MÉTHODE de Ramon y Cajal

Le procédé du nitrate d'argent est le plus employé'; c'est grâce à lui qu'on a, d'après Cajal, réalisé des découvertes capitales. La méthode au bichlorure n'est ge'ne'ralement utilisée que pour contrôler les résultats. Il y a deux procédés, l'un rapide et l'autre lent. Par le procédé lent, celui de Golgi, le durcissement a lieu dans le liquide de Millier et le bichromate de potasse, sans addition d'acide osmique ; sa durée est de un à deux mois. Par le procédé rapide adopté par Cajal, l'imprégnalion est de deux à six jours et atteint une délicatesse plus grande.

1° Les morceaux [de 4 millim. de côté au plus] sont portés à l'état frais, pour 24, 30 ou 48 heures, dans une solution de :

Bichromate de potasse 3 parties.

Solution d'acide osmique à 1 0/0 25 »

Eau distillée 100 »

Cette solution doit être renouvelée au bout de quelques heures, mais peut servir pour d'autres pièces qui y seront portées en premier lieu. La quantité du liquide est proportionnelle au nombre de pièces immergées, elle doit être environ de 10 ce. pour chaque morceau. Il est indifférent de garder les préparations à la lumière ou à l'obscurité ; la température la plus favorable est de 20 à 25° ; les températures plus basses exigent un séjour prolongé;

2° Les pièces sont lavées rapidement dans l'eau distillée et plongées

dans une solution de nitrate d'argent à 0.23 0/0, pour un quart d'heure ou une demi-heure ;

3° Les porter pour 30 à 48 heures dans une solution de nitrate d'argent à 0.75 0/0. [On laisse les pièces s'imprégner d'argent à la lumière et à la température ordinaire ; cependant, au bout de trois à quatre jours, il s'opère à la lumière des réductions dans l'intérieur de la pièce] ;

4° Laver dans l'alcool à 40° ;

3° Déshydrater rapidement dans l'alcool absolu ;

G° Couper les pièces à la main après les avoir montées entre des morceaux de moelle de sureau, etc. L'inclusion à la paraffine et à la celloïdine doit être évitée, et l'on ne recouvre pas les préparations d'une lamelle (car ainsi elles s'altèrent très rapidement, à cause des courants de diffusion qui enlèvent le dépôt de chromate d'argent aux: éléments qui en sont imprégnés). Au bout de deux ou trois ans, le fond des coupes prend une teinte très foncée, et le chromate d'argent se diffuse plus ou moins autour des éléments imprégnés.

Pour faire les coupes, Cajal procède comme suit.

Il déshydrate la surface de la pièce en la plon^^eant dans l'alcool à Oo» pendant une à deux minutes, puis l'essuie avec du papier buvard, et la place sur un morceau prismatique de paraffine dure. Alors, avec la pointe d'un scalpel ou une aiguille chauffée à la ilammo, on fait fondre vivement la paraffine tout autour de la partie inférieure de la pièce, afin d'inclure cette partie et de la fixer solidement au bloc de paraffine. On comprend qu'il faille exécuter très rapidement cette petite manœuvre, afin d'éviter le dessèchement de la pièce. La partie restée visible du morceau de tissu nerveux est aussitôt trempée dans l'alcool à 9o" et le tout est porté sur le microtome. On fait des coupes en mouillant le rasoir d'abord à 95°. Mais, pour faire des coupes, « qui doivent être assez épaisses afin de permettre de suivre les éléments dans leur plus grand trajet possible, on monte les pièces soit entre deux morceaux de moelle de sureau décortiquée, soit dans un morceau de liège, après les avoir enrobées superficiellement de celloidine ou de paraffine, et on place le tout dans un microtome à vis ».

On passe ensuite les coupes dans cinq ou six bains d'alcool à 90° pendant moins d'une heure, puis dans un bain d'essence de girolle d'une durée d'une demiheure au plus. On procède au montage dès qu'elles sont éclaircies et transparentes : ou les place sur une lame porte-objet, on enlève l'excès de giroOe à l'aide de papier buvard, et l'on verse sur les coupes quelques gouttes de xylol. Après avoir fait égoutter le xylol, on couvre les coupes d'une solution peu épaisse de gomme d'Ammar dans le xylol, on laisse sécher à l'abri de la poussière ; au bout de une à deux heures, quand la première couche de résine est presque sèche, on la couvre d'une seconde, puis d'une troisième, et ainsi jusqu'à ce que la surface des coupes, complètement couverte de résine d'Ammar, soit tout à fait lisse. Les préparations sont conservées à l'abri de la lumière et de la poussière*

EXAMKN DliS TISSUS ET DES ORGANES

En résume, voici les conditions pour la bonne conservation des coupes : 1° Coupes pas trop grosses ;

2«* Lavage complet dans Talcool pour enlever toute trace de nitrate d'argent; 3° Dessiccation absolue des coupes sous une couche assez mince de baume d'Ammar;

4° Montage à découvert et conservation dans l'obscurité.

Cette méthode ne donne de résultats constants et démonstratifs dans les organes nerveux qu'à la période voisine de celle de l'apparition delà myéline.

Tous les organes nerveux ne s'imprègnent pas avec une facilité égale par le procédé rapide de Golgi. On sait que le durcissement a été insuffisant quand les coupes montrent un fond rouge uniforme avec des cellules et des fibres imprégnées incomplètement ; on reconnaît que le durcissement a été poussé trop loin quand le fond apparaît jaune clair et qu'on ne voit s'en détacher en noir aucun éle'ment ou seulement quelques fibres nerveuses. On reconnaît aussi que la pièce a été légèrement surdurcie, à l'absence presque complète de cellules colorées et à la coloration presque exclusive des fibres nerveuses. On corrige cet accident en recourant à une seconde imprégnation. On appliquera de même la double et même la triple imprégnation aux organes difficiles à colorer (ganglions sympathiques, ganglions intestinaux). Carie chromate d'argent n'imprègne à la fois qu'un petit nombre de fibres et de cellules ; et il arrive souvent que les cellules qui résistaient à l'imprégnation, malgré plusieurs mois d'essais persévérants, apparaissent à un moment donné colorées d'une façon merveilleuse. Aussi faut-il répéter les préparations (t).

En résumé, la méthode de Cajal [de même que celle de Golgi], bien qu'ayant de la valeur, ne réussit pas toujours. En outre, elle ne colore jamais toutes les parties d'une préparation d'une façon régulière et uniformément rapide. Les cellules nerveuses avec leurs expansions, et toutes les fibres nerveuses qui ne sont pas entourées d'une gaine de myéline, deviennent noir intense ; les cellules de la névroglie et leurs prolongements deviennent noir rougeâtre.