GROUPE VENINS NÉCESSITANT UN ACTIVATEUR

Enhydrina valakadyen Naja bungarus Bungarus fasciatus Lachesis gramineus Crotalus adamanteus

Au contact du sérum de chien ou d’une quantité équivalente de lécithine, tous les venins du deuxième groupe, sauf celui d’Enhydrina, sont à peu près également hémolytiques ; la dose de o milligr. or dissout complètement, en 1 heure à la température de 37°, 1 cc. d’une dilution à 5 % de globules de chien, lavés dans la solution isotonique de NaCI. Avec le venin d’'Enhydrina, 5 milligr. ne suffisent pas à produire une hémolyse complète dans les mêmes conditions.

Ces faits expliquent les divergences des résultats obtenus par les divers auteurs : Kyes et Sacus constataient une hémolyse complète avec un venin du premier groupe, celui de Naja tripudians, contrairement à FLexner et Nocucur qui opéraient avec des venins du second groupe.

En opérant comme ci-dessus, mais avec o cc. 2 d’une solution saline à 0,1 % de lécithine, Lam démontre que les venins d’Echis carinata, de Bungarus fasciatus et de Bungarus cœruleus sont également activés par la lécithine et par le sérum de chien, mais que la lécithine n’a qu'une faible action activante sur les venins de Naja bungarus, d’'Enhydrina valakadien et de Crotalus adamanteus.

On sait par ailleurs, que ces derniers venins (sauf celui d'Enhydrina) sont aussi, et même plus hémolytiques quand ils sont activés par le sérum

de chien que par la lécithine ; les divers venins n’ont donc pas tous la même affinité pour la lécithine.

D'après Lame, les globules lavés de bœuf et de chèvre sont complètement résistants à tous les venins essayés ; mais ils deviennent hémolysables quand on ajoute de la lécithine aux venins du premier groupe.

Influence de la dose et de l’état du venin ; action empéchante des doses fortes

Weir-Mircnerz, en 1861, observe le premier, la résistance des globules aux solutions concentrées de venin de Crotale. En collaboration avec STEWART (1897), il fixe ensuite les détails du phénomène. Les auteurs constatent que dans un mélange à parties égales de sang et de venin frais, non seulement les globules ne se dissolvent pas, mais qu'ils résistent plus longtemps que les témoins à la dissolution. L’hémolyse ne survient que s’il y a moins de 10 % de venin dans le mélange.

Le venin desséché, puis redissous, est moins protecteur que le venin frais. De tous les globules essayés, ce sont ceux du Crotale lui-même qui sont le mieux protégés contre l’hémolyse par son propre venin.

La même constatation a été faite par Srepnens et Myers (1898) pour le venin de Cobra ; en solution forte de > à 7 milligr. 5 pour r cc. de liquide, il ne produit pas l’hémolyse, alors que o cc. 5 d’une solution qui ne contient que o milligr. 009 dissout en plusieurs heures le sang du cobaye et de l’homme, et en moins d’une heure celui du chien. Myers a vu toutefois que dans les solutions fortes de venin, le sang peut être hémolysé si on ajoute une forte dose de sérum de cheval.

Kyes et Sacus ont constaté d’autre part que le venin de Cobra, à forte dose, n'hémolyse pas les globules lavés de cheval, même en présence de lécithine ou de sérum chauffé. Il semblerait donc que, d’après la théorie d'Enrrion, adoptée par les auteurs, sous l'influence de l’ambocepteur en excès du venin, il se produit une déviation du complément ; ce dernier, au lieu de se fixer sur les globules s’unirait à la fraction d’ambocepteur en excès, demeurée libre dans le liquide.

Dans le même ordre de faits, LamB a aussi constaté (1905), que l’hémolyse diminue quand on emploie des doses massives de venin.

Nocucnr en 1907, a repris l’étude de l’hémolyse par les venins ; il à confirmé l’action protectrice des hautes doses de venin, établi les propriétés des globules fortement envenimés, et recherché le mécanisme de l’action protectrice.

