TOME

sérums préparés avec le Cobra-lécithide contre l’hémolyse par le sérumvenin ; ils en déduisent que le Cobra-lécithide ne doit pas être considéré comme une combinaison de venin et de lécithine.

Le venin de Cobra, d’après ces auteurs, contiendrait une lipase qui sépare de la lécithine l’acide oléique, et laisserait une « déséolécithine », l’une et l’autre substance ayant un pouvoir hémolytique, mais inégal ; la déséolécithine serait l’hémolysine principale.

La déséolécithine est insoluble dans l’éther, et par saponification ne fournit pas trace d’acide oléique.

Les auteurs répondent à Banc, pour lequel les produits hémolytiques insolubles dans l’éther sont des impuretés des lécithines commerciales, qu'après le traitement par le venin, la lécithine renferme une plus grande proportion de substance insoluble dans l’éther. Ils ne peuvent admettre que la lécithine elle-même ne participe pas à la formation de l’hémolysine.

Les auteurs indiquent aussi que de diverses préparations d’ovo-lécithine, ils ont isolé des substances très hémolytiques ayant tous les caractères physiques et biologiques du cobra-lécithide, sauf qu'il n’est pas évident qu'il y adhère encore du venin naturel, car l’addition de lécithine n'accroît pas leur pouvoir lytique, et l’inoculation aux animaux ne détermine pas la formation d'antihémolysine. Le pouvoir hémolytique de ces substances est environ deux fois moindre que celui du Cobra-lécithide.

Le venin de Cobra sépare aussi de la lécithine des acides volatils en petite quantité, qui gênent l’action de la lipase et obligent à alcaliniser légèrement pour préparer la déséolécithine. Ce produit contient la plus grande partie du ferment apporté par le venin, ce qui explique qu'il soit lui-même activé par une nouvelle quantité de lécithine. L'action de ce ferment du venin est empêchée par le sérum anticobra.

MaNwaRiING (1910), soutient aussi la simple action diastasique.

Recherchant quelles relations existent entre l'activation du venin et celle des hémolysines ordinaires par le sérum, MorGENroTH et Kaya (1910) ont vu que le venin détruit le complément du sérum par contact prolongé avec lui ; cette action va en augmentant, et atteint un maximum au bout de 3 heures à la température de 37°, puis diminue ; tandis que si l’on abandonne au repos le mélange de venin et de lécithine, l’activité augmente et ne se perd pas. La réaction dans le premier cas se comporte comme si elle était due à un ferment.

Substances hémolytiques libérées par le venin de Cobra aux dépens du sérum et du vitellus de l’œuf de poule. — En 1911, C. DELFZENNE et S. Lenegr reprennent l’idée de l’action diastasique du venin dans le mécanisme de l’hémolyse par le sérum et par la lécithine employée sous forme de vitellus.

Dans une première série d'expériences, ils s’attachent à élucider Ja formation d’'hémolysine dans les mélanges venin-sérum.

HÉMATOLYSINES ET AGGLUTININES 643

Leurs expériences portent sur les globules lavés de bœuf, de mouton et de cheval, sur lesquels ils font agir à la température de 16-18° une dose fixe de sérum de cheval, au contact de quantités variables de venin.

Si les expériences sont faites suivant le type habituel, c’est-à-dire si les mélanges sérum-venin sont mis aussitôt en contact avec les globules, on observe que l’hémolyse, très rapide pour des doses élevées de venin, se ralentit graduellement pour devenir complètement nulle à partir d’une dose qui représente la dose limite capable de produire l’effet minimum.

Mais si les expériences sont faites suivant un type particulier, et tel que les mélanges sérum-venin soient abandonnés à la température ordinaire ou à l’étuve à 40o-50° avant d’être mis en contact avec les globules, on observe que leur activité hémolvtique passe par un maximum très élevé, et d'intensité sensiblement la même, quelle que soit la quantité de venin employée, pour disparaître ensuite graduellement. L’accroissement de cette dose ne fait qu'accroître la vitesse avec laquelle le maximum est atteint au voisinage de la température optima.

De plus, ces résultats s’observent, non-seulement avec les doses minima actives du type habituel, mais pour des quantités jusqu’à 500 fois inférieures à ces dernières. Il ressort de là : 1° que le venin agit comme un catalyseur, en l'espèce une diastase, capable de libérer aur dépens de certains matériaux du sérum une substance douée de propriétés hémolytiques propres ; 2° que cette action catalytique du venin est considérablement limitée par la présence des globules.

Aucun des constituants du venin ne participe à la formation de l’hémolysine ; quelle que soit la dose de venin employée, celle-ci peut être intégralement récupérée et agir à nouveau sur une nouvelle quantité de sérum.

La phase de disparition de l’activité hémolytique des mélanges sérumvenin est plus longue que la première ; elle est d’autant moins longue que la période d'activité maximale a été plus rapidement atteinte.

