les auteurs sont d’accord aujourd'hui pour affirmer que l’urobiline pathologique de Mac Munn est un produit impur, dans lequel d’autres pigments viennent se mélanger à l’urobiline, et l’accord est unanime pour défendre l'unité de l’urobiline ou pigment de Jaffé.

Cette urobiline présente des rapports très étroits avec les pigments biliaires. Elle dérive, en effet, de la bilirubine par hydrogénation. La réaction est représentée par la formule suivante :

C5? H56 Az£ OS + H°0 + H? — C2 H4° Az4 O7 Bilirubine Urobiline

R. Maly a pu expérimentalement réaliser cette réaction en traitant de la bilirubine par l’amalgame de sodium. Au composé qu'il avait obtenu ainsi par réduction, Maly donna le nom d’hydrobilirubine, que tout le monde s’ac-

corde aujourd’hui à considérer comme identique à l’urobiline.

1° Principaux procédés d'extraction de l'urobiline.

A) Méthode de Jaffé. — On verse dans l'urine un excès d'ammoniaque ; on filtre; dans le liquide filtré on ajoute du chlorure de zinc, tant qu'il se produit un trouble. Il se forme ainsi des flocons volumineux qui sont lavés suecessivement à l’eau froide, puis à l'eau chaude, jusqu'à ce qu'ils ne contiennent plus de chlorure; on épuise alors par l'alcool et on filtre. On traite la masse pulvérisée par l’ammoniaque et la solution est additionnée d’acétate de plomb; il se produit ainsi un précipité rouge qu’on lave à l’eau froide et qu’on dessèche. On traite ce précipité par l'alcool additionné d’acide sulfurique et on obtient, par évaporation de la liqueur filtrée, de l'urobiline à l’état de pureté.

B) Méthode de Maly. — 1 précipite l'urine par l’acétate de plomb, lave le précipité, le chauffe plusieurs fois avec de l'alcoel et le décompose par de l'alcool contenant une certaine quantité d'acide sulfurique. La solution ainsi obtenue est saturée par de l'ammoniaque, puis additionnée de chlorure de zinc, qui forme un précipité. Ce précipité est successivement traité par l’ammoniaque, l’acétate de plomb et l’alcool. L’extrait alcoolique est additionné de chloroforme; celui-ci s'empare de l’urobiline, qui est obtenue par évaporation.

C) Méthode de Mac Munn. — Il précipite successivement l’urine par l’acétate et le sous-acétate de plomb. Les - deux précipités, qui ont entrainé l’urobiline, sont réunis, puis décomposés par l'alcool sulfurique, qui dissout seulement l'urobiline ; on filtre, puis on agite le liquidé filtré

“UROBILINE | HAT

avec du chloroforme, après addition d’une grande quanté d'eau. Le chloroforme s'empare de l’urobiline pure, qu'il abandonne ensuite par évaporation.

D) Procédé de Méhu. — Le procédé de Méhu consiste : à aciduler l’urine avec un à deux grammes d'acide sulfurique par litre, puis à saturer cette urine par le sulfate d'ammoniaque. Il se forme ainsi des flocons bruns ; on filtre et on lave le précipité sur le filtre avec de l’eau acidulée et saturée de sulfate d’'ammoniaque. Le résidu est pressé, puis repris à chaud par l’alcool absolu additionné de quelques gouttes d'ammoniaque; l’'évaporation de l’alvool abandonne l’urobiline.

E) Procédé Hoppe-Seyler. — On acidifie l’urine avec de l'acide sufurique ou acétique et on la sature ensuite de sulfate d'ammoniaque, L’urobiline se précipite au bout de quelques heures en flocons roses qu’on recueille sur un filtre. On lave avec une solution saturée de parties égales de chloroforme et d'alcool. Le mélange est traité plusieurs fois de suite par de l’eau dans un entonnoir à robinet. Enfin dans un becherglass; on évapore le chloroforme au bain-marie, Le résidu desséché est extrait avec de l’éther. On filtre la solution éthérée d’urobiline, on laisse évaporer, on traite à nouveau par l’alcaol et on obtient définitivement une urobiline sensiblement pure,

2° Propriétés générales.

