GA OTHIERS-VILLARS. G. E. SCHULZE
Sciences exactes et naturelles.
LA BIOLOGIE D’UNE BACTÉRIE PIGMENTAIRE
PAR
Habitat et isolement dn Bacillus cyaneo-fuscus.
„Colle forte noire.” „Fromage bien/’
En février 1888 je reçus de M. van Lookeren Campagne l), à cette époque chimiste de la fabrique de gélatine de Delft, un échantillon de colle forte colorée en noir et qui, d’après les essais auxquels il l’avait soumise, transmettait facilement par contagion cette couleur à une colle saine, qu’elle rendait ainsi impropre aux usages ordinaires. Je pus m’assurer de l’exactitude de cette observation, et remarquai en outre que, pour reproduire le phénomène avec la même intensité dans des expériences successives, il fallait augmenter progressivement la dose de matière servant à l’inoculation ; autrement, les bactéries étrangères faisaient obstacle par leur pullulation excessive. La colle noire exhalait une odeur particulière, rappelant celle du sulfure d’ammonium, et elle formait beaucoup plus difficilement gelée que la colle saine.
Dans la fabrique, il fut bientôt reconnu que la cause delà calamité résidait dans un tuyau malpropre, à travers lequel
1 ) Actuellement directeur de la station agronomique à Hoorn.
Arhives Néerlandaises, T. XXV. 16
M. W. BEYERINCK.
avait passé de l’eau venant d’un des canaux de la ville, et qui ensuite avait été employé à conduire dans les bassins en tôle, pour s’y prendre en gelée, la dissolution de colle. Aussitôt que ce tuyau eut été nettoyé à fond, l’accident malencontreux cessa de se produire.
Mes premières tentatives pour isoler la bactérie que je supposais être la cause déterminante du phénomène n’eurent aucun succès.
Comme j’avais dès l’abord observé que l’accès de l’air favorisait la coloration en noir, de sorte qu’il ne pouvait guère être question d’anaérobiose, j’étais curieux de savoir pourquoi un organisme, si manifestement apte à vivre dans la gélatine, ne pouvait être isolé par la méthode de la gélatine. Mais l’explication de ce fait ne se présenta que beaucoup plus tard, après que d’autres sources m’eurent fourni une bactérie pigmentaire au moyen de laquelle je pus provoquer artificiellement, avec des phénomènes identiques, la coloration en noir de la colle. Je reconnus alors que la contradiction apparente tenait à la facilité avec laquelle cette bactérie éprouve un affaiblissement de sa force végétative, à la suite duquel elle n’est plus capable de vivre sur une masse nourricière solide, tout en pouvant encore se développer très bien dans un milieu liquide. Je trouvai en outre que cet affaiblissement était dû à ce que les essais d’inoculation avaient eu lieu à environ 20° C, température qui pour peu de temps est à la vérité très favorable à l’accroissement, mais dont l’action prolongée détermine une dégénérescence.
Telle a été ma première rencontre avec la bactérie pigmentaire dont la description fera l’objet des pages suivantes et que je propose d’introduire dans la science sous le nom de Bacillus cyaneo-fuscus.
Ce microbe est aussi la cause, ou du moins l’une des causes, d’une altération assez fréquente dans les fromages de Hollande, surtout dans ceux dits „d’Edam”, altération qui, sous le nom de „bleu”, est très redoutée des fabricants de ces produits et sur laquelle je reviendrai au § 8 du présent Mémoire.
LA BIOLOGIE üWe BACTERIE PIGMENTAIRE. 229
Le fromage toutefois, pas plus que la colle forte, n’est le séjour naturel du Bacillus cyaneo-fuscus, car dans la masse caséeuse cette bactérie ne subit pas seulement un affaiblissement, comme dans la colle, mais elle y meurt bientôt, par suite de la formation d’acide sous l’influence de ferments lactiques. L’habitat proprement dit doit donc se trouver ailleurs, et mes recherches ont appris qu’à cet égard le premier rang, tout au moins, revient au sol et à l’eau.
Abstraction faite des expériences exécutées avec du fromage, et dont il sera parlé plus loin, j’ai trouvé et isolé le Bacillus cyaneo-fuscus à six reprises différentes. Il ne me semble pas superflu de mentionner ces cas séparément, vu que j’ai à y rattacher quelques remarques assez intéressantes.
La première fois, je rencontrai notre bactérie, en colonie unique, parmi une cinquantaine de colonies de quelques autres espèces, à l’occasion de l’examen d’une infusion colorée, obtenue en laissant séjourner dans de l’eau de conduite quelques racines de Vicia Faba !). La colonie s’était formée sur une gélatine nourricière qui ne contenait qu’une décoction assez concentrée de tiges de Fève et du sucre de raisin. Elle liquéfiait très fortement, et produisait une matière bleue diffusive, tandis que, dans la colonie elle-même, les bacilles morts étaient colorés en brun assez foncé.
Dans deux autres cas, l’ensemencement eut lieu sur une gélatine contenant de l’extrait de malt. L’une fois, on avait opéré avec une eau ayant servi à nettoyer des cuves à fermentation; l’autre fois, avec une eau analogue, qui avait traversé un tuyau ordinairement employé à conduire de la drèche fermentée. L’eau provenait d’un des canaux de la ville.
• ) La coloration bleue ou violette, qu’on observe si fréquemment lorsque des plantules vivantes de Vicia Faba ont été abandonnées à elles-mêmes dans une eau de conduite très légèrement alcaline, est due à une réaction tannique, exercée par un produit de décomposition des poils et des cellules épidermiques de la radicule sur les combinaisons ferrugineuses de l’eau, réduites par des bactéries.