Elle est aussi le résultat d’une action diastasique exercée par le venin : effectivement, si on neutralise ce dernier par le sérum antivenimeux spécifique, on arrête la désagrégation de l’hémolysine formée, et le mélange venin-sérum conserve sa propriété lytique.

La disparition de l’hémolysine s'accompagne de mise en liberté de savon calcaire, sous forme de globoïdes biréfringents, et du venin primitif. Si la quantité de venin mise en œuvre la première fois est assez forte, le même phénomène peut être reproduit un grand nombre de fois par additions successives de sérum, montrant que le venin n'intervient dans les processus qu’à la façon d’un catalyseur ou d’un ferment.

De plus, les mélanges de sérum-venin devenus totalement inactifs sont antihémolytiques pour les espèces globulaires directement sensibles au venin ; ils neutralisent aussi l’action hémolytique si intense du couple venin-lécithine, et, dans certaines conditions, s'opposent à l’hémolyse

immédiate par de nouveaux mélanges venin-sérum mis aussitôt au contact des globules.

Cette action empêchante, souvent égale à celle du sérum antivenimeux spécifique, disparaît par le chauffage à 75-80°.

Même à la période de leur activité hémolytique maximale, les mélanges venin-sérum ne sont pas toxiques, au moins par inoculation intraveineuse au lapin, de doses déjà élevées de 10 à 20 cc. par kilogramme.

Les faits relatifs aux propriétés activantes de la lécithine dans l’hémolyse par les veines ont conduit DELEZENNE et LEDEBT à répéter leurs expériences en substituant au sérum de cheval le vitellus de l'œuf de poule, émulsionné dans l’eau salée physiologique.

Comme dans le cas du sérum, la température et la quantité de venin n'influent nullement sur la puissance hémolytique maxima de l’émulsion, mais seulement sur la vitesse avec laquelle elle s'opère ; comme avec le sérum aussi, elle est gênée par la présence des globules.

L'hémolysine formée dans les deux cas (sérum ou vitellus) a les mêmes caractères physiques et la même origine : c’est un dérivé des phosphatides du sérum ou de l’œuf, et en particulier de la lécithine, qui disparaît peu à peu au cours de sa formation. Elle n’est pas toxique ; c’est donc une substance distincte de la neurotoxine ; elle est soluble dans l’eau, dans l'alcool, insoluble dans l’éther ; le sérum antivenimeux ne la neutralise pas. Il existe toutefois une différence fondamentale entre l’hémolysine produite avec le sérum et celle qui est libérée du vitellus : celle-ci ne se détruit pas avec le temps au contact du venin comme l'hémolysine du sérum ; les mélanges venin-vitellus restent indéfiniment hémolytiques ; il n’existe donc pas dans le vitellus de co-ferment pour détruire la première action, comme il s’en rencontre dans le sérum de cheval.

Outre l’hémolysine, le venin de Cobra donne naissance dans la même émulsion de vitellus (et non dans le sérum) à une substance extraordinairement toxique, car la mort des animaux qui la reçoivent peut survenir avec un mélange qui ne contient que 1/10.000 de la dose mortelle de venin. Lorsqu'on injecte aux animaux des doses un peu inférieures à la dose mortelle, qui est de 1 cc. 5 à 2 cc. pour le lapin, on observe des accidents graves rappelant de très près chez le lapin, le cobaye ou le chien, le syndrome anaphylactique propre à chaque espèce. La mort rapide ne s'accompagne que d’une forte congestion des viscères et des poumons.

Cette substance toxique n’est influencée ni par le sérum antivenimeux, ni par l’ébullition.

Hémolysine et substance toxique se développent parallèlement, et la façon dont elles apparaissent montre qu’elles sont des produits d'action diastasique du venin : très rapide au début, la vitesse s’atténue au fur et à mesure que les produits formés s'accumulent, pour arriver ensuite lentement à zéro.

Les auteurs signalent encore les deux faits suivants :

1° Dans les mélanges qui ont subi l’action du venin, la vitelline a perdu complètement la faculté d’être coagulée par la chaleur ;

2° Une injection intraveineuse de peptone, faite quelques heures auparavant, protège le lapin contre les effets d’une ou plusieurs doses d’émulsion toxique.

Les faits précédents s’observent aussi, à l’intensité près avec tous les venins de Serpents jusque-là étudiés par les auteurs ; quant au venin de Daboia, qui est surtout coagulant, il donne avec le vitellus de l’œuf, des substances hémolytiques et des substances toxiques ; mais, fait particulier, il fournit, à des doses bien inférieures à la dose mortelle des mélanges, une substance produisant comme le venin lui-même la mort par coagulation intravasculaire. Contrairement aux deux autres cas, l’action coagulante peut être neutralisée par l’antisérum spécifique, de telle façon que le sérum peut sauver les animaux au début, mais non plus tard, quand la substance toxique s’est développée à son tour. La substance toxique résiste à la température de 100°, qui détruit la substance coagulante.