L'urobiline obtenue par ces divers procédés est un corps plus ou moins impur, amorphe, résinoïde, de coloration .brun-rouge, Jamais jusqu'à ce jour on n'a pu obtenir de l’urobiline cristallisée.

Solubilité. — L'urobiline est soluble dans l'alcool éthy- lique, moins dans l’éther sulfurique. A notre avis son meilleur dissolvant est l'alcool amylique. Elle est égale-

ment très soluble dans l’éther acétique et dans le chloroforme et surtout dans le chloroforme thymolé. Elle est peu soluble dans l’eau, mais s’y dissout facilement après addition d’alcalis ou même d'acides.

Insolubilité. — L'urobiline est complètement insoluble dans l’eau additionnée de sulfate d'ammoniaque, d’acétate de plomb, etc., surtout en milieu acide.

Pouvoir tinctorial. — La couleur des solutions varie avec la nature du dissolvant. Les solutions chloroformiques sont rouges ou roses; les solutions aqueuses sont jaunes; les solutions dans l’alcool amylique sont jaune ambré.

Diffusibilité. — L'urobiline est très diffusible. Elle l’est beaucoup plus que les pigments biliaires, mais moins que son chromogène (Hayem.). Achard et Monfaux indiquent l’ordre de diffusibilité suivant : 1° chromogène; 2° indican; 3° urobiline; 4° pigments biliaires. Meillère arrive aux mêmes conclusions.

Le sulfate de cuivre et la lessive de soude donnent avec l’urobiline une coloration que l’on pourrait confondre avec la réaction du biuret.

Réactions spectrales. — Les réactions spectrales de lurobiline sont ainsi définies par le P° Hayem.

« L’urobiline, en solution acide, présente une bande à l’union du bleu et du vert. Dans un spectre dont la raie D correspond au n° 100 de l’échelle micrométrique, la bande d’urobiline se trouve à peu près à cheval sur 140 — limite gauche du bleu. — Elle s’étend, à gauche et à droite de cette ligne, de 135 à 148, formant une bande d’absorption large et nette dont le maximum est situé entre 138 et 146, soit entre 500 et 485 longueurs d'onde,

Lorsque la solution a été traitée par l’ammoniaque et le chlorure de zinc, la bande se trouve reportée vers la

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gauche. Elle s'étend des divisions 128 à 137... etc., en s’entourant d’une ombre qui peut atteindre d’un côté 135 et de l’autre 140; le maximum d’absorption correspond à 130, 135, soit à 518, 505, longueur d’onde ». (Hayem).

Réaction fluorescente en présence des sels de zinc. — Caractéristique de l’urobiline, elle a servi à la définir; nous y reviendrons ultérieurement.

2° Chromogène de l'urobiline.

Le chromogène de l’urobiline est un corps moins oxydé que l’urobiline. Signalé dès ses premiers travaux par Jaffé, il fut bien étudié par Disqué, qui le dénomme encore leuco-urobiline.

Extraction. — On le retire de lurine par le procédé de Winter. L'urine est filtrée fpuis saturée à froid par le sulfate d’ammoniaque. On filtre, on dessèche le filtrat et on le lave sur le filtre avec de l’éther pur qui dissout l’urobiline et son chromogène. La liqueur éthérée est agitée avec de l’eau distillée alcalinisée, qui dissout le chromogéne ; celui-ci reste en solution éthérée. On l’obtient alors par évaporation dans le vide.

Propriétés générales. — Il se présente sous forme d’un produit résinoïde, jaune ambré.

Ses solutions ne donnent pas au spectroscope la bande d'absorption caractéristique de l’urobiline.