M. W. BEYERINCK.
Les colonies présentaient les mêmes propriétés que dans le cas précédent et étaient caractérisées surtout par la teinte bleue de la matière colorante diffusive, qui doit peut-être les faire distinguer, comme variétés, de la forme suivante ').
Des expériences directes, avec l’eau de canal, ont fourni dans un cas le Bacillus cyaneo-fuscus. La semence, c’est-à-dire l’eau, avait été versée à la surface d’une gélatine dissoute dans l’eau pure, sans la moindre addition de matière nutritive. La gélatine elle-même avait donc fonctionné comme aliment, et la matière colorante diffusée, au lieu d’être bleue comme dans les cas précédents, avait une couleur brun foncé.
Sur un terrain de culture entièrement semblable à celui dont il vient d’être question, des colonies de Bacillus cyaneofuscus furent ensuite obtenues dans un seul cas en l’arrosant d’eau de conduite pure, dans d’autres cas par l’ensemencement d’une portion du contenu d’un vase de verre, consistant en eau de conduite additionnée d’un peu de carbonate de magnésie, de Vio% de sulfate d’ammoniaque, de traces de phosphate de potasse, et, comme matière infectante, d’une trace de terre humeuse. Dans ce vase, où les matières organiques provenant de la terre servaient d’aliment aux bactéries et où il se formait beaucoup de nitrite aux dépens du sel ammoniacal, notre bacille s’était manifestement multiplié, car on en obtint, par un seul ensemencement, une demi-douzaine de colonies.
Cette observation conduisit à essayer de cultiver le B. cyaneofuscus directement au moyen de la terre, et par cette méthode aussi on obtint, dans un cas, un résultat positif.
En considérant l’ensemble de ces différentes sources naturelles, nous voyons que notre bacille pigmentaire, à l’état de liberté, se rencontre toujours dans des solutions nourricières très diluées. Comme les premiers des ensemencements ci-dessus mentionnés avaient toutefois eu lieu sur une gélatine assez concentrée, contenant de l’extrait et du sucre, il était d’emblée
i ) Des expériences postérieures ont mis hors de doute que les bactéries pigmentaires de ces trois provenances sont différentes du B. cyaneo-fuscus.
LA BIOLOGIE d’üNE BACTERIE PIGMENTAIRE
évident que ces terrains plus riches devaient également convenir, au moins conditionnellement, à la végétation du bacille. Mais quand, sans connaissance spéciale de la biologie de celui-ci, j’essayai de faire, avec les colonies développées sur ces masses concentrées, de nouvelles inoculations, en laissant parfaitement identiques les conditions nutritives et thermiques, il se trouva que dès la seconde ou la troisième réinoculation la croissance avait entièrement cessé. Lorsqu’on réinoculait la matière première qui s’était développée sur le terrain nutritif peu concentré, les végétations pouvaient encore supporter plusieurs fois la rénovation; toutefois, dans ce cas aussi, elles finissaient par s’éteindre complètement, de sorte qu’après environ six semaines toute expérimentation ultérieure était devenue impossible, et que, pour obtenir de nouveaux matériaux d’étude, je devais en revenir au contenu du vase de verre et procéder à un nouvel isolement. Ce singulier résultat m’est resté assez longtemps énigmatique, jusqu’à ce que finalement une très remarquable influence thermique, donnant lieu à des changements héréditaires, fut reconnue, sinon comme la condition unique, — car la concentration de l’aliment exerce déjà par elle-même une certaine action, — au moins comme la condition essentielle de la perte de la faculté végétative. Nous verrons plus tard en quoi cette influence consiste ; ici, je me borne à noter que mes expériences d’alors étaient exécutées à la température ordinaire d’appartement en été, de sorte que les cultures eurent à subir parfois une chaleur de 25° C, et pendant un temps plus long des températures voisines de 20° C, bien que le plus souvent je pus les maintenir au-dessous de 20° C, à savoir, aux environs de 17° C.
Description de la forme active du Bacillus cy aneo-fuscus.
Les bactéries directement provenues de leurs stations naturelles, aussi bien que celles qui en ont été obtenues, dans
M. W. BEYERINCK.
des conditions de température appropriées, par la culture sur diverses masses nutritives solides ou liquides, possèdent les propriétés suivantes.
Les colonies (PI II, fig. 1), en s’accroissant, liquéfient la gélatine nourricière, avec une intensité variable, suivant que cette gélatine contient plus ou moins de peptone et suivant le degré d’activité végétative des bactéries elles-mêmes. Faisons, pour le moment, abstraction de cette dernière circonstance, et occupons-nous de l’influence exercée sur les phénomènes du développement par les matières nutritives. Avant tout, il faut dire que les expériences dont il va être question ont eu lieu à des températures qui ne dépassaient que de peu 6° C, le plus souvent même restaient un peu au-dessous de ce degré, et se rapprochaient rarement, et seulement pour peu de temps, de 10° C, limite qui ne fut jamais franchie. Pendant les mois d’été, ces basses températures, à variations très lentes, furent trouvées dans une cave, soit sur le sol pavé en briques, soit sur des tables de bois; en hiver, au contraire, on les trouvait dans le laboratoire, sur une table de pierre placée devant une fenêtre.