En 1912, M. DeLezenne et S. LEbEBT, apportent une nouvelle contribution à l’étude des propriétés des substances hémolytiques dérivées du sérum et du vitellus de l’œuf soumis à l’action des venins. La substance hémolytique formée dans l’une ou l’autre condition est dérivée des phosphatides de ces matières, en particulier de la lécithine ; mais contrairement à celle-ci, elle ne contient pas d’acide gras libres (ac. oléique...), qui apparaissent dans le milieu pendant sa formation, et ne se trouveni pas dans les produits de dédoublement de la substance pure par l’acide chlorhydrique. L’hémolysine est soluble dans l’alcool, comme la lécithine ; mais insoluble dans l’éther, ce qui permet de la séparer de la substance précédente ; elle donne dans l’eau des substances mousseuses très actives.

La destruction ultérieure de l’hémolysine qui se produit dans le sérum et s'accompagne de la production de savons calciques en globoïdes donnant la croix de polarisation, ne se produit pas avec le vitellus de l’œuf ; elle nécessite la présence de substances dialysables ; dans le sérum dialysé (en milieu salé isotonique), elle ne se produit que si l’on ajoute à nouveau les produits de dialyse ou de filtration sur collodion du sérum, ou du liquide céphalo-rachidien, liquide fort analogue au précédent, et comme lui non susceptible d’être modifié par le venin. Au contact de l’un de ces liquides, l’hémolysine extraite du vitellus de l'œuf subit aussi la destruction par le venin.

L’hémolysine ne se détruit pas comme elle le fait avec le sérum antivenimeux dans le mélange venin-sérum, au contact d’une dose convenable d’oxalate ou de citrate de soude.

Nature chimique de la lysocithine. — MM. DeLFrzennE et FOURNEAU (1914), ont fait l’étude chimique du composé hémolytique dont les au-

teurs précédents ont mis en évidence le mode de formation et les principales propriétés. Ce produit est l’anhydride de l’éther monopalmitophosphoglycérique de la choline, et contient un peu de l’éther stéarique correspondant. Il dérive de la lécithine du jaune d'œuf qui contient, outre l'acide gras saturé, des acides à liaison éthylénique, que le venin en sépare. Le nom de lysocithine que lui donnent les auteurs, rappelle son origine et ses propriétés lytiques. La réaction provoquée par le venin est donc une saponification ; mais contrairement à l'opinion de Duncern et

Coca, le venin ne peut être considéré comme une lipase, car son action

ne s'exerce que sur les phosphatides.

Préparation de la lysocithine. Elle est obtenue par l'action de 1 milligr. de venin de Cobra sur deux jaunes d'œuf émulsionnés dans 100 cc. d’eau salée physiologique. La réaction dure 12 heures à la température de 50°.

La poudre obtenue par dessication dans le vide est épuisée à froid par l’acétone, séchée et reprise par l’alcool absolu ; la solution concentrée est précipitée par l’éther anhydre ; le précipité centrifugé, lavé à l'éther et séché. Recristallisé plusieurs fois dans l’alcool absolu, ce précipité est dissous dans le chloroforme chaud, et se prend par refroidissement. On le dissout encore dans l’alcool chaud, et on le précipite à l’état cristallin par l’éther de pétrole. Ce produit, ainsi purifié, est très peu soluble dans le chloroforme, insoluble dans le benzène, contrairement au produit impur.

C’est la lysocithine, et non le venin, comme le pensaient Kyes et Sacs, qui fixe la cholestérine, molécule à molécule, mais en milieu aqueux seulement. Le mélange forme dans l’eau une émulsion très stable, qui retient l’eau énergiquement, et qui n’est nullement hémolytique.

La cholestérine se laisse séparer par l’éther de l’émulsion aqueuse additionnée d’alcool.

Les sels, en particulier ceux de calcium, des lécithines impures du commerce ou du jaune d'œuf, favorisent l’action du venin sur la lécithine ; ils sont même probablement indispensables à la réaction ; d’où les irrégularités inexpliquées dans l’obtention du Cobra-lécithide de Kyes. qu'il considérait comme une combinaison définie.

Les sels sont en tous cas indispensables à l’action destructive exercée secondairement par le venin sur la lysocithine, action qui se produit dans le sérum, mais non dans l’émulsion de vitellus.

Dans l’eau pure et sous l’action du venin, la lysocithine devient insoluble dans l’eau, soluble dans le chloroforme ; elle n’abandonne aucun acide gras, et conserve son pouvoir hémolytique.