Par oxydation — eau iodo-iodurée; teinture d’iode, acide chlorhydrique, etc., — il se transforme facilement en urobiline. L'action de l'air et de la lumière suffit du reste, à oxyder le chromogène et c’est la raison pour laquelle on voit se colorer peu à peu, à l’air, des urines pâles à l’émission. (Saillet).

3° Principaux procédés de recherche de l'urobiline et de son chromogène.

A). — Recherche de l’urobiline.

Procédé de M. Grimbert. — On défèque l'urine avec le réactif de Denigès au sulfate acide de mercure. Pour cela on prend 30 centimètres cubes d'urine et 20 centimètres cubes du réactif de Denigès, on agite et on filtre. On ajoute au filtrat 4 centimètres cubes de chloroforme et après agitation et repos, on décante le chloroforme, que l'on filtre sur un petit tampon d'ouate hydrophile. Le chloroforme ainsi séparé et parfaitement clair est additionné de réactif de Roman-Delluc (acétate de zinc 1 gramme; alcool à 95° 1000 grammes ; acide acétique, X gouttes). Il se forme tout d’abord un précipité qui se dissout bientôt dans un excès de réactif; on obtient alors une belle fluorescence verte, si l’urine examinée contient de l’urobiline.

Ce procédé a un inconvénient, c'est que la défécation préalable au sulfate acide de mercure précipite, non seulement les substances gênantes pour la recherche, autres que l’urobiline, mais aussi lurobiline elle-même, du moins en partie. Dès lors, il faudra que l'urine contienne unenotable proportion d’urobiline pour qu’on puisse espérer obtenir la fluorescence caractéristique par ce procédé.

B). Procédé de M. Auché. — On prend 15 à 20 centimètres d'urines; on y ajoute 2 à 3 centimètres cubes d'une solution de chloroforme thymolé à 15 p. 0/0 après s’être assuré de la réaction des urines; celles-ci doivent étre très légèrement, mais très franchément acides. On agite et on décante après repos l'urine surnageante. On traite la

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solution qui reste au fond du tube par quelques gouttes d'alcool fort, puis on ajoute une quantité suffisante de réactif de Roman-Delluc et la fluorescence apparaît.

C). Procédé de MM. Gilbert et Herscher. — On opère sur 60 centimètres cubes d'urine filtrée et 20 centimètres cubes d’alcool amylique que l’on place dans un verre dit à expériences. Au moyen d’un agitateur, on mélange les deux liquides, en ayant soin de ne pas émulsionner l'alcool amylique; il suffit pour cela d’agiter en frottant l’agitateur sur les parois du verre. On laisse ensuite le mélange au repos pendant 5 minutes; l'alcool amylique, teinté en jaune rougeûtre si l'urine renferme de l’urobiline, vient à la surface et se sépare nettement de lurine. On le décante à l’aide d'une pipette de verre dans un tube à essai et on y ajoute 3 ou 4 gouttes de chlorure de zinc ammoniacal à 5 p. 0/0. Si l’urine contient de l’urobiline, on obtient une magnifique fluorescence verte.

On peut compléter tous ses procédés par la recherche de l’urobiline au spectroscope.

B). Recherche du chromogène de l'urobiline.

Procédé de M. Grimbert. — On oxyde préalablement ce chromogène avec deux gouttes de liqueur de Gram et on opère ensuite comme pour la recherche de lurobiline.

B). Procédé de MM. Gilbert et Herscher. — On met dans un tube à essai environ 2/3 d'urine filtrée pour 1/3 de chloroforme ; on agite le mélange par renversement en bouchant la partie supérieure du tube avec le pouce; l'agitation doit être faite modérément pour éviter l’émulsion du chloroforme; on laisse en repos pendant cinq minutes. Ensuite au moyen d’une pipette, on aspire la partie inférieure du liquide, c’est-à-dire la partie chloroformique; on la filtre sur un tampou de ouate hydrophile. On

a donc une liqueur chloroformique limpide, renfermant le chromogène de l’urobiline contenu dans l'urine : à cette liqueur on ajoute une ou deux gouttes d'acide nitrique; s’il y a du chromogène, le chloroforme se colore en rose: la coloration passe ensuite au brun, s’il y en a en abondance.