Dans ces conditions, un accroissement très énergique et une très forte liquéfaction s’observent lorsque, pour toute nourriture, il n’est offert aux bactéries que de la gélatine, sans addition d’aucune sorte. Les colonies qui se forment ainsi sur des couches épaisses de gélatine, contenues dans des boîtes de verre, sont passablement fluides et consistent en gélatine liquéfiée dans laquelle est suspendue une masse bactérienne brun noirâtre ( b s, fig. 1) ; de cette masse fluide il se diffuse dans la gélatine une matière colorante brun pur (dz, fig. 1), qui toutefois n’est jamais vue jusqu’à de grandes distances, probablement parce qu’elle subit de la part de l’air une lente oxydation, dont le produit ne serait pas susceptible de diffusion. La colonie fluidifiée a manifestement un grand pouvoir d’attraction sur l’eau, grâce auquel elle arrive bientôt à faire saillie, sous forme de goutte convexe, au-dessus de
LA BIOLOGIE d’üNE BACTERIE PIGMENTAIRE 233
la gélatine. Si toutefois cette dernière renferme un peu de peptone (a % est déjà suffisant), toute l’eau de la colonie est attirée dans la couche de gélatine, d’où il résulte, comme on le voit représenté dans la fig. 1, une cavité tapissée intérieurement d’une couche de bactéries.
L’examen microscopique des colonies y fait distinguer trois ou quatre éléments figurés différents, à savoir: des bactéries en bâtonnet, vivantes, incolores, ordinairement mobiles; des corps bactériens morts, colorés en brun intense, des sphérites ou cristaux de carbonate de chaux, qui peuvent cependant manquer, et des grains de pigment. De ces derniers, il sera, plus loin, traité à part. Ici, je dirai quelques mots des bactéries elles-mêmes.
Celles-ci sont des bâtonnets de longueur variable (a, fig. 5). Si, comme on l’a supposé, la gélatine a été leur unique aliment, elles sont passablement longues et d’une épaisseur (Ou,2 à 0',3) environ égale à la moitié de celle des bacilles du foin, de sorte qu’elles doivent être rangées parmi les espèces très déliées. Ce dernier caractère ressort encore plus quand on examine des cultures liquides, par exemple, des cultures peptonées («, fig 4 a) ; les bâtonnets, alors aussi très raccourcis et longs seulement de 0(,,3 à 0",6, n’y ont souvent plus que 0 ,15 d’épaisseur. Les mouvements et la forme n’ont d’ailleurs rien de caractéristique et rappellent, dans les cultures peptonées, le schème primitif donné par M. Cohn pour le Baderium termo. Le B. cyaneo-fuscus est une bactérie rigoureusement aérobie; les bâtonnets mobiles cherchent avec ardeur l’oxygène, ce qui occasionne souvent des rassemblements autour de bulles d’air accidentellement incluses dans les préparations microscopiques. Dans la profondeur des masses de gélatine ou de colle, ils ne croissent que si l’air peut y pénétrer librement. Vis-à-vis du bleu d’indigo soluble, ils montrent un pouvoir réducteur bien prononcé, mais pour le démontrer il faut recourir à des cultures qui sont déjà très riches en bactéries, et dans lesquelles, après l’addition de la préparation d’indigo, — c’est-à-dire d’une dissolution
M. W. BEYERINCK.
bien stérilisée d’indigosulfate de sonde dans l’eau, — l’air ne peut pénétrer que très lentement. Le bleu d’indigo ordinaire, insoluble, n’est pas attaqué.
En ce qui concerne les bâtonnets morts, qui absorbent la matière colorante sécrétée ((?, fig. 4a, /S, fig. 5), je remarquerai seulement qu’ils se présentent dans toutes les nuances depuis le brun verdâtre ou jaunâtre jusqu’au brun noirâtre foncé.
Comme masse nourricière nous avons employé, pour les expériences dont il s’agit ici, une dissolution de 10 % de gélatine dans de l’eau de canal. Des dissolutions plus étendues, par exemple de 4 ou 5 % de gélatine, — dissolutions qui, on le sait, se prennent encore bien en masse lorsque la gélatine est de bonne qualité 1 ), — se laissent également employer avec succès pour les modifications plus actives du B. çyaneo-fuscus, et donnent des phénomènes tout semblables à ceux décrits plus haut. C’est là une circonstance très remarquable, car beaucoup d’autres bactéries, qui ne demandent également que de la peptone pour leur entretien complet, — et qui par conséquent peuvent aussi vivre de gélatine seule, celle-ci étant peptonisée par un enzyme sécrété, — ne se développent que très peu dans les conditions indiquées, et exigent pour cela, en premier lieu, une addition de phosphate. Pour le B. cyaneofuscus, toutefois, une pareille alimentation phosphatée est non seulement inutile, mais plutôt, quand la dose ajoutée dépasse J/10 ou Vs °/o (suivant le plus ou moins d’activité des bactéries), préjudiciable au développement de l’organisme aussi bien qu’à la sécrétion du pigment. On peut juger par là combien l’aliment doit être dilué pour que ce bacille pigmentaire s’en trouve le mieux.
i) La gélatine dont on a extrait les dernières traces des sels au moyen de l’eau distillée, se prend encore tout juste en gelée quand elle est dissoute, dans l’eau distillée, à raison de 2 à 3 °/0. Encore plus étendues, les solutions ne se solidifient plus et la gélatine se montre, après refroidissement, en masses gélatineuses incohérentes. Dans l’eau froide la gélatine est parfaitement insoluble.