Au contact des sels de calcium et sous l’action du venin, l'acide palmitique se sépare de la lysocithine sous forme de savon calcaire (palmitate de calcium), et le pouvoir hémolytique disparaît. Les milieux naturels rendent cette réaction plus rapide. Dans le sérum de cheval, le

HEMATOLYSINES ET AGGLUTININES 647

savon calcaire qui se forme pendant la disparition de la lysocithine est du stéarate de calcium.

Rien ne permet de supposer que la neurotoxine qui, dans les venins, est le facteur principal de l’envenimation, soit identique à l’hémolysine comme le pensaient Banc et OverTon. Quelques expériences montrent même que ces substances sont différentes. Il est seulement vraisemblable pour les auteurs que la partie neurotoxique du venin est, elle aussi, un catalyseur déterminant la formation d’une substance toxique.

HÉMOLYSINE ET ANTIVENIN

Le sérum antivenimeux est sans action sur l’hémolyse produite par les couples venin-lécithine, venin-lipoïdes et par la lysocithine ; mais il neutralise l’action de l’hémolysine du couple venin-sérum.

Ce dernier fait a été mis en évidence par À. CALMETTE (1895), par STE- PHENS et Myers (1898) ; ces derniers auteurs ont vu que la mesure de la neutralisation est la même in vivo que in vitro, mais pour la dose minima mortelle seulement, et que la neutralisation est spécifique. STEPHENS (1900), poursuivant cette étude a montré de plus, que l’action n'est pas très constante ; à doses incomplètement neutralisantes, le sérum antivenimeux peut, soit empêcher, soit activer l’hémolyse, d’où il résulte de l'incertitude sur l’unicité de l’hémolysine d’un même venin.

Toutefois, en se tenant dans les limites de la dose minima mortelle de venin, le phénomène neutralisation acquiert assez de constance, et l'étude des mélanges neutres hémolysine et antivenin, comparable aux mélanges toxine et antitoxine, a montré à CALMETTE et à Noc (1904), que l’activité antitoxique in vivo d’un sérum antivenimeux peut être mesurée par son pouvoir antihémolytique in vitro. L'importance pratique de ce fait n’a besoin d’aucune démonstration.

Le mélange neutre hémolysine et antivenin ne présente pas une grande stabilité, c’est ce qu'avait déjà observé CALMETTE en 1805.

Kxes et Sacus ont confirmé le fait : en 1903, ils ont montré que la résistance de la cobralysine à l’ébullition est augmentée par l’addition d’une solution aqueuse faible d’acide chlorhydrique (2 à 3 % au maximum). Dans ces conditions, si on porte à la température de 100° le mélange cobralysine et antivenin, l’antivenin est détruit, et la cobralysine totalement récupérée.

Toutefois, si le mélange est abandonné pendant 24 heures en milieu acide, à la température ordinaire, l’hémolysine subit elle-même une altération légère (FLExNER et Nocucni).

En 1905, MorGEenroTu, dans un intéressant mémoire sur la reconstitution d’un mélange toxine et antitoxine, a montré qu’en ce qui concerne le mélange homologue cobralysine et antivenin, il se comporte comme le premier et peut être dissocié par la solution faible d’HCI ; les deux substances ne se combinent même pas dans ce milieu acide.

Si l’action de l'acide n’a pas été trop prolongée, sa saturation par NaOH ou Az H'OH restitue à l’hémolysine la faculté de se recombiner à nouveau avec l’antivenin.

La quantité de Cobralysine ainsi restituée correspond intégralement à celle primitivement ajoutée à l’antitoxine, et celle-ci libérée ne se trouve pas altérée par HCI.

Ainsi il est possible par la seule action d’HCI en solution faible sur le mélange neutre cobralysine et sérum anticobra, de mettre en liberté la première sous forme de cobralysine ou lécithide, de soustraire ce lécithide à l’action du sérum spécifique, et de démontrer sa présence en constatant son pouvoir hémolytique.

Poursuivant cette étude MorGExroTH et PAxE (1906) constatent que le venin de Cobra chauffé longtemps en milieu acide (contenant environ N/20 HCI) perd une partie de sa propriété hémolytique ; mais si on neutralise la solution, et qu’on l’abandonne pendant quelques jours à la température ordinaire, elle récupère le pouvoir hémolytique qui devient aussi élevé que dans la solution originelle. 11 n’en est plus ainsi lorsque les opérations précédentes n’ont pas été faites en milieu acide.

TEeruucnt (1907) trouve que l’hémolysine du venin de Cobra et l’antivenin correspondant sont détruits par le suc pancréatique du chien, activé par le suc intestinal (ce dernier employé seul n’a pas d’action). Le cobra-lécithide n’est pas influencé par ce traitement. D'autre part, pendant la digestion pancréatique du mélange neutre, une partie de la cobralysine peut être mise en liberté ; mais l’addition préalable de lécithine au mélange empêche cette libération.