Action protectrice. — Avec les concentrations de venin de Cobra supérieures à 4 %, il ne se produit aucun changement pendant plusieurs semaines dans les suspensions à 5 % de globules de cheval, lavés dans l’eau salée physiologique, tandis que dans un mélange à parties égales de sang défibriné et d’une solution à 2,5 % de venin, l’hémolyse se produit en 1 à 2 heures.

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Nocueni a vu de plus que si l’on soumet les mêmes globules lavés de cheval à des concentrations variées de différents venins, depuis la dose non hémolytique jusqu’à la dose hémolytique optima (cette dernière étant seulement hémolytique au contact d’une quantité convenable d’activateur), quand la concentration du venin est supérieure à 5 %, l’hémolyse est retardée de 12 heures environ à la température de 20°, et ne se produit pas pendant les six premières heures ; si la concentration devient moindre, o,1 %, l’hémolyse se produit, et plus rapidement que dans les tubes témoins qui né sont pas absolument stériles.

Propriétés des globules fortement envenimés. Les globules qui ont séjourné seulement pendant 20 minutes dans une solution concentrée de venin ne sont plus hémolysables par l’eau pure, les solutions salines, la saponine, et la tétanolysine. En même temps leur résistance à la chaleur a diminué.

En effet, alors que dans les tubes témoins les globules seuls sont complètement hémolysés en moins de 3 heures, à la température de 53° et au contact d’une solution de venin ne dépassant pas 1 % en concentration, l’hémolyse est complète en 5 à 15 minutes ; avec une concentration plus faible (o,o1 %), il faut 30 minutes.

Les concentrations de venin inférieures à 2 % rendent au contraire les globules plus sensibles à l’action des solutions salines.

Mécanisme de l’action protectrice. Pour élucider ce mécanisme, Nocucar emploie différents procédés ; il recherche d’abord si la protection a quelque relation avec les ambocepteurs hémolytiques du venin.

A cet effet, les globules lavés de cheval sont mélangés avec des solutions à ro et à 2 % de venin de Cobra, et on laisse l’action se prolonger pendant 2 jours. Puis on introduit dans les mélanges un excès de sérum ou de lécithine ; on constate dès lors qu’il ne se produit aucune hémolyse dans la solution à 10 %, tandis que la dissolution est complète dans la solution à 2 %. Il ne peut être question ici de déviation du complément.

Une autre méthode pour démontrer que les hémolysines ne participent pas à l’action protectrice du venin, consiste à chauffer le venin à 95 et à 100° pendant un temps très court. Le venin qui a été porté à 95° perd son agglutinine à la température de 75° ; il donne un liquide opalin contenant un fin précipité, et conserve ses propriétés protectrice et hémo-

lytique. En séparant par filtration le précipité du liquide, la substance

protectrice reste sur le filtre, tandis que l’hémolysine passe complètement dans le filtrat. Après chauffage à 100° pendant 5 minutes, le venin perd son action protectrice, mais la solution contient la plus grande partie de son principe hémolytique. La température de 135° détruit les deux propriétés. Le filtratum hémolytique du venin chauffé attaque les globules lavés de cheval, même dans des solutions de 10 à 20 % de venin, car la résistance de ces globules à l’action toxique a diminué par l’action de la

chaleur ; Nocucnr pense que l’action attaquante du liquide filtré est due à l’hémolysine.

D'autres faits intéressants sur la protection des globules par le venin et les circonstances dans lesquelles disparaît cette protection ont été mis en lumière par Nocucnr : il a vu que le sérum de Crotale, fortement agglutinant et hémolytique pour les globules de cheval, ne les protège à aucun degré contre l'attaque par les agents physiques ; ces globules, après un contact de 12 heures avec le sérum inactivé de Crotale en excès, sont dissous par une solution saline à 0,45 %.

L'action protectrice disparaît quand les globules sont lavés plusieurs fois dans une solution saline et ainsi débarrassés du venin. De tels globules sont alors moins résistants vis-à-vis des solutions de venin ou de saponine que s’ils avaient d’abord séjourné dans une solution plus faible de venin. Il est à remarquer toutefois que l’action protectrice est étroitement liée à la présence du venin.

Pénétrant plus avant dans l'explication de l’action protectrice du venin, Nocucur constate que la solution aqueuse de globules de cheval forme un très fin précipité avec les solutions concentrées de venin ; le stroma séparé de la solution laquée des globules ne donne pas de précipité appréciable.

