LAB0RAT0R10 DI PARASSITOLOGIA DELL UNIVERSITA DI TORINO

Quando si osserva al microscopio il sangue di una larva di Bombice del gelso afletta da giallume, lo si vede zeppo di corpicciuoli incolori oleggermeategiallognioli, trasparenti, fortemente rifrangenti, rotondeggianti se la malattia è'ancora ai primi stadi, poliedrici invece a malattia avanzata, di dimensioni variabili seconde gli autori fra 2 e 10 [i. Sono queste le formazioni note sotto il nome di granuli poliedrici. Essi assumono per lo più la forma di un rombododecaedro : non mancano perô forme di teti*aedi, esaedri, ottaedri, ecc.

Le ricerche microchi miche, istituiteda vari autorise spécial mente da Bolle, Panebianco, Prowazek, hanno dimostrato che questi granuli sono piuttosto résistent! al calore secco, perché, tenuti a 20(y> per 2 ore,non mostrano alterazioni apparenti: a dOO"» diventano neri ; scaldati sulla lamina di platino, carbonizzano, spandendo odore di peli bruciati. Scaldati in presenza d*aqua, a BO'^restano inalterati,a 100* diventano rotondeggianti. Non si sciolgono in solfurodi carbonio, alcool, etere, cloroformio,glicerina, benzina ne a caldo ne a freddo: si sciolgono invece negli alcali fort! (soda, potassa, ammoniaca) e neiracido nitrico, ma non negli acidi solforico, e cloridricoconcentrati. Neli'acido aceticoconccntratosi gonfiano, mostrando neirinterno délie punteggiature; ed il loro contorno appare dentellato ; prendono in seguito Taspetto di una goccia ialina.

La soluzione di questi granuli nella potassa, trattata con acido soUorico, darebbe, secondo alcuni, un precipitato, nel quale si scorgono dei cristalli identici ai primitivi granuli, ma più piccoli.

SUL PARASSITA DEL Gl ALLUME DEL BOMBYX MORI 4î)7

1 colori di anilina tingono bene i granuli poliedrici, e più rapidnmente i più piecoli (neutralrotb, brillant cresylblau, eosina, eritrosina, fucsina, verde di metile, violetto di metile, ecc.) : l'acido osniico non H colora, lasoluzione di Lugol li tinge in giallo-bruno, il nietodo di Millon in rosa. Secondo Keit,essi contengono circa il 76 Vo d'acqua, il 13% di proteina, il 7 Vo di grasso.

Dal giorno in oui Maestri li scoperse, si cominciô a dibattere la questione délia natura e del significato loro. Maestri li credette gocie adipose, Verson e Panebianco cristalli;BoIle,che sulle prime sera pronunciato in favore deiropinione di Verson, piùtardi,dopo lunghe ricercbe eseguite al Giappone col Dott.Sasaki, dichiahrôcbe i granuli poliedrici non sono altro che spore di un Protozoo, il Microsporidium polyedricum Bolle,che egli ritiene Tagente specifco délia malattia. Afferma diaverpotutoconsta tare cbe essi emettono corne da un guscio il loro contenuto, o sotto forma di un corpo ameboide, o, più spesso, colKaspetto di una goccetta jalina; dal corpo ameboide o dalla goccetta si forma poi una vescichetta con inviluppo a doppio contorno, il cui contenuto si pu6 chiaramente diSerenziare in endo-ed ectoplasma: entro a questa vescichetta appaiono dei globuletti chiari,che, ingrandendosi, assumono in definitiva Paspetto dei granuli poliedrici.

Queste ricercbe, per quanto condolte con grandissima cura, non persuasero completamentegli studiosi. Ed invero, la relazione che il Bolle dà délie sue ricercbe non dissipa completamente il dubbio cbe certe parti délie sue osservazioni non siano state vagliate con critica severa, tanto più che non solo non risulta che siano stati usati i metodi moderni di tecnica, ma pare certo, sebbene non sia dicbiarato esplicitamente, cbe Pautore si sia limitatoa deisemplici esami a fresco senza colorazione. Onde appare giustificato il giu* dizio di Doflein e Prowazek, cbe cioë la natura parassitaria dei granuli poliedrici, malgrado le ampie ricbercbe del BoUe, non sia dimostrata fuori d'ogni dubbio.