LA BIOLOGIE d’üNE BACTÉRIE PIGMENTAIRE
Une propriété très remarquable des cultures sur plaques de gélatine pure, c’est de donner lieu à des accumulations de carbonate de chaux (*, Fig. 5), tant à l’intérieur de la masse fluide des colonies que dans l’étendue des zones de diffusion br unes (dz fig. 1), mais non en dehors de ces dernières. Lorsqu’on trace une simple ligne d’inoculation à la surface d’une large et épaisse plaque de gélatine, en sorte que sur une très grande masse de cette matière il ne se développe qu’un petit nombre de bactéries, on obtient au bout de quelques mois un si abondant dépôt de carbonate de chaux, que la gélatine, arrosée d’acide chlorhydrique, se couvre d’écume et se remplit de bulles de gaz. Ce carbonate de chaux provient du gypse de l’eau employée. Quant au composé sulfuré qui doit se former en même temps, je ne puis rien en dire.
Ce serait ici le lieu de préciser les relations d’affinité de notre bacille. Mais, étant encore dans une profonde ignorance au sujet du système naturel des Bactéries, nous ne pouvons procéder que d’une manière empirique xet devrons, dans le cas actuel, nous appuyer principalement sur la production du pigment. Pour cette raison, il sera traité de ce point au § suivant.
Le pigment du Bacillus cy aneo -fuscus. Division des bactéries chromogènes en espèces chromophores, chromopares et parachromophores.
Un mot sur la relation des pigments des bactéries chromogènes avec leurs générateurs, et vice versa, ne me semble pas superflu, vu surtout que, à ma connaissance, personne n’a encore insisté compréhensiblement sur les cas très différents que l’on rencontre ici.
On peut distinguer parmi ces bactéries trois groupes principaux, qui se laissent peut-être assez convenablement désigner
M. W. BEYERINCK.
sous les noms de bactéries chromophores, b. chromopares et b. paraçhromophores .
Chez les bactéries chromophores , la matière colorante fait partie intégrante du corps, auquel elle est unie de la même façon que la matière colorante chlorophyllienne l’est aux chromatophores des plantes supérieures, ou l’hémoglobine aux corpuscules du sang. Comme exemple de bactéries chromophores, je citerai les bactéries sulfurées pourpres, décrites par Ray Lankester, Warming, Cohn, Engelmann et Winogradsky. A ce même groupe appartiennent, en tant qu’elles me sont connues, les bactéries vertes, rouges, jaunes et brunes qui ne liquéfient pas la gélatine. Il ne peut y avoir aucun doute que, chez toutes ces formes chromophores, une signification biologique déterminée, quoique le plus souvent encore inconnue, ne doive être attribuée à la matière colorante.
Comme second groupe des bactéries chromogènes j’ai nommé les b. chromopares, qui pourraient aussi être appelées bactéries pigmentaires proprement dites. Celles-ci sont caractérisées par le fait que, initialement, le corps bactérien vivant est toujours incolore; la matière colorante est séparée comme telle ou comme matière chromogène incolore, et on ne doit y voir qu’un produit d’excrétion, sans utilité pour l’organisme. En accord avec ce fait, les bactéries chromopares se laissent amener tout aussi bien, ou même plus facilement, à l’état de cultures incolores qu’à celui de cultures colorées. L’exemple le plus connu de vraie bactérie pigmentaire est le Bacillus prodigiosus, dont la matière colorante ne se diffuse pas en dehors des colonies, mais s’unit à des particules albuminoïdes, formées peut-être par les bactéries. Il est à remarquer que les B. prodigiosus morts ne fixent pas le pigment rouge, tandis que des cellules mortes de levure de bière diffusée dans les colonies, ou même dans les cultures liquides du: B. prodigiosus , le font avec beaucoup d’énergie, en devenant rouge carmin. Notre Bacillus cyaneo-fuscus appartient également à ce groupe, de même que les bacilles, plus ou moins alliés au B. cyaneo-fuscus,
LA BIOLOGIE d’üNE BACTÉRIE PIGMENTAIRE
du lait bleu ( Bacillus cyanogenus ), du pus bleu (B. pyo-cyaneus) et des crachats verts (B. virescens). Chez ces quatre dernières espèces, le pigment est susceptible de diffusion, mais, à cause d’une transformation chimique (probablement une oxydation faisant naître un corps difficilement soluble) qu’il éprouve, cette diffusion ne s’étend pas à grande distance. Ce même pigment a beaucoup d’affinité pour certaines matières albuminoïdes et se fixe avidement sur les bactéries mortes, qui par là sont colorées en brun foncé ou en noir.
Le troisième groupe des bactéries chromogènes a été appelé celui des parachromophores. Elles se distinguent en ce que la matière colorante est, à la vérité, manifestement un produit d’excrétion, mais qui adhère au corps bactérien, comme chez les vraies bactéries chromophores, ne diffusant pas au dehors. A ce groupe se rapportent les Bacillus janthinus et violaceus , si abondamment répandus dans le sol et dans l’eau.
La question de savoir si une espèce de bactérie est chromophore ou parachromophore se laisse ordinairement décider déjà par la circonstance que les vraies chromophores, cultivées dans les conditions les plus variées, se développent — à moins qu’il ne naisse des variétés incolores — en colonies colorées, tandis que chez les fausses chromophores cela n’arrive, pour ainsi dire, qu’à titre d’exception.
Pour obtenir, par exemple, le Bacillus violaceus en cultures violettes, on doit le traiter dans des conditions exactement déterminées, notamment à basse température, et ne lui offrir pour tout aliment que des matières protéiques, avec très peu de phosphates; autrement, cette forme se développe comme une bactérie saprophyte incolore très commune. Les bactéries chromophores aquatiques non liquéfiantes, rouges ou jaunes, restent au contraire, lorsqu’elles arrivent à se développer, rouges ou jaunes.