Usant alors d’une solution pure d’hémoglobine, il découvre que le venin donne un précipité avec cette solution. Mais dans une solution saline à 0,9 %, le précipité devient plus grossier et plus pauvre ; dans les solutions faibles d’acides et d’alcalis, il se dissout promptement ; bref il se comporte comme celui qui est obtenu avec la solution aqueuse des globules, ce qui peut expliquer pourquoi les acides et les alcalis hémolysent les globules envenimés. tandis que l’eau est sur eux sans action. La globine retirée de l’hémoglobine de cheval est rapidement précipitée par le venin de ses solutions aqueuses, mais non de ses solutions salines.

Un fait intéressant, découvert plus tard, montre que l’hémoglobine seule des globules qui peuvent être protégés par le venin (cheval, rat, lapin), donne un précipité avec le venin ; il ne s’en produit pas avec l’hémoglobine brute ou pure de chien et de cobaye (dont les globules ne sont jamais protégés par les solutions fortes de venin : la protection exercée par le venin se ramènerait donc à la formation dans les globules d'un composé insoluble dans l’eau.

Nocucnr ajoute que si la globuline du sérum de cheval (obtenue par

dialyse) est mise en suspension dans l’eau ou dans une solution saline'

faible, le venin détermine la précipitation rapide des particules en suspension qui mettraient beaucoup de temps à se déposer. Parmi ces globulines, la pseudoglobuline donne avec le venin le précipité le plus abondant.

Ainsi il semble bien établi qu'il existe une limite de la dose de.

venin hémolysante au-dessus de laquelle l’hémolyse décroît au fur et à mesure que la dose de venin croît. Dans les phénomènes d’hémolyse biologique naturelle, il n'y a que les venins qui présentent cette particularité.

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Mais Nrisser et WEcusBERG, en étudiant la bactériolyse avec certains sérums immunisants de grande puissance, ont observé un effet inhibiteur quand un excès d’ambocepteur, par rapport au complément se trouvait dans l’émulsion bactérienne.

Un phénomène analogue a été observé par Derre et SELLEr dans leur étude sur l’hémolyse causée par le bichlorure de mercure. Mapsen et WaL- BUM, d'autre part, ont montré que les acides en excès protègent les globules, tandis qu’à concentration.plus faible, ils les dissolvent.

Influence des sels

Action empêchante des sels à acide fort. — Ce sont les travaux de FLexver et Nocucut (1902) qui ont pour la première fois attiré l'attention sur l'influence des sels dans les phénomènes d’hémolyse et d’agglutination. L'action empêchante du chlorure de sodium découverte par les auteurs a été, comme nous l’avons déjà fait remarquer, le point de départ d’une ère nouvelle dans l'étude de l’hémolyse par les venins.

GoœBEL a confirmé en 1905 l’action empêchante du sel marin, et montré que les globules de mouton lavés, puis mis en suspension dans la solution de ce sel n’agglutinent ni ne se dissolvent jamais dans le venin de Cobra employé seul. Le sel se comporte comme un antiagglutinant et un antihémolytique, capable d’entraver l’action du venin.

Nocucur (1907), a constaté que l’action du chlorure de calcium sur l’hémolyse est différente et opposée, suivant que la dissolution globulaire est due au venin-lécithide ou au venin lipoïde ; ce sel exerce une action empêchante dans le second cas et non dans le premier.

GENGou (1907), a fait une semblable observation vis-à-vis du citrate de soude : en solution à 2 à 3 %, le citrate empêche l’hémolyse par le venin-lécithide et n’a aucune influence sur l’hémolyse par les veninslipoïdes ; l’action empêchante du citrate est inhibée par CaCP.

Duncerx et Coca (1907) ont constaté que les chlorures de baryum de magnésium et de calcium, surtout le dernier, ont la propriété d'empêcher l’hémolyse par le venin-lécithide et par le venin-sérum. Les auteurs attribuent les propriétés antihémolytiques de ces sels à la suppression de la propriété activante des complémeents du sérum, sans que les globules aient perdu la faculté de fixer les ambocepteurs.