E Panebianco, in base aile sue ricercbe microcbimicbe e cristallograficbe, ribadi il concetto, già prima espresso, cbe si trattasse di cristalli: anzi in una nota espresse la. sua meraviglia perche Perroncito, che, pur senza eseguire ricercbe sistematiche, si era molto occupato délia questione, propendeva a ritenerli parassiti malgrado queste sue conclusioni, secondo lui définitive.

iî8 V. MARZOGCHI

Ultimamente Prowazek, semprein base a reazioni microchimiche affermava trattarsi di una spéciale degenerazione dei nuclei dei leucociti e délie cellule adipos<^, onde quelle formazioni descritte dal Bolle corne cisti, non sarebbero altro che nuclei rigonfi contenenti granuli poliedrici. A riprova délia sua aflermazione, aggiun geva che il virus dei giallume è filtrabile.

E Verson, polemizzando con Fischer, che mostrava di considerare i granuli poliedrici corne esseri viventi, ripete che Panebianco ha fatto « giustizia inappellabile » di questa ipotesi.

Se il lavoro dei Bolle si presta ad obbiezioni, quelli dei sostenî* tori délia naturacristallina dei granuli poliedrici non sono neppur essi esenti da critica. Essi si fondano infatti essenzialmente sullo aspetto cristallino e su alcune reazioni microchimichediessi, anzi chè sopra uno studio accurato dcl loro modo di prodursi e délie fasi di sviluppo che attraversano , e non tengono abbastanza conto délia possibilité che la forma polîedrica sia dovuta ad un guscio solido, avvolgente, corne ritiene Bolle, un parassita, eche, appunto dalla presenza di questo guscio, e dalle propriété fisiche e dalla costituzione chimica di esso, dipenda il loro modo di comportarsi di fronte ai vari agenti fisici e chimici. Quanto poi alla filtrabilità dei virus, non è certamente una prova decisiva, non essendoisolato il caso che un Protozoo in certe fasi dei suo ciclo di sviluppo possa dare forme capaci d'attraversare i filtri.

Per indirizzare questa intricata questione sulla via di una solu-

zione, era, a parer mio, anzitutto necessario studiare come e dove

prendano origine questi granuli, per quali stadi di sviluppo pas

sino prima di assumere il loro aspetto caratteristico, se sia possi-

bile scoprire in essi qualche particolarità di struttura, ecc. A tal

uopo ho intrapreso, neiranno scorso ed in questo, alcune ricerche

che ho già pubblicate in parte in alcune note preliminari e che qui

coropleto, accennando a tutto quanto ho potuto vedere finora, e

riordino.

I miei primi sforzi furono diretti a cercare unbuon metododi colorazione, taie da permettere di riconoscere agevolmente negli strisci e nelle sezioni i granuli poliedrici nei loro vari stadi di sviluppo, e, possibilmente, anche atto a rivelare eventuali partico-

larità di struttura. AUestiti molti strisci di sangue di Bachi da seta ammalati, provai una numerosa série di colori d'anilina in soluzione acquosa od alcoolica, il metodo di Giemsa, di Gram, di Ziehl, remallume, rematossilina ferrica,masenzarisultati soddisfacenti, perche i granuli poliedrici restavano incolori, o si coloravano talora uniformente, tai'altra irregolarmente.

Considérai allora la possibilité che qucsti insuccessi fossero dovuti a qualche disposizione spéciale, forse ad un involucro poco permeabile per quëste sostanze, o per i loro solventi, e, muovendo da questa ipotesi, tentai anzitutto di sciogliereodalmenodî moditicare questo supposto involucro, sottoponendo gli strisci allazione preventiva d'acidi diluiti ( acido cloridrico o solforico 1-S 0/0 )per 10-15 minuti. Quando, dopo taie trattamento e successivo abboni danle lavaggio in acqua, esperimentai di nuovo i colori ed i metodi già prima usati, vidi che i granuli poliedrici prendono assai bene le sostanze coloranti, ma in modo particolarmente caratteristico si colorano col metodo di Gram. Con questo metodo, quando, dopo sufliciente decoIorazione,si eseguisca una colorazione di contrasto con eosina, si osserva assai bene che i granuli più piccoli, che non han no ancor contorno poliedrico, o Thanno appenaaccennato,presentano un punticino centrale viola circondato da un alone roseo relativamente esteso: man mano si consideranogranuli più grossi, si vede la parte centrale viola aumentata d'estensione e Talone roseo relativamente più ristretto, fmchè, nei granuli più grossi, è ridotto ad una sottilissima zona periferica. Nei granuli più piccoli la colorazione dalla parte centrale è viola-chiaro : nei più grossi questa parte centrale ë tinta uniformemente in viola intenso, e, di regola, rotondeggiante e con contorni assai nettamente delimitati (fig. l,m).

Non è raro vedere alcuni dei granuli più grossi assumere una forma oblunga, mantenendosi perô sempre poliedrici, mentre la parte centrale colorata col Gram diviene ovale, in altri assume una forma a biscotto, con una strozzatura mediana più o meno profonda : in altri infine è divisa in due da un setto trasverso che ha lo stesso aspetto dcU'alone periferico e si colora nello stesso modo (fig. l,m).

Quando poi s*adoperino soluzioni acide più concentrate, i conforni dei granuli sono assai poco alterati, ma neirinterno di ogni

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granulo la parte centrale r come raggrinzata, o divisa in granelli o bastoncini irregolari.

Non voglio qui discutere sul signifieato da attribuirsi alla parte centrale colorabile in viola, ed aile varie forme che puô assumere: nolo pero che tutto quanto f u esposto finora dà Timpressione che esistano renlmente nel granulo poliedrico due sostanze : una centrale ed una periferica che si comporlano diversamente di fronte a certi metodi di colorazione, e di fronte a certi reagenti.

Ottenuto in tal modo un mezzo facile e sicuro per riconoscere i granuli poliedrici, ho intraprese ulteriori ricerche su sezioni tras verse del corpo di parecchi Bachi da seta compléta mente sviluppati, ed in vari stadi délia malattia. Come mezzo di fissazione usai Talcool, di rado la formalina.

Anche qui il metododi Qram riusci ottimamente, e si dimostrù tanto più opportuno, inquantochè tutto il rimanente del preparato si scolorava completamente. Al trattamento cou questo metodo feci seguire varie délie colorazioni più in uso nella tecnica istologica e parassitologica ed ho potuto constatare che le più opportune sono : la safranina,remallume<eosina, il metodo di Giemsa. I nuclei dei tessuti si colora vanobene rispettivamente in rosso, in viola, in azzurro: il protoplasma prendeva pure, per quanto assai meno intensamente, la stessa colorazione : nei due ultimi metodi non prendeva afiatto Teosina, la quale si fissava soltanto in alcuni punti, mettendo in evidenza dei particolari, di cui parlerô a suo tempo.

Nei preparati cosi trattati si osservavano, entro la massima parte délie cellule del corpo grasso e di quelle délie trachée, délie speciali formazioni, rotondeggianti, od ovalari, che, da dimension! poco superiori a quelle dei nuclei délie cellule corrispondenti, giungevano ad occupare quasi completamente le cellule stesse. Esse erano più evidenti e tipiche nelle cellule dei corpi grassi, onde di queste ultime mi sono servito, sia come base nella descrizione, sia come modello nelle annesse figure. Alcune di queste formazioni contenevano dei corpi poliedrici nei vari stadi del loro sviluppo; altre, di apparenza più semplice, non ne contenevano : tutte perô si mostravano con tutta evidenza come momenti diversi deirevoluzione di un solo processo. Taie pro-

SUL PARASSITA DEL GIALLUMË DEL BOMBYX MOHI 461

cesso appunto, nei suoi vari momenti, è mio intendimento descrivere :

Il primo accennOjChe iinora ho potuto rilevare,di queste formazioni, si ha nella comparsa, entro il nucleo délie cellule dei vari organi del Baco da seta, di un elemento rotondeggiante (fig. 1, b, c; cfr. con a, nucleo normale), il cui diametropuo raggiungere 8-9 ja, poco colorabile colla safranina e col Giemsa, con nucleo ben évidente e abbastanza intensamente colorabile coi detti colori, rispettivamente in rosso e in azzurro lievemente violaceo, pur esso rotondeggiante, granuloso. talora con qualche vacuolo. Coiremallume questo nucleo non si dillerenzia affatto, colorandosi intensamente tutto Telemento. Questo, che, per ora designero col nome di elemento endonucleare, non ha alcun riscontro nelle cellule normali delForganismo del baco (fig. l,e).

Il nucleo délia cellula ospite si dilata : la cromatina scompare, dapprima attorno aU'elemento endonucleare, quindi grado grado in tutto il rimanente del nucleo, che resta ridotto alla pura membrana (fig. 1, d), Lo spazio compreso fra questa e Tele mento endonucleare resta a questo puntô riempita da una sostanza amorfa finamentegranulare,che si colora collo stesso tono del protoplasma di quesfultimo, maassaî più debolmente. Intanto anche il nucleo deirelemento endonucleare subisce délie alterazioni (fig. l,/'e g): siraggrinza,si spezzetta, e ne rimangonoper lo più sollanto alcuni granuli di cromatina, ben colorati specialmente dalla safranina.

Aquesto punto le formazioni in questione sono cosi costituite (iig. 1,3) : Al centro si vede un corpicciuolo rotondeggiante, ovale odei tutto irregolare, finamente granuloso (il protoplasma deirelemento endonucleare) che racchiude dei granelli o bastoncini di sostanza cromatica, colorati intensamente dai colori nucleari, ma specialmente bène dalla safranina, mentre il rimanente del corpicciuolo si colora in azzurro chiaro col Giemsa, in rosso chiaro colla safranina, in viola-grigiastro coiremallume. Attorno a questo corpo centrale, sta un altro strato granulare, colorato esso pure rispettivamente in azzurro, rosso e viola, ma in tono assai meno intenso, e separato talvolta da esso da un alone chiaro. Eslernamente si nota una parete ben netta (la membrana del nucleo ospite) che si tinge bene coi colori nucleari. Talora a ridosso di questa parete si vedonoancora pochi granuli di cromatina del nucleo ospite (fig. 1 , f)*

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L^elemento endonucleare, che in questo stadio è orroai privo del suo nucleo, e rappresenta quello che nelle pubblicazioni precedenti chiamai, a cagione della sua posizione : « corpicciolo centrale » délie formazioni in questione, è ancora per lo più rotondeggiaote od ovale : présenta tuttavia non di rado délie forme a bastoncino, variamente bozzolute, a C. a rené» annulari, o del tutto irregolari. Talvolta assume la forma di biscotto, di 8, taFaltra se ne osservano due : assai di rado un numéro maggiore.

Non si deve perô, a parer mio, interpretare questo fatto come una divisione deH'elemento, ma piuttosto credo si debba pensare airingresso contemporaneo di dile di tali elementi nello stesso nucleo (fig. !,<;).

Quando si esaminino délie sezioni molto sottili. colorate coiremallume, si vede che Telemento endonucleare consta di una sostanza fondamentale reticolare : questa rete ëfmissima, a maglie assai ristrette, nelle quali stanno numerosi granelli estremamente minuti, tinti in viola chiaro, disposti con sufficiente regolarità. Col Giemsa essi si colorano in azzurro, ed in rosso-rosa colla safranina, ma non si vedono cosi bene differenziati come coiremallume.

NeU'interno deirelemento in questione, la sostanza cromatica si présenta sotto forme assai varie. Non è raro vederne degli ammassi irregolari abbastanza considerevoli, ma per lo più essa è sparsa sotto forma di granuli (fig. 1, /"e g) o di bastoncini (fig. 1, A e ;) ; talora è disposta in lunghi filamenti che partono dal corpo centrale e giungono qualche voltafino alla parete esterna (fig. 1. 1). Quando poi i corpicciuoli centrali sono più d'uno, ognuno di essi contiene una parte di questa sostanza.

Accanto aile formazioni fin qui descritte, se ne vedono altre, di dimensioni maggiori, che, specialmente nello strato esterno, cioë in quella sostanza finemente granulare che ho detto trovarsi fra Telemento endonucleare e la parete esterna, contengono délie granulazioni piuttosto grosse, regolari, tinte elettivamente in rosa coiremallume — eosina e col Giemsa, mentre colla safranina non si diflerenziano sufTicientemente (fig. 1. h). Entro alcune di queste granulazioni si osserva, in altre formazioni più avanzate nello sviluppo, un punticino centrale, tinto in viola dal Gram (fig. 1,;'). Altre formazioni contengono di queste granulazioni più grosse,

più numerose, più intensamente ed estesamente colorate in viola nella parte centrale, mentre l'alone roseo periferico è relativamente più ristretto (fig. 1, k) : altre ancora sono zeppe di granuli poliedrici tipici che riempiono totalmente lo spazio delimitato dalla parete eslerna, mentre il corpicciuolo centrale, che rappresenta il residuo del protoplasma del primitivo elemento endonucleare e racchiude ancora traccie di sostanza cromatica, ë ridotfo

di volume, o non è più visibile, rimanendo nascosto dairammasso di questi granuli (fig. 1, /). La parete estema infine, col disfarsi délia cellula ospite, si rompe, e i granuli poliedrici si versano ne sangue del Baco.

Questi granuli si originano dunque, e si svolgono entro aile formazioni più sopra descritte, e non compaiono mai, almeno da quanto finora mi risulta, quando il nucleo deirelemento endonucleare è integro, anzi, per lo più allorchë di esso rimangono soltanto minute granulazioni o filamenti irregolari.

Ma in quale punto di queste formazioni prendono veramente origine i granuli poliedrici ?

Esaminando attentamente i préparât! colorati coiremallume-

4G4 V. MARzocx:iii

eosiiia e col Gienisa, si vede abbastanza di fréquente entro ai

corpicciuoli centrali, e specialmente a quelli appartenenti a for-

inazioni inenoavanzate nelio sviluppo, alcunigranelli rosei, talora

più piccoli, rua del rimanente uguali a quelli che si vedono nello

strato periferico (fig. 1, /le j), Qualche voila questi granelli sono

posti alla periferia del corpicciuolo, e ne interronipono il contorno,

corne se slessero per uscirne. È molto probabile che quesle granu-

lazioni si formino nel corpicciuolo centrale e vengano raan mano

ricacciate alla periferia» ed il fatto che assai di rado si trovano,

entro il corpicciuolo centrale, dei granuli poliedrici avanzati nello

sviluppo, potrebbe ritenersi corne un argomento in favore di

questa ipotesi.

Riassumendo, nei Bachi da seta alTelti da giallume si osservano degli elenienti cellulari penetrati entro i nuclei délie cellule dei vari organi : questi eleinenti producono nel nucleo che li ospita varie alterazioni (scomparsa délia cromalina, aumento di volume) quindi perdonoessi stessi il loro nucleo, che si spezzetta, e rimane infine rappresentato soltanto da alcuni blocchetti o filanienti irregolari di sostanza cromatica. Compaiono quindi (e di regola soltanto dopo lo spezzettamento del nucleo), entro quelle specie di cisti, la cui parete è formata dalla membrana del nucleo ospite dilata ta e talora inspessita, e nel cui interno sta queslo elemento cellulare circondato da una sostanza finamente granulosa, délie granulazioni regolari che spiccano nettamente per la loro colorazione elettiva coll'eosina. Nella parte centrale di quesle granulazioni appare poi un puulicinocolorato in viola dal (îram : da questo momento si ripetono, sempre neH'interno di dette forhiazioni, i vari stadi e le varie forme osservale negli strisci, fino ad aversi dei granuli poliedrici tipici.

