CHAPITRE II

Evolution des cultures en milieu liquide en présence de phages

Nous avons effectué cette étude successivement avec les phages D 4/2 et T5/0 qui sont, comme nous l’avons vu dans les chapitres précédents, très différents par la plupart de leurs caractères. Les phages sont utilisés comme dans le reste de notre travail, après précipitation de phosphate de calcium et filtration en milieu alcalin (1). La technique expérimentale est la suivante : deux tubes de 10 cm d’eau peptonée sont ensemencés avec la même quantité de germes, l’un reçoit, en plus, une certaine quantité de Iysat. Les tubes sont placés à l’étuve à 37°, et l’on fait, à intervalles réguliers, des numérations de germes. Pour le témoin, on étale un volume déterminé (1/10° de em) du contenu du tube correspondant ou d'une dilution appropriée de ce contenu.

Le nombre de germes est calculé d’après le nombre de colonies.

Pour le tube ayant reçu du phage, on utilise la même technique, mais l’on fait deux étalements chaque fois; dans l’un, on étale en même temps II gouttes de Iysat non dilué; dans lPautre, IT gouttes de sérum antiphage spécifique. Le nombre des colonies du premier indique le nombre de germes résistants présents dans le milieu; la différence entre les deux étalements indique en principe le nombre de

(4) Voir page 20.

ane

Prof

germes sensibles présents au même moment. (Nous verrons plus loin qu'un correctif peut être apporté à cette notion de germes sensibles.)

Toutes les expériences ont été faites avec la même souche (souche IT) et les deux phages D 4/2 et T 5/0. Nous avons pensé, d’après les résultats donnés dans le chapitre précédent, que la dilution des Lysats devait jouer un rôle très important dans l’évolution des cultures, et nous avons fait des expériences de deux types : l’une où l’on introduisait 1 em° de lysat de titre élevé dans 10 em° de milieu de culture, l’autre où les quantités de lysat introduites étaient sensiblement moins grandes.

Nous les désignerons, pour abréger, sous le nom d’expériences avec phage éoncentré et avec phage dilué.

1. — EXPÉRIENCES AVEC D 4/2 CONCENTRÉ On introduit 1 cm*° de D 4/2 de titre 1,2 X 10° par cm'.

a) Tubes ensemencés avec 1.000 germes, soit 100 germes

par cm*.

témoin .... | 560 germes par cm° c sensibles .. 110 — -— Après 3 heures.. je résistants .. 0 Miémons 20.000 germes par cm’ ST sensibles .. 140 — — PRES ETES) résistants 0 témoin .... 400.000.000 de germes par cm’ : sensibles .. 0 > FRERE résistants .. 20.000 germes par cm°

b) Tubes ensemencés avec 20.000 germes, soit 2.000 germes

par cm. d témoin .... 16.000 germes par cm° : | sensibles .. 90 — — been Deuter | résistants .. 10 — témoin .... très poussé FE | sensibles 0 DD ARCS 1 résistants .. 50.000 germes par cm

ss TO L

c) Tubes ensemencés avec 200.000 germes, soit 20.000 germes

par Cm. ‘ TéMONIT.2- 140.000 germes par cm° Après 3 heures. sensibles .. 6.000 — résistants .. à 50 — — témoin .... opacité de 200.000.000 par em’ Après 7 heures. À sensibles .. 8.000 germes par cm’ | résistants .. 500 — —

Après 24 heures, la culture qui a reçu le phage est très poussée et ne contient que des résistants.

d) Tubes ensemencés avec 2 millions de germes, soit 200.000 germes par Cm”.

témoin .... opacité de 100.000.000 par cm*

Après 4heures..| sensibles .. 1.500 germes par cm résistants .. SO = Le

Après 7 heures, le tube qui a reçu le phage commence à présenter une pousse visible. Après 24 heures, il n’y a plus que des résistants.

e) Tubes ensemencés avec 100 millions de germes, soit 10 millions par em.

Après 4 heures, la culture témoin paraît moins poussée, plus claire que celle qui a reçu le phage.

PÉRIOID Se 4,5 X 10° germes par cm° Sensibles :...... Dir PO ere ES Résistants. … HR MEN PRET OMERRES La

Après 7 heures, le tube qui a reçu le phage s'est éclaircei, il est plus clair que le témoin, il v avait une Ivse au moins partielle des germes sensibles.

A la suite de ces premiers essais, nous avons pensé qu'il serait intéressant de reprendre ces expériences en effectuant des titrages de germes toutes les heures, et de suivre l’évolution pendant vingt-quatre heures. Nous avons employé le phage D 4/2 titrant 2,1 X 10$ par em“. |

Nous avons, en réalité, dans chaque essai, utilisé deux

LA da

expériences, l’une commencée le matin, l’autre mise en train le soir et observée le lendemain matin. En voici un

exemple :

Essai effectué avec 100.000 germes, soit 10.000 par cm.

EEE

TEMps | SENSIBLES RÉSISTANTS 1 D. 6.920 par cm: 0 PAT 2.660 — 0 4h. ROTSUMAEE N 0 Yh: 24902 0 6h. RO0ÛI 7e ANT sert 4.840 — 0 8 h. FOUR 0 HEAR 20.000 environ 0 RAA 15.000 environ 4.00) 13 D. 5.430 par cm° 0 14h. 72 LA RSR 0 16 h. 320 — 27 par cm° Lé'he 3601 = 70: — 18 b. ) HA UNRES 19540 19 h. de Ad r — 20 h. : 180 — 24 h. 0 : 16.000.000 —

Le titrage des bactéries sensibles étant fait par différence, il devient aléatoire quand le nombre des bactéries résistantes est notable, et celui des bactéries sensibles très petit. Aussi, celui-ci est-il ici indéterminé à partir de dixneuf heures.

La courbe représentative de lexpérience est donnée ci-après.

Dans ces expériences, le phage D 4/2, bien qu’utilisé en grand excès, n’a presque jamais stérilisé complètement une culture de germes sensibles, si faible qu’ait été l’ensemencement.

Nombre de bactéries par cm*.

— Th —

Nous avons vu, par les étalements sur gélose, que la souche II paraît contenir beaucoup de résistants à D 4/2 : 1 p. 100, et on pourrait, à première vue, proposer une explication facile à cette absence de stérilisation. Mais cette explication ne tient pas, puisque nos observations démontrent que les bactéries qui restent « viables » sont en totalité

ou en majorité des bactéries sensibles.

1.000 d Pas / / 100 ae s à fi « : \ / s | / EN X \ mes 10 e 20 Temps en heures.

Légende. -— Evolution d’une culture en présence de phages en grand excès

(coordonnées semi-logarithmiques), les points correspondent aux bactéries sensibles, les croix aux bactéries résistantes.

Si l’on considère l’ensemble des faits observés, on peut dire que l’évolution de ces cultures en présence du phage D 4/2 concentré se fait en plusieurs stades. Il est assez rare qu'un ou plusieurs manquent. Nous reviendrons sur ces exceptions. Nous étudierons d’abord le cas général, celui d’une quantité moyenne de germes, où tous les stades se succèdent au complet.