C). Recherche simultanée de l'urobiline et de son chromogène.

Procédé de MM. Gilbert et Herscher. — On peut rechercher l’urobiline et le chromogène dans la même opération ; pour cela on transforme le chromogène en urobiline en l’oxydant par quelques gouttes de liqueur de Gram et l’on opère ensuite comme il a été dit précédemment, avec 60 centimètres cubes d'urine et 20 centimètres cubes d’alcool amylique. On décante l’alcool amylique avec précaution et on ajoute le réactif ammoniaco-zincique : on obtient ainsi la fluorescence caractérisque.

2 Stercobiline.

En 1871, van Lair et Masius appelèrent stercobiline un pigment qu'ils avaient extrait des matières fécales.

Van Lair et Masius remarquèrent que la stercobiline avait le même spectre que l’urobiline : une bande d'absorption entre le vertet le bleu. De plus elle présentait d’autres bandes plus petites dans l'orange et elle obscurcissait les deux extrémités du spectre. Le pigment donnait en outre, comme l'urobiline, la réaction de fluorescence avec le chlorure de zinc ammoniacal. On rapprocha donc ce corps de l’urobiline ou hydrobilirubine.

Mais Mac Munn avait déjà trouvé dans l'urine des fébricitants, un pigment présentant en plus du spectre de

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l’urobiline, deux bandes dans l'orange; et il en avait fait la caractéristique de l’urobiline fébrile. C’est à ce corps que la stercobiline fut identifiée.

Cependant Beck attribue à des impuretés, tout ce qui dans le spectre n’appartientpas à la stercobiline,etilmontre que dans les fèces, à côté de la stercobiline, on trouve un pigment, donnant naissance aux bandes dans l'orange.

Ces conclusions sont adoptées par Jarrod et Hopkins, Kiener et Engel, Hayem, Schmidt et Strassburger, Supine, Giovanni Marini et enfin Steensma. La question semble donc résolue à l'étranger : l’urobiline existe normalement dans les fèces et prend alors le nom de stercobiline; elle est due à la réduction de la bilirubine que le foie déverse dans l'intestin.

En France, en 1905, Roux et Riva étudient la stercobiline, suivant la réaction de Schmidtet ils trouvent que, normalement, elle existe toujours dans les fèces.

Chauffard et Rendu, en 1907, arrivent à des conclusions bien différentes. En effet « la présence d’urobiline dans les fèces leur apparaît, comme un signe très délicat et très sensible des troubles fonctionnels ou des lésions plus ou moins prononcées de la cellule hépatique, et, plus l’urobiline fécale sera abondante, plus on sera en droit de sup: poser une adultération profonde de la glande biliaire. »

Peu après Gilbert et Herscher, dans une série de communications à la Société de Biologie, montrent que la stercobiline fécale est le produit de la transformation par un intestin normal des pigments biliaires normaux, et ils rapprochent ce fait de la transformation en urobiline dans le rein des pigments normaux,contenus dans le sang dans le cas de cholémie.

Récemment Lemaire, dans une revue générale sur la

DESCOMPS 2

stercobiline, Triboulet, à propos de l'étude des pigments biliaires chez les nourrissons, Mongès, de Marseille, dans sa thèse sur la Coprologie se rallient à la théorie de Gilbert et Herscher, pour qui l’urobiline fécale ou stercobiline est le pigment normal des fèces, dù à la transformation par un intestin normal de la bilirubine.

1° Principaux procédés d'extraction de la stercobiline.

À) Procédé de van Lair et Masius — Les auteurs l’obtiennent en traitant les fèces par de l’alcool additionné d’acide sulfurique dans la proportion de 17 grammes d’alcool pour 3 grammes d’acide. Ils agitentensuite l'extrait ainsi obtenu avec du chloroforme. Ce chloroforme laisse déposer par évaporation la matière colorante que l’on n’a plus qu'à recueillir.