Je n’affirmerai certes pas que la division qui vient d’être établie soit une distribution naturelle, car pour cela je connais trop peu d’espèces chromogènes; bien plutôt, je suis porté à croire que dans l’avenir on reconnaîtra chez ces organismes
M. W. BEYERINCK.
encore maintes autres différences, plus profondes, qui conduiront peut-être à un groupement tout nouveau. Il est certain, en tout cas, que nos chromophores embrassent beaucoup de choses hétérogènes, tandis que, d’autre part, les vraies bactéries pigmentaires (à l’exception du Bacillus cyanogenus) ont, non seulement entre elles, mais aussi avec les parachromophores, une affinité si grande, que ces deux groupes peuvent sans inconvénient être réunis en une même famille naturelle.
Ainsi qu’il a été dit précédemment, le Bacillus cyaneo-fuscus appartient aux chromopares, c’est-à-dire, aux vraies bactéries pigmentaires. Nous avons déjà vu que cette espèce excrète une matière colorante brune, diffusible. Si, toutefois, on étudie plus attentivement cette excrétion, par exemple, en cultivant la bactérie dans de l’eau de conduite additionnée de | à 2 pour cent de peptone sèche, on acquiert la conviction que le brun n’est qu’un stade avancé de la série des changements éprouvés par un produit de sécrétion qui, à l’origine, était coloré tout différemment, ou peut-être incolore. En tout cas, la première coloration visible est un beau vert soluble dans l’eau (fig. 3 a), qui bientôt se présente accompagné d’un bleu d’outremer (fig. 3 b). Au microscope (fig. 4 a), ce bleu se montre composé de sphérites solides, microscopiques (/, fig. 4 a), sur lesquelles nous reviendrons tout à l’heure. Plus tard seulement, le vert disparaît, pour faire place d’abord au brun (fig. 3 b), puis au gris (fig. 3 c), et enfin au noir brunâtre foncé (fig. 3 d). Les sphérites bleues sont beaucoup plus résistantes, mais peuvent pourtant se changer finalement en corpuscules brun foncé ou même noirs ( d , fig. 5). Je crois que tous ces changements de couleur doivent être ramenés à des degrés successifs d’oxydation d’un seul et même chromogène, bien que, lors de la réduction de ces produits oxydés, on ne voie apparaître qu’un corps très légèrement coloré en jaune, sans que les divers stades de coloration, ci-dessus indiqués, soient parcourus en ordre rétrogade.
Sous l’influence d’oxydants énergiques, tels que l’acide ni-
LA BIOLOGIE d’üNE BACTERIE PIGMENTAIRE.
trique, l’acide chromique et le peroxyde d’hydrogène, la matière colorante, qu’elle soit diffusible ou bien retenue par les sphérites, est rapidement et assez complètement décomposée et décolorée (fig. 3 é). Les corps à action plus faible, l’air entre autres, déterminent également la décomposition, mais exigent pour cela un temps beaucoup plus long. Veut-on, par exemple, décolorer une solution de peptone devenue noire par le développement du Bacillus cyaneo-fuscus , on y parvient aisément en quelques heures au moyen de l’acide nitrique dilué, tandis que le même effet n’est produit par l’air, et encore moins complètement, qu’au bout de plusieurs semaines
Les belles sphérites bleues possèdent des propriétés très intéressantes. On les obtient le mieux de la manière suivante. Une solution de 1 à 3 % de peptone dans de l’eau de conduite, après avoir été bien stérilisée par une ébullition trois fois répétée, est ensemencée de B. cyaneo-fuscus , puis abandonnée à elle-même, à une température plus basse que 10° C. Au bout de quatre ou cinq jours, la couleur jaune pâle de la solution de peptone se change en une couleur verte, qui est surtout intense à la surface, où l’air a librement accès. Très peu de temps après, commence la formation des sphérites, dont la matière colorante est évidemment un produit d’oxydation, car elle ne se montre que dans la pellicule bactérienne qui surnage le liquide, ainsi que dans un anneau touchant, à un niveau un peu inférieur, la paroi du vase de verre, là où se trouve le ménisque du liquide. Ce dernier phénomène est très caractéristique, vu que la couleur de l’anneau est d’un beau bleu, à reflet d’or comme chez l’indigo sec, et peut naturellement, quand on secoue le vase, être observée directement. L’anneau persiste d’ailleurs longtemps et se laisse encore reconnaître dans des cultures déjà assez âgées. Finalement, le changement général de la couleur du liquide, qui conduit d’abord au noir, puis au brun clair, atteint aussi l’anneau. Les sphérites sont plus ou moins solubles dans les acides forts, d’autant plus facilement que leur bleu est plus pur, d’autant plus incomplètement qu’elles sont de couleur
M. W. BEYERINCK.
pins noirâtre. L’acide sulfurique surtout est un bon dissolvant ; il donne avec les sphérites une dissolution bleue, qui bientôt devient violette et finalement se décolore. Souvent on voit, pendant l’acte de la dissolution, se former d’abord des aiguilles de gypse et ensuite, à ce qu’il semble, des prismes de tyrosine. Le gypse provient du carbonate de chaux qui se trouve dans le liquide de culture et qui paraît s’accumuler dans les sphérites. Quant à l’origine des cristaux que je viens de désigner comme prismes de tyrosine, elle reste douteuse. En tout cas, cette substance ne forme pas la base proprement dite des sphérites, car alors celles-ci ne seraient pas solubles dans l’acide sulfurique.