In tutto questo, specialmente poi se corroborato da uno sguardo aile annesse figure, non si pu6 non riconoscere tosto una notevole analogia, nelle linee generali, coi vari stadi che alcune classi di Protozoi sporozoari percorrono, in ([uel periodo del loro ciclo evolutivo che conduce alla formazione degli sporozoiti. Nelle note precedenti, non avendo potuto ancora constatare con cerlezza la presenza d*un nucleo, nel senso istologico délia parola, entro le

formazîoni che fino allora avevo studiateedescritte, non mi ero creduto sufficienlemente autorizzato ad ailermare che si traitasse veramente d'un Protozoo, per quanto avessi già, da un lato, rilevato parecchie strette somiglianze cogli Sporozoari, e dairaitro avessi già riconosciuto, per quanto riguarda la teoria che tendeva ad ailermare che i granuli poliedrici non sono che prodotti degenerati vi, che la grande abbondanza délie f ormazioni entro aile quali si sviluppano i granuli poliedrici, la costanza e la grande regolarità dei vari stadi di sviluppo, il fatto che queste ligure non Yassomigliano a nessuna délie varie forme di degenerazione descritte fmora, sia dei nuclei che del protoplasma, anzi se ne distinguono per molti caratleri, depongono nettamente contro questa teoria.

Ora invece, la constalazioneche ë appunto un elemento nucleato, una cellula, la quale, penetrando nei tessuti dei Bachi, rappresenta il punto di partenza di tutti i sopra descritti fenomeni, ed in tutti gli stadi délia sua evoluzionesi trovacostantemente nei Bachi malati di giaflume, e mai airinfuori di questi, compléta la rassomiglianza sopra accennata, dimostrando definitivamente che siamo di f ronte airagente speciflco del giallume.

Onde, concludendo, possiamo dire che il giallume ë una malattia determinata nei Baco da seta da un parassita Sporozoario che, penetrando nei nuclei délie cellule dei vari organi, li altéra, dilatandoli edistruggendogradatamente neirinterno di essi la sostanza cromatica, riempiendosi lo spaziocompreso fra la parete del nucleo ospite e il parassita, di una sostanza amorfa, finamente granulare. Il nucleo del parassita stessos^altera poi e scompare, rimanendone soltanto qualche residuo che ricorda i cosidetti nuclei dreuliqate d'altri Protozoi; compaiono in seguito i primi inizi degli sporozoiti, sotto forma di corpicciuoli tinti in rosso daireosina, che nei loro ulteriore sviluppo danno luogo alla formazione dei granuli poliedrici tipici. Corne dal granulo poliedrico si possaritornare al parassita endonucleare, non possiamo per ora sospettare neppure in via d*ipotesi.

Moite questioni perù , oltre a questa, rimangono da chiarire intorno a questo parassita : veder bene in quai rapporto i frammenti del nucleo stiano coi corpicciuoli che rappresentano lo stadio iniziale dei granuli poliedrici ; se la sostanza granulare che riempie lo spazio compreso fra il parassita e la parete del nucleo Archives de Parasitologie^ XII, d" 3, 1908. 30

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invaso, dopola scomparsa délia sostanza cromatica di quest'ultimo, e nella quale maturano i granuli poliedrici, rapprenenta un prodotio di degenerazione del tessuto, oppure una dîpendenza del parassita ; quale sia il significato da attribuire al corpo sferico colorabile col Gram neirinterno dei granuli poliedrici e che, corne si vede dalle annesse figure, présenta délie forme che possono interpretarsi corne sladi di divisione. Rappresenta questa un nucleo ed il rimanente il protoplasma, oppure rappresenta tutta la parte vivente délia spora, mentre la sostanza che la circonda non sarebbe che il guscio ?

Certo, finchè queste varie questioni, ed altre ancora non siano risolte, non si potrà dire di avère una netta conoscenza di queslo parassita, ne si potrà decidere a quale classe di Sporozoi esso appartenga. Perciô non ritengo utile per ora discutere intorno al nome generico da attribuirgii, dovendositali discussioni riservare per il momento in cui, risolti molti dei problemi accennati, si potrà classificarlo definitivamente, e rîteago perciô opportuno conservargli per ora il nome generico datogli da Bolle.