B) Méthode d'Auché. — « On introduit dans un flacon d’un litre, à large ouverture, 200 à 300 grammes de matières normales, fraiches et neutres. On ajoute immédiatement 500 centimètres cubes de chloroforme et on agite violemment pendant quelques minutes. On traite ensuite par un litre de ligroïne, employéen plusieurs fois ; le chloroforme chargé de chromogène passe dans la ligroïne. Tous les liquides séparés sont filtrés et recus dans une large cuvette en porcelaine, où ils sont abandonnés à l’évaporation spontanée pendant laquelle le ckromogène se transforme en urobiline. Le résidu est repris par 100 à 200 centimètres cubes de ligroïne ; celle-ci dissout diverses impuretés, grâce auxquelles elle retient une assez grande quantité d’urobiline (absolument insoluble dans la ligroïne pure); mais la plus grande partie du pigment est précipitée en grumeaux résineux qu'il faut séparer par filtration etréduire en poudre, afin qu’ils subissent, dans

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de bonnes conditions, l’action des traitements ultérieurs, Cette poudre est reversée dans la ligroïne filtrée ; on place le tout dans un flacon d’un litre, on ajoute 500 centimètres cubes d’eau distillée, et on agite fortement, Par le repos, l’eau se sépare, colorée en jaune foncé par une grande quantité d'urobiline, dissoute à la faveur d’impuretés entrainées en même temps. La ligroïne retient les graisses, des pigments tels que la chlorophylle, et autres impuretés; on siphonne l’eau qu’on reçoit sur un filtre mouillé, dans un flacon de 2 à 3 litres; on la remplace par de l’eau pure, et on recommence tant que celleci se colore et présente, sous une faible épaisseur, une forte bande d’urobiline La totalité des liquides aqueux est additionnée d’un gramme d’acétate de zinc dissous dans 10 à 20 centimètres cubes d’eau et agitée. On ajoute juste assez d’'ammoniaque pour précipiter tout le zinc à l’état d’hydrate (XX gouttes). Il se forme immédiatement un précipité floconneux semblable à du sulfure d’antimoine ; toute l’urobiline est fixée ; on jette sur un filtre sans pli et l’eau passe incolore. On lave le précipité successivement: à l'alcool, à l’éther, à la ligroïne et au chloroforme; puis on le dissout, sur le filtre même, dans 20 à 25 centimètres cubes d'alcool additionnés d’une faible quantité d'acide chlorhydrique. Le liquide, rouge foncé, limpide, est additionné d’un volume double de chloroforme et d’un volume égal d’eau distillée, dans une boule à robinet. Le chloroforme s'empare de l’urobiline, on le sépare, le lave par agitation modérée, avec son volume d’eau. Le chloroforme séparé est maintenant un peu trouble ; on le filtre sur un gros tampon de coton hydrophile qui retient l’eau ; il passe limpide, est reçu dans une petite cuvette et abandonné à l’évaporation spontanée. Le produit obtenu est souvent

impur, on lereprend par quelques centimètres cubes d’un mélange de chloroforme et d’éther (ce dernier pour atténuer le pouuoir dissolvant du chloroforme) et on ajoute 200 centimètres cubes d'éther de pétrole, qui précipite l’urobiline en poudre impalpabie, laquelle met plusieurs jours à se déposer. Aussi vaut-il mieux filtrer sur un tout petit filtre, laver avec un peu de ligroïne neuve, redissoudre dans quelques centimètres cubes de chloroforme pur etabandonner à l’évaporation dansun petitcristallisoir. Le produit final doit être brillant, bien sec, se détacher en lamelles fines, qui ne doivent pas s'agglomérer si le produit est convenablement purifié ». (Auché.)

2° Propriétés générales.