Banc reprend en 1909 l'étude de l’influence des sels sur l’hémolyse. Aux chlorures, il ajoute les sulfates, les nitrates, et même les acétates, comme sels empêchants. Ces sels d’acides forts agissent par leur action ; laluminium est 6 fois plus actif que le calcium ; celui-ci 60 fois plus actif que le sodium. Ces métaux ont une véritable affinité pour le venin.

Toutefois, comme l'avaient observé DuncEerN et Coca, les sels n’agis-

sent pas directement, mais ils empêchent le venin de se fixer sur les globules.

| En effet, les globules en suspension dans une solution isotonique de

saccharose fixent à froid le venin sans s’hémolyser (voir plus loin). Si on les lave dans la solution de NaCI à 0,8 % et qu'on les replace dans la solution sucrée à la température de 37°, ils ne sont pas hémolysés, même en ajoutant de la lécithine ; et la solution de NaCI renferme le venin, car elle est capable d’hémolyser les globules neufs en présence de lécithine.

Les résultats sont les mêmes si on fait agir à froid le venin sur les globules en suspension dans une solution de sucre ou de NaCI ; les globules ne le fixent pas : ils sont inactivés.

Ce qui crée dans ce cas la résistance des globules à l’hémolyse, c'est la présence de Co? ou d’un acide qui l'aurait remplacé. L'influence de l’acide peut être montrée directement en lavant les globules envenimés à froid dans une solution très diluée de HCI ; ils ne sont plus hémolysables, même en présence de lécithine. L’acide déplace donc le venin d'une combinaison avec un élément basique des globules ; c’est-à-dire que le venin est lui-même un corps acide, pour lequel les métaux, Al, Ca, Na... ont une affinité manifeste.

Action favorisante des sels à acide faible. — Kxes et Sacns avaient montré l’action favorisante des oléates sur l’hémolyse par le venin de Cobra. En 1908, Duncerx et Coca reprennent cette étude et recherchent le mécanisme de l’hémolyse par l’acide oléique ou les oléates et le venin de Cobra ; et si, d'autre part, l’hémolyse par ces substances doit être attribuée au Cobra-lécithide ou au composé du venin jouant le rôle d’ambocepteur.

Ils montrent d’abord que l’hémolyse produite par l'addition des oléates réussit aussi bien avec les hématies de cobaye qu'avec celles de bœuf, beaucoup moins sensibles au venin. En outre, les essais de fixation établissent qu'après traitement des globules par les oléates, la partie hémolysante du venin n’est jamais absorbée par le sang de bœuf en l’absence de substances adjuvantes. Ainsi, pour le démontrer, ils traitent les globules lavés de bœuf par une solution de venin de Cobra pendant une heure (20 cc. d’une émulsion à 5 % de globules, et 2 cc. d’une solution à 1 % de venin). Après séparation des globules et trois lavages successifs, ils essaient l’action hémolytique de l’acide oléique et de l’oléate de soude ; le résultat est le même que si les globules n’avaient pas été envenimés. Ainsi il n'existe pas d’analogie entre le sérum-complément hémolytique et les composés oléiques.

Ces faits suggèrent trois hypothèses : 1° ou bien le venin agit sur les oléates en les rendant hémolytiques ; 2° ou bien les oléates exaltent le pouvoir hémolysant du venin ; 3° ou encore, ils rendent les hématies plus attaquables par le venin.

Pour choisir entre elles, les auteurs préparent des mélanges de venin et d’oléates ; ils ajoutent au bout d’une heure des globules de bœuf : comparativement, les trois substances sont mélangées en même temps ; l’essai montre que l’exaltation du pouvoir hémolytique n'est pas due à

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une modification des oléates, mais que la combinaison venin-oléates a une action hémolysante plus faible si l’on n’ajoute pas de globules ou de lécithine ; on en peut conclure qu'il s’agit d’une modification du Cobralécithide, et les auteurs obtiennent des résultats très différents suivant la durée du contact de l’oléate, de la lécithine et du venin. L’hémolyse est plus rapide quand les oléates sont ajoutés dès le début aux autres éléments du mélange. Les auteurs pensent enfin que l’oléate de soude altère la solubilité des composés du venin de Cobra, permettant ainsi à ce dernier d'attaquer plus facilement la lécithine du sérum ou des globules.