Comment faut il donc se représenter la nature des sphérites ?
Je crois avoir trouvé la réponse à cette question dans l’expérience suivante.
Les agents réducteurs énergiques, en particulier l’hydrosulfite de soude, Na HSO2 , découvert par M. Schützenberger et recommandé par lui pour le titrage de l’oxygène 1 ), décolorent complètement les sphérites. Si l’action se passe sous le couvreobjet, il est facile d’obtenir des corpuscules entièrement décolorés, qui correspondent aux sphérites. Donne-t-on alors accès à l’air, le liquide devient d’un beau bleu d’outremer, tandis que les sphérites peuvent rester incolores. Pour cette expérience, l’hydrosulfite doit être presque neutre, n’avoir qu’une réaction acide très faible; autrement, les squelettes incolores des sphérites se dissolvent complètement. On constate d’ailleurs aussi une différence de solubilité suivant que les sphérites ont pris naissance dans des solutions de peptone ou dans des liquides contenant d’autres corps protéiques. Notre expérience conduit à conclure que la question ci-dessus posée doit recevoir
i) Schützenberger, Les fermentations , 4e éd. p. 92, Paris, 1884. Ce corps s’obtient en dissolvant du zinc dans le bisulfite de soude et ajoutant à
la dissolution étendue du lait de chaux, jusqu’à sursaturation. La soustraction d’oxygène a lieu par suite de la transformation de l’hydrosulfite en
bisulfite, suivant l’équation Na HSO 2 + O = Na HSO 3.
LA BIOLOGIE ü’uNE BACTERIE PIGMENTAIRE.
la réponse suivante: Les sphérites sont des sphérocristaux d’une matière colorante bleue; les aiguilles cristallines du sphérocristal ont pour support un squelette constitué par un corps protéique.
En étudiant la formation des sphérites au microscope, on trouve qu’elle est analogue mais pas identique à celle des corpuscules chromatiques irréguliers dans les colonies du Bacillus prodigiosus (voyez plus haut), c’est-à-dire, qu’elle a lieu dans notre cas par l’accumulation de la matière colorante dans les corps de bactéries en voie de dépérissement, corps qui gonflent alors fortement et peuvent prendre les formes les plus bizarres. Le corps protéique qui sert de base à ces sphérites, qui en constitue pour ainsi dire la charpente primitive, est donc le protoplasma bactérien lui-même. Cela étant, il n’y a pas lieu de s’étonner que d’autres corpuscules protéiques, présents dans les cultures, puissent également, s’ils possèdent de l’affinité pour la matière colorante, se changer en sphérites. Il est à remarquer que les sphérites de l’hémialbumine, qui se déposent de solutions peptoniques étendues, ne se colorent pas.
L’affinité des sphérites pour le carbonate de chaux remet en mémoire les remarquables calcosphérites découvertes par Harting !), qui consistent en un squelette d’un corps protéique, — appelé par lui, suivant les cas, calcoglobuline ou calcofibrine, — dans lequel les aiguilles calcaires microscopiques, réunies en globules, sont disposées radialement. Pour accroître encore l’analogie, je rappellerai que Harting a pu imbiber ses calcosphérites de matières colorantes de la bile et leur communiquer ainsi une coloration intense * 2). Ces matières colorantes n’étaient toutefois pas accumulées dans les sphérites, comme c’est le cas ici, à l’état cristallisé, mais à l’état amorphe.
Nous avons vu plus haut que les sphérites du B. cyaneo-fuscus
1) Recherches de morphologie synthétique sur la production artificielle de quelques formations calcaires organiques , Amsterdam, 1872.
M. W. BEYERINCK.
se dissolvent complètement dans les acides et les alcalis ; leur base bactérienne, à laquelle on aurait supposé une plus grande faculté de résistance, analogue à celle du protoplasma bactérien en général, a donc subi une modification chimique.
La matière colorante bleue rappelle à plusieurs égards le bleu d’indigo. D’abord, à l’égard de l’oxydation par l’acide nitrique, pendant laquelle se produisent les mêmes nuances de couleur, aboutissant finalement au brun jaunâtre. Ensuite, quant à l’action, ci-dessus décrite, de l’acide sulfurique concentré et des alcalis forts. Dans l’éther, l’alcool, la benzine, l’essence de pétrole, l’alcool amylique, le sulfure de carbone, le chloroforme froid ou bouillant, notre matière colorante se laisse tout aussi peu dissoudre que le bleu d’indigo. Mais l’analogie principale réside certainement dans la manière de se comporter vis-à-vis des agents réducteurs, et sous ce rapport je citerai encore une expérience très simple, qui se rattache étroitement à l’observation microscopique dont il a été question plus haut.
Lorsque le B . cyaneo-fuscus est cultivé dans de l’eau de conduite additionnée de 2 ou 3 % de peptone, il se forme à la surface du liquide une pellicule bactérienne très mince, mais pourtant assez consistante, d’une belle couleur bleue. Au microscope on y trouve, comme il est dit, disséminées entre les bâtonnets étroitement rapprochés, des sphérites bleues de toutes les grosseurs.
