PRINCIPE ET TECHNIQUE DE LA PURIFICATION ET DE LA CONCENTRATION

Après centrifugation et filtration sur bougie, le lysat clair et stérile est traité par CaCL, à 4 p. 100 en quantité strictement nécessaire pour ne pas dépasser pH 6,4 et conserver ainsi la totalité des phages dans le liquide surnageant. Ce premier traitement permet de se débarrasser de la majeure partie des protéines d’origine microbienne contenues dans le Iysat, comme R. WanL et ses collaborateurs [25] lont montré. Nous verrons dans un prochain chapitre que l’endotoxine de Boïvin [2, 3 et 4] n’est pas éliminée par le traitement par CaCl,. Ceci peut s'expliquer quand on sait

NO

que cette endotoxine est de constitution surtout glucidolipidique. I1 est probable que le phosphate de calcium adsorbe sélectivement les protéines. Au-dessous de pH 6,4, on adsorbe le phage qui, lui, est de constitution surtout nucléo-protéidique, et cette adsorption est d'autant plus importante que le pH est plus bas.

En utilisant une technique mise au point sur ce principe, nous voyons que nous pouvons, avec péu de manipulations, pousser la purification du phage assez loin. Dans un premier temps, nous éliminons la plus grande partie des protéines et, dans un second temps, nous adsorbons la majeure partie des phages. Il ne nous reste plus, ensuite, qu’à éluer les phages du précipité qui les contient pour avoir un phage assez bien purifié; en utilisant un volume d’éluant inférieur au volume initial de lysat, on peut même avoir une concentration appréciable.

Nous avons seulement pu faire quelques essais basés sur ce principe, dont nous allons donner les résultats. Les expériences ont été faites sur un lysat de D 4/IT titrant 1,2 X 10° phages par em. Ce lysat a un pH initial de 7 après centrifugation et filtration sur bougie L 3; on pratique une première précipitation jusqu’à pH 6,4; après centrifugation, le titre est toujours de 1,2 X 10° par em*'. Une deuxième précipitation est alors effectuée avec une solution de CaCL, à 4 p. 100 jusqu’à pH 5,9; après centrifugation, le titre, dans le surnageant, est de 1,5 X 107, ce liquide est décanté et, sur le culot de centrifugation, nous avons fait plusieurs essais d’élution par remise en suspension du précipité. Nous avons essayé plusieurs éluants, soit sous le même volume que celui du lysat, soit en essayant de concentrer. Nous allons donner nos résultats :

1° En reprenant par un volume d’éluant égal au volume initial de lysat.

Solution CINa à 1 p. 100, titre ...... 4 X 10° par cm° = OCIK à%T p.100, Hire HA AD ONE

Solution SO,Mg à 1 p. 100, titre .... 3,5 X 10° par cm — CO;Na; à 1 p. 100, titre .... 1,5 X 105

-— de phosphates tamponnée à DEP A 20 D 100 titre. 275 KX 108 —

2% En reprenant par un volume d’éluant dix fois moindre que le volume initial de lysat.

Solution de CO,Na, à 1 p. 100, titre. 1,5 X 10° par cmt RU OEN dE ta S p'100tutre 1245010" 0" tampon de phosphates à

AR AU0 (Di titres du LS IO RE va - tampon de phosphates à PU DA LOUENTITErA AE UN EAU E OR MORE

Nous constatons que l’élution se fait en fonction du pH et paraît d'autant meilleure que la solution saline est plus concentrée. Les solutions diluées, tamponnées à un pH alcalin ne sont peut-être pas assez riches pour neutraliser le précipité qui est acide. Il aurait fallu, pour le savoir, étudier le pH des phages élués. Nous pensons, cependant, que la méthode donne des résultats suffisamment intéressants pour être approfondie. On a constaté que l’adsorption est assez sélective pour laisser dans le liquide surnageant, outre les sels, la toxine de BorviN. Aussi, l’éluat en est-il débarrassé.

Si les phages ne peuvent être élués que par une solution concentrée en sels, il faudrait envisager de compléter la purification par une dialyse.

(1) Dans un travail récent, on a constaté qu’on pouvait descendre jusqu’à pH 5,4 pour l’adsorption, et la concentration à 5 p. 100 a été reconnue comme la plus satisfaisante pour l’élution [34].