Banc a constaté en 1909, l’action favorisante des sels à acides faibles sur l’hémolyse (carbonates, chromates, phosphates basiques). En enlevant l’acide aux globules comme le saccharose, ils les sensibilisent ou les réactivent ; les globules lavés d’abord dans une solution de ces sels ou de saccharose ne sont plus inactivés par NaCI.

On peut ainsi alternativement rendre les globules résistants ou sensibles, suivant qu’on leur fournit de l’acide ou qu’on leur en enlève. En général, les sangs sont plus ou moins sensibles suivant leur richesse en acide carbonique. On sensibilise les globules réfractaires en les lavant au chromate de potasse ; on les rend au contraire plus résistants, même en présence de lécithine, en les chargeant de Co’.

La base du sel semble intervenir dans la fixation du venin sur les globules ; BanG a essayé si en chargeant les globules de sels appropriés on peut leur permettre de fixer assez de venin pour s’hémolyser dans ia solution physiologique de NaCI. A côté d’insuccès, il a réussi avec des sels de calcium et avec du carbonate de soude à obtenir l’hémolyse avec de faibles quantités de venin.

Influence des sucres sur l’hémolyse et l’agglutination

Kyxes avait observé en 1902 que les globules rouges de mouton et de bœuf, lavés et émulsionnés dans la solution physiologique et isotonique de sel marin, n’agglutinent ni ne se dissolvent jamais au contact du venin de Cobra.

En 1905, O. GœBEL en substituant dans le lavage des globules ja solution isotonique de saccharose (7,79 pour 100) à celle d’eau salée à o,8 pour 100, et émulsionnant les globules dans la même solution sucrée arrive aux constatations suivantes :

Des lavages répétés dans une solution isotonique de saccharose mo difient les globules au point qu'ils agglutinent spontanément, et que, sous l’action du venin de Cobra, ils sont hémolysés. La dissolution est d’autant plus rapide que la solution de venin est plus faible. Les globules conservés à la glacière se désagglutinent lentement.

Il semble, d’après GŒBEL, que l’action des substances sucrées soit due surtout à leurs propriétés physiques, notamment à leur incapacité de traverser la membrane semi-perméable des globules. L'auteur formule,

sous forme d'hypothèse, la conception suivante : On pourrait admettre que, soit par des lavages répétés à l’aide de la solution sucrée, soit par l'addition de fortes doses de sucre, on supprime l'influence de substances antihémolytiques intra et extraglobulaires dont l’activité est liée à la présence de sel marin.

En 1908 DuncEerx et Coca confirment la découverte de GœBeL : la formation de cobra-lécithide semble beaucoup plus facile dans les solutions sucrées que dans les solutions salines.

Ces recherches les amènent à penser que dans l’hémolyse par les venins, le mécanisme est complètement différent de celui qu'on observe avec les sérums par l’action réciproque du fixateur et du complément.

Banc reprend, en 1909, les relations des hématies avec les sels, comme nous l’avons vu précédemment, et avec le saccharose en ce qui concerne l’agglutination et l’hémolyse par le venin de Cobra.

En se plaçant dans les mêmes conditions que GoBer, BAG a constaté que les globules de veau n’agglutinent pas comme ceux du bœuf, à moins qu'ils n'aient été préalablement traités par une solution de sel marin ou d'un sel d'acide fort.

Banc explique ces phénomènes par le rôle de l'acide carbonique dont la teneur variable dans le sang causerait des effets différents : le sang de bœuf puisé dans l'artère sous-clavière est plus riche en Co? que celui du veau puisé dans l'artère carotide. Mais si on traite le sang de veau par NaCI] ou un sel d’acide fort, il se fait un échange entre Co? et l’anion du sel; ce dernier se fixe à l’état d'acide sur les globules. Lorsque ceux-ci ont été complètement privés de Co? par lavage dans la solution sucrée, la substitution ne s’opère pas, et l’agglutination n'a pas lieu (sang de veau). D'autre part, si comme l’a vu Gœ8Ez, les globules de bœuf se désagglutinent, c’est que leur Co? diffuse peu à peu au dehors.

Ce qui montre l'influence de la fixation d'acide sur les globules c’est qu’on peut dans tous les cas provoquer l’agglutination avec l'acide chlorhydrique très dilué : elle serait ainsi due à la fixation d'acide (HCI ou CO?, ce dernier en proportion plus grande) sur les globules. C'est une hypothèse qu'il est difficile d'établir d’une manière plus certaine, et que l’auteur applique également à l’hémolyse.

Les globules conservés pendant quelques heures dans une solution de sucre additionnée de NaCI résistent moins aux solutions hypotoniques que ceux qui ont été conservés dans le sucre seul : il s’est produit comme dans le cas de l’agglutination, un échange entre leur Co? et NaCI avec fixation de HCI. Au contraire, les alcalis et les carbonates alcalins augmentent la résistance aux solutions hypotoniques parce qu'ils favorisent la diffusion au dehors de Co? ou de tout autre acide : des globules rendus résistants par le carbonate de soude peuvent être ramenés à l'état normal par HCI dilué, et réciproquement.

Ces substances n'altèrent donc pas les globules. Il résulte de là une conséquence importante, c’est que le sang dilué avec NaCI renferme tou-

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jours de l’acide en quantité correspondante à CO?; pour avoir des globules normaux, il faudrait les laver en solution sucrée avant de les soumettre à l’action de NaCI.

Influence des ferments : déséolécithine, lysocithine

Comme Lam8, LUDECKE (1905), conteste l’origine venimeuse du Cobralécithide ; il le considère comme uniquement dérivé de la lécithine, et ne renfermant aucun élément du venin. Il émet le premier l’idée que l’hémolyse pourrait être due à une simple action diastasique.

NEUBERG et ROSENBERG (1907) admettent que le venin, provoquerait le dédoublement de la lécithine.

ARRHENIUS (1898), Banc (1908), contestent aussi l’existence du Cobralécithide, ce dernier auteur en s'appuyant sur diverses expériences dont deux sont à retenir : 1° dans la dialyse d’une solution à 1 % de lécithine, la fraction qui passe au dialyseur est activante, alors que les lécithines pures ne sont pas dialysables ; 2° en appliquant à la lécithine commerciale « Agfa » la technique qu'emploie Kyes pour préparer le Cobra-lécithide, on obtient, sans addition de venin, un produit qui a les caractères de solubilité du lécithide ; le Cobra-lécithide ne serait, d’après Banc, qu'un mélange de venin de Cobra et d’un activateur encore inconnu.

Pour déterminer celui-ci, Banc cherche à fractionner la lécithine commerciale en ses constituants ; par l'emploi approprié de l’éther, de l’acétone et de l'alcool méthylique, il sépare du produit brut : 1° la lécithine pure, insoluble dans l’acétone, soluble dans l’alcool et l’éther ; 2° la céphaline soluble dans l’éther et insoluble dans les deux autres réactifs, et qui serait seule activante ; mais la céphaline n’est pas ellemême un produit pur, car si on précipite par l’acétone le premier extrait éthéré de lécithine brute, le précipité entraîne un produit nouveau qui est différent des deux précédents, et qui est inséparable de la céphaline, de sorte qu'on ne peut savoir lequel des deux est actif. D'ailleurs le protagon, ie KossEL, qui se compose surtout de céphaline, est inactif. La question reste donc indéterminée, et Banc, nous l’avons vu, recherche dans une autre voie le mécanisme intime de l’hémolyse.

L'existence du Cobra-lécithide est encore mise en doute au même moment par Duncerx et Coca en 1908. Les auteurs font deux hypothèses : ou bien l’hémolysine du venin de Cobra (Cobralysine) consiste en une combinaison de venin avec la lécithine, comme l’admet Kyes, ou bien en un dérivé de la lécithine seule, produit par une action fermentative, et n'ayant aucun rapport avec le venin, comme le prétend Lupecke.

Pour élucider la question, les auteurs reprennent des essais d’immunisation avec le Cobra-lécithide, soit en partant d’une ovo-lécithine, qu'ils préparent d’après la méthode de Kyes, soit en utilisant la lécithine commerciale de Merck. Ils constatent que l’antivenin spécifique n’a pas d’action élective contre l’hémolyse par le Cobra-lécithide, non plus que les