Si une pareille pellicule bleue (fig. 4 b) est enlevée du liquide à l’aide d’un fil de platine, puis introduite dans une éprouvette remplie de dissolution d’hydrosulfite de soude, la couleur du petit flocon ne tarde pas à se changer, par suite de la réduction, en brun sale, et la cohérence des bactéries est diminuée par l’alcalinité du liquide. Ce flocon relâché est-il alors retiré avec précaution de l’éprouvette, — et cela dès que la décoloration paraît accomplie, — puis transporté dans une goutte d’eau sur une assiette de faïence blanche, on voit la matière colorante, réduite et dissoute dans le flocon, redevenir d’un bleu intense sous l’action de l’oxygène contenu dans la goutte d’eau, exactement comme le ferait le blanc
LA BIOLOGIE D’UNE BACTERIE PIGMENTAIRE
d’indigo. En regardant ce liquide bleu au microscope, on reconnaît que le corps colorant ne s’y trouve pas dissous, mais suspendu en particules très ténues (peut-être globuleuses).
Bien entendu, je sais parfaitement que ces données ne suffisent pas pour l’identification positive de notre matière colorante avec le bleu d’indigo; de nouvelles recherches, qui maintenant ne présenteront plus de difficultés particulières, devront trancher la question.
Avant d’abandonner ce sujet, je dois encore faire remarquer que, dans celui des stades initiaux d’une culture (fig. 3a) qui est caractérisé par la couleur vert de vessie, on ne peut observer nettement aucun phénomène de réduction au sein du liquide, bien que près de la surface la couleur soit un peu plus foncée que ]à où l’air ne trouve pas un libre accès. En tout cas, les bacilles ne possèdent donc pas un pouvoir réducteur appréciable à l’égard de leur propre matière colorante. On peut se demander comment ils se comportent sous ce rapport visà-vis du bleu d’indigo soluble, et aussi, inversement, si d’autres bactéries, qui réduisent énergiquement le bleu d’indigo, sont capables de décolorer les cultures de B. cyaneo-fuscus.
La première de ces questions doit être résolue en ce sens que des cultures vigoureuses de notre bactérie réduisent le bleu d’indigo ' ) ; cela, toutefois, demande beaucoup de temps, et exige donc l’usage de vases où l’air ne puisse pénétrer que très lentement, par exemple, de ballons à col étroit.
Le. B. cyaneo-fuscus ne réduit pas, au contraire, son propre pigment bleu-noirâtre, car on voit celui-ci, dans l’expérience avec le bleu d’indigo soluble, communiquer peu à peu, à partir de la surface, la coloration foncée originale à la dissolution qui contient du blanc d’indigo. Il serait inconsidéré, toutefois, d’en conclure que notre bactérie est absolument incapable de réduire
i) Je ne connais encore aucune bactérie, liquéfiant la gélatine, qui ne réduise pas le bleu d’indigo soluble. Par contre, je puis citer plusieurs formes non liquéfiantes auxquelles ce pouvoir fait défaut, par exemple, le B. radicicola.
Archives Néerlandaises, T. XXV.
M. W. BEYERTNCtf.
son propre pigment. En effet, les sphérites bleues fussent-elles réellement composées principalement de bleu d’indigo *), il n’}r aurait pas encore lieu de s’étonner qu’un pareil corps coloré solide, précisément à cause de sa solidité ne pouvant pas se diffuser dans 1a. bactérie, ce qui semble pourtant nécessaire pour la réduction, reste inaltéré.
• La seconde question, à savoir, si d’autres bactéries que j’ai soumises à cette expérience sont en état de réduire les pigments du B. cyaneo-fuscus, doit être résolue par la négative. Cela s’applique, notamment, aux ferments lactiques du fromage d’Edam, lesquels exercent une forte action réductrice sur le bleu d’indigo. On comprend ainsi pourquoi les taches foncées du fromage, qui sont dues à une infection par le B. cyaneofuscus , conservent invariablement leur couleur, bien qu’elles regorgent ordinairement de bâtonnets du ferment lactique. Au § 9 nous reviendrons d’ailleurs sur la matière colorante des taches bleues du fromage, quoique je n’aie pas grand’ chose à ajouter en fait de détails vraiment nouveaux.
Nutrition du Bacillus cy aneo-fuscus.
Notre bacille pigmentaire se range, sous le rapport des matières nutritives reconnues nécessaires, parmi les organismes à peptone, c’est-à-dire que, pour aliment plastique complet, suffisant au développement de tous les phénomènes biologiques, il ne demande, en dehors des sels, qu’un corps albuminoïde. Comme tel, on peut prendre la peptone sèche, la gélatine, le blanc d’œuf, la fibrine, le gluten, la caséine, et probablement toute une série d’autres corps protéiques.
Dès que ce point eut été fixé, j’exécutai les expériences suivantes.
i) Actuellement, je suis convaincu que le corps pigmentaire des sphérites de couleur bleu pur est bien réellement du bleu d’indigo, ou une matière très voisine; dans les sphérites colorées en d’autres nuances je soupçonne, comme dans les cultures liquides de couleur analogue, des produits de l’oxydation de l’indigotine.
