III. —-- Technique des dosages

A) Extraction des lipides totaux

L’extraction des lipides totaux se fait dans un micro Kumagawa, 24 heures environ après le prélèvement.

Dans le ballon de l'appareil on met 50 cmÿ d'alcool à 95° et dans l’extracteur avant d'introduire la cartouche en cellulose dégraissée on place un tube de verre de 3 mm de diamètre extérieur et de 5 mm. delongueur, cette précaution assure un bon siphonnage car l’on évite ainsi que la cartouche vienne obturerle siphon en adhérant à la partie inférieure de l’extracteur.

L'alcool qui a servi à fixer le prélèvement de foie est filtré sur la cartouche DuRiEUx pour micro-analyse(le filtrat est mis de côté). On broie ensuite les fragments de glande hépatique dans un petit mortier en Pyrex et la purée obtenue est introduite dans la cartouche. Le mortier est lavé trois fois avec deux centimètres cubes d'alcool ; les alcools de lavage sont filtrés comme précédemment mais recueillis dans le ballon du Kumagawa qui contient déjà 50 cm d'alcool.

Ces opérations étant terminées on commence l'extraction quise poursuivra pendant huit heures, à une température de 80° au bain de sable électrique. On réunit ensuite dans un ballon à extraction de 150 cm, l'alcool contenu dans le ballon du Kumagawa, et l'alcool qui a srrvi à fixer le prélèvement des fragments hépatiques ; puis on évapore à sec sous Île vide au bain-marie bouillant. Le résidu de l'évaporation est repris par du benzène anhydre séché sur sodium ; on chauffe pendant dix minules au bain-rarie en munissant le col du ballor d’un réfrigérant à reflux, et trois extractions sont ainsi faites. Les extraits benzéniques réunis dans un tube à centrifugeuse et centrifugés sont rassemblés dans un cristallisoir et évaporés dans une étuve électrique réglée à 50°. On obtient par pesée les lipides totaux qui sont mis quantitativement en solution chloroformique, et conservés à l'abri de la lumière solaire.

Lea

Dans le ballon à extraction et dans le tube à centrifugeuse

il reste une partie qui estinsoluble dans le benzène mais solu- , Q Là . , ,

ble dans l’eau, cette solution aqueuse est réunie, évaporée et

le résidu est pesé.

Le tissu dégraissé contenu dans la cartouche est ensuite séché jusqu'à poids constant dans une étuve à 100, et son poids est alors déterminé.

Cette manière de procéder nous permet de déterminer la

teneur en eau pour cent de poids frais et pour cent de poids sec dégraissé.

B) Dosage dans la solution chloroformique

des divers constituants des lipides :

1°) Phosphore lipidique. — Dans un ballon de Kjeldahl de 30 cm° environ de capacité on introduit 10 em de solution chloroformique contenant environ 10 mg de lipides totaux et on chasse le solvant par évaporation au bain marie. Au résidu on ajoute 1 cm? d'acide sulfurique concentré (60° B° pur Poulenc). Le mélange est chauffé d’abord doucement puis fortement sans atteindre la température de décomposition del’acide sulfurique. Après une dizaine de minutes on laisse refroidir et on introduit dans le matras de l'acide nitrique fumant par petites portions en chauffant chaque fois pour éliminer les vapeurs rutilantes. Le liquide s’éclaircit jusqu’à décoloration complète, ou simple persistance d’une très faible coloration jaune paille. On ajoute alors 6 cm* d'eau distillée et 2,5 cm* d'une solution saturée de nitrate d'ammonium, ce mélange est porté au bain marie bouillant pendant un quart d'heure, puis on précipite l'acide phosphorique formé par 6 cm* d'une solution de molybdate d’ammonium à 5 pour 100 tout en continuant à chauffer pendant un quart d'heure.

Le précipité de phosphomolybdate obtenu estséparé immédiatement de ses eaux mères par filtration sur microliltre en verre aggloméré (15 a G4). Le précipité ainsi obtenu est iavé

Mt

cinq fois avec de l'alcool à 50° par aspiration à la trompe à eau.

On dissout ensuite le précipité dans 3 em d'ammoniaque diluée au quart, on transvase la solution quantitativement dans une fiole d'Erlenmeyer de 250 cm et après avoir ajouté 23 cm de soude 0,04 N ou porte à l'ébullition pendant vingt minutes. Dans le liquide alcalin vérifié exempt d'ammoniaque on ajoute 25 cm® d’acide sulfurique 0,04 N et après une ébullition de deux à trois minutes, l'excès d'acide est dosé au moyen de la solution de soude 0,04 N. Le nombre de centimètres cubes trouvé multiplié par 0,044 donne en milligrammes la teneur en phosphore de la prise d'essai. Le phosphore ainsi déterminé permet de calculer les phospholipides contenus dans les lipides totaux (coefficient employé : 25).

Cette méthode qui n'est en somme que le micro Neumann appliqué au dosage du phosphore organique, a été étudiée et préconisée par Mme SôkENSEN, modifiée ensuite par M. MacHE- BŒUF (53) et enfin par M. FLATTER (23).

2°) Azote lipidique : Une portion identique de solution chloroformique (dix cm) évaporée de la même manière que pour le dosage du phosphore lipidique permet la détermination de l'azote lipidique par micro-Kjeldhal avec appareil de Parnas et Wagner.

La destruction de la matière organique a été faite par l'acide sulfurique concentré et bouillant en présence de 0,100g. environ d’un mélange de sélénite de cuivre et de sulfate de potassium agissant comme catalyseur. (1 g. de sélénite de cuivre, 24 g. de sulfate de potassium.)

3°) Cholestérol : Ne pouvant être dosé par la méthode pondérale au digitinoside, vue la minime quantité de ce composé dans la p'ise d'essai, le cholestérol a été estimé colorimétriquement par la méthode de GRiGAUT sur une nouvelle portion de solution chloroformique.

4) Détermination de l'Indice d'Iode : Nous avons utilisé la méthode de RosENMuND et KUHNEHXN (54) (microtechnique

de Yasupa) (73): Une quantité de solution chloroformique correspondant approximativement à cinq milligrammes de lipides totaux est introduite dans une fiole cônique ; celle-ci étant plongée dans de la glace, on ajoute 2 cm® de dibromopyridine (ce prélèvement doit être effectué à l’aide d’une pipelte de précision). La solution de dibromopyridine étant ajoutée, la fiole est retirée de la glace et abandonnée pendant 15 minutes à la température du laboratoire ; on ajoute ensuite 0,5 cm° d'une solution d’iodure de potassium à 10 pour cent, l'iode libéré est titré au moyen d’une solution de thiosulfate 0,02 N (soit n cm la quantité de solution titrée de thiosulfate employée). Un dosage témoin menéparallèlement avecla même quantité de dibromopyridine donne N cm*.

Calcul : L'indice d'iode est donné par la formule :

p — lipides totaux contenus dans la prise d'essai exprimés en milligrammes.

Préparation de la solution de dibromopyridine :

— On prépare les deux solutions ‘suivantes :

A1 Pyridine"purifiée,;2.,. 4030... 16 g. (16,5 cm“) | "Acide acétique glacial... …..-,..:. 40 cmÿ.

B | Acide sulfurique concentré pur..... 20 g. (10,9 cm?) iSeidesacétiques glacial... 7% 40 cm.

On mélange les deux solutions en versant la solution B dans la solution À plongée dans de la glace et quand la combinaison est faite on ajoute le mélange :

DIRE ee ambre tie. voue @Y 16 g. (5 cm) | Acide acétique glacial.............. 40 cm).

En portant à quatre litres avec de l'acide acétique glacial on a une solution sensiblement 0,05 N que l'on titre au

monient de l'emploi.

NT

La détermination de l'indice d’iade doit s'effectuer dès que les lipides totaux ont été mis en solution chloroformique, ou le plus tôt possible sur cette solution conservée à l'abri de la lumière solaire. Avec P. Crisroz (16) nous avons montré que si l’on expose à la lumière solaire une solution chloroformique de lipides totaux l'indice d'iode diminue graduellement; au contraire celui-ci reste constant si la solution est gardée dans l'obscurité. Une modification semblable paraît s’observer sur les acides totaux et sur les acides gras phosphatidiques. (Voir tableau N° IT)

À la fin de quelques expériences, au moment de la mort de l’animal, nous avons prélevé le foie : cet organe, après avoir été broyé avec une machine à hacher, est conservé dans 2,5 fois son poids d'alcool à 95°. Sur les lipides extraits de cette purée hépatique, à l’aide des techniques déjà décrites, le taux des constituants suivants est déterininé :

1° L’Insaponifiable et les acides gras totaux,

2° Les phospholipides et les acides gras phosphatidiques,

3° Le phosphore lipidique,

4° Le cholestérol libre.

Sur l'insaponifiable on dose le cholestérol total , on peut ainsi calculer l'insaponifiable X et le cholestérol estérifié.

Insaponifiable X — Insaponifiable total — cholestérol tolal.

Cholestérol estérifié — cholestérol total — cholestérol libre.

Sur les acides gras totaux et phosphatidiques l'indice d'iode a été déterminé.

Nous ne décrirons pas ‘toutes les techniques employées mais nous insisterons seulement sur le dosage de l’insaponifiable et sur l'extraction et la purification des phospholipides.

a) Saponification : On saponifie un gramme de lipides totaux en le chauffant sous condensateur à reflux pendant deux heures avec 25 cm° de potasse alcoolique deux fois ror-