La stercobiline se caractérise par les mêmes propriétés essentielles que l’urobiline, puisque stercobiline et urobiline sont un seul et même corps.

Ses deux réactions spécifiques seront donc :

1° Son spectre : une bande d'absorption à l'union du bleu et du vert;

2° Sa fluorescence obtenue en traitant une solution de stercobiline avec quelques gouttes d'un sel de zine.

3° Chromogène de la stercobiline ou stercobilinogène.

Le stercobilinogène estun corps moins oxydé que la stercobiline. Il est à cette dernière ce que l'urobilinogène est à l’urobiline. Il a surtout été étudié en France par Gilbert et Herscher.

Extraction. — On peut l'obtenir par ie procédé d’extraction de la stercobiline de van Lair et Masius,en ayant soin simplement de l’oxyder par l'addition de quelques gouttes de teinture d'iode ou de liqueur iodo-iodurée par exemple, afin de le transformer en stercobiline,

STERCOBILINE 21

L'action de l’air et de la lumière est suffisante du reste, pour opérer cette oxydation. (Gilbert et Herscher).

En règle générale les fèces normales de l'adulte con-. tiennent surtout du stercobilinogène, ainsi que nous avons pu le constater, après MM. Gilbert et Herscher.

4° Principaux procédés de recherche de la stercobiline et de son chromogène dans les fèces.

a) Procédé de Chauffard et Rendu. — On épuise 2 centimètres cubes de matières fécales avec 30 centimètres cubes d’eau : on ajoute 10 centimètres cubes de réactif de Deniges, au bout de 3 minutes on filtre et on ajoute 3 centimètres cubes de chloroforme ; on décante et on caractérise [l'urobiline par la réaction de fluorescence.

b) Procédé de Gilbert et Herscher. — 1° Stercobiline. — Il consiste à traiter 2 à 3 centimètres cubes de matières fécales par 30 centimètres cubes d'alcool amylique : après agitation pendant 2 ou 3 minutes on décante et on filtre l’alcool qui contient l’urobiline. On peut se servir de chloroforme au lieu d’alcool amylique; après décantation il présente s'il contient de la stercobiline une teinte jaune, rose ou rouge.

2° Stercobilinogène. — Pour la recherche du stercobilinogène, on procède de la même façon, mais il faut de plus oxyder le stercobilinogène pourle transformer en stercobiline :sionajoute au mélange d'alcool amylique etde chlorure de zinc, quelques gouttes de liqueur de Gram, la fluorescence se produit alors, quand l'alcool ne contient que du stercobilinogène; elle s’est produite avant l'addition de liqueur de Gram et s’accentue après si elle contient un mélange de stercobilinogène et de stercobiline. Si on se sert de chlorofoi me, onajoute à celui-ci quelques gouttes d’acide

nitriqué nitreux; une teinte rosé ou rouge 8e montre ou s’accentue suivant qu'il n’y à pas ou qu'il y a de la stercobiline associée au stercobilinogène.

c) Procédé de Schmidt. — « On traite dans un récipient de cristal plat la selle délayée, avec une solution aqueuse concentrée de sublimé. On en fait le mélange et on laisse le tout au repos jusqu’au lendemain, » La selle se colore en rouge, si elle contient de la stercobiline, en vert si elle contient dé la bilirubine.

d) Procédé de Triboulet.— Triboulet a repris la méthode de Schmidt en la modifiant. On met gros comme une petite ñoisetté dé matières fraîchement émises, dans un tube à “essai de petit calibre que l’on remplit aux deux tiers d’eau distillée, on bouche et on agite fortément. On verse alors VIII à X gouttes de la solution dé sublimé acétique dont nous parlerons plus loin: les matières tombent au fond du tubé et l'on voit se produire, soit immédiatement, soit plutôt en un quart d'heure où une demi-heure, une coloration du dépôtet du liquide, variant du rose lilas au rose rouge, si les matières contiennent de la stercobiline : on constate én même témps que le liquide de dilution est trouble.