LA. BIOLOGIE d’uNE BACTERIE PIGMENTAIRE. 245
Un œuf cuit dur fut soigneusement dépouillé de sa coque, flambé à un bec de Bunsen, puis placé dans une boîte de verre bien propre. Il fut alors inoculé en différents points de la surface avec une culture de B. cyaneo-fuscus et abandonné à lui-même, à une température de 6 à 10° C. Au bout de trois jours, un développement se laissait déjà constater, et après trois semaines il s’était formé des taches noires larges d’un centimètre, qui continuèrent à s’étendre pendant plusieurs mois, jusqu’à ce qu’enfin la la surface entière de l’œuf fut couverte d’une couche noire de bactéries. Une semblable préparation, parvenue au stade moyen, se voit représentée dans la fig. 2. Les bactéries ne donnent lieu, évidemment par suite de la richesse en peptone du blanc d’œuf peptonisé, qu’à une liquéfaction insignifiante ; néanmoins, le centre de chaque tache est excavé et rempli de matière demi-liquide. Au microscope (fig. 6), on reconnaît que les bactéries des taches sont assemblées en pellicules, d’où il résulte que des masses grises cohérentes deviennent visibles dans les préparations. La figure est très intéressante encore sous d’autres rapports. On y distingue des bactéries vivantes, incolores, en forme de bâtonnets ou de fuseaux; des corps bactériens morts, bruns, qui ont accumulé la matière colorante brune; des corpuscules noirs, souvent à faces planes, provenus soit de bactéries mortes, soit d’autres particules dans lesquelles s’est déposée la matière colorante; enfin, quelques sphérocristaux de pigment, colorés eu bleu d’outremer. Le blanc d’œuf, à l’état cuit, constitue une excellente masse nourricière.
Cette dernière remarque s’applique aussi à la caséine. Celle que j’employai était d’un blanc de neige et avait été purifiée au moyen de dissolutions répétées dans le carbonate de soude, suivies de précipitations par l’acide acétique, et au moyen de l’éther. De cette préparation, je fis simplement bouillir 1 à 2 % dans de l’eau de conduite, jusqu’à stérilisation assurée. J’infectai alors avec le B. cyaneo-fuscus et abandonnai le liquide trouble à une température de 6 à 10° C. Au bout de quelques jours déjà, la dissolution
M. W. BEYERINCK.
de la caséine commença à devenir manifeste, et en même temps commencèrent les changements de couleur. Le vert et le bleu purent à peine être observés, si rapide fut la prééminence acquise par le brun et le noir. Les spbérites étaient identiques a celles qu’on trouve dans les taches du fromage, c’est-à-dire qu’elles n’étaient pas de couleur indigo, mais noirâtres.
Avec la caséine j’ai encore exécuté une autre expérience. Du lait frais ayant été coagulé par la présure, la masse caséeuse obtenue, soit préalablement salée, soit non salée, fut infectée, tant à la surface qu’à l’intérieur, avec le B. cyaneo • fuscus.
Le développement ne fut pas aussi vigoureux qu’il l’avait été dans l’expérience précédente; au bout d’une couple de semaines seulement, on put voir de petites taches bleu-noirâtre, remplies de corpuscules pigmentaires foncés, comme le montre la fig. 7. A l’intérieur aussi, le processus était reconnaissable ; mais dès que les bactéries étrangères, que je n’avais pas éliminées, eurent déterminé la putréfaction de la masse caséeuse, le développement du B. cyaneo-fuscus et la formation du pigment cessèrent entièrement.
Des expériences analogues à celles qui viennent d’être décrites ont été faites avec du gluten de froment et ont donné les mêmes résultats. Il va sans dire que la vessie des animaux, leur chair et autres matières de ce genre se prêtent également, après lavage et purification, aux expériences sur le B. cyaneofuscus. Quant au tissu corné et aux fibres élastiques, la question de savoir s’ils peuvent être décomposés par notre bactérie et servir à sa nutrition, n’est pas encore résolue.
Avec l’asparagine seule, je n’ai pu observer aucun développement. Celui-ci est au contraire possible quand, outre l’asparagine, on donne de la glucose; on obtient alors une culture dont la couleur est d’abord le vert de vessie, puis le brun jaunâtre, mais cette culture renferme très peu de spbérites, et celles-ci sont colorées en vert, non en bleu. Dans ces conditions, le développement est lent et difficile; évidemment,
LA BIOLOGIE I)’UNE BACTERIE PIGMENTAIRE
les peptones, ou les corps protéiques liquéfiés par le bacille, surpassent de beaucoup en pouvoir nutritif ') l’asparagine mêlée de sucre.
Le sucre, additionné de sels ammoniacaux ou de nitrates, a été trouvé impropre à la nutrition.
Il en est de même du tartrate et du malate d’ammoniaque. Ces deux substances furent essayées parce qu’elles constituent un excellent aliment pour le Bacillus cyanogenus du lait bleu * 2).
De tous ces résultats, le plus important est sans contredit celui d’après lequel les peptones, ou les corps protéiques liquéfiés par l’enzyme protéolytique de la bactérie, suffisent à sa nutrition complète.
Au reste, le B. cyaneo-fuscus n’est pas seul sous ce rapport ; je connais toute une série de bactéries douées de la même aptitude. Citons, par exemple, le Bacillus prodigiosus, les bacilles lumineux à peptone (Photobaderium, indicum et Ph. luminosum), les bacilles du choléra et différentes bactéries saprophytes, parmi lesquelles les espèces de Proteus.
Le fait est surtout remarquable en ce qu’il nous indique, pour l’acide carbonique de la respiration, une origine toute différente de l’origine ordinaire. Si l’on se reporte, en effet, au schème universellement admis du chimisme de la respiration, — d’après lequel l’acide carbonique dissocié de la matière vivante est incessamment remplacé par la fixation d’un hydrate de carbone, avec le concours de l’oxygène libre en cas d’aérobiose, sans cette intervention en cas d’anaérobiose, — il est évident que, chez les organismes à peptone, nous nous trouvons à cet égard en présence d’une source d’énergie non reconnue comme telle jusqu’ici. Cette conclusion, facile à
1) Par pouvoir nutritif j’entends le rapport entre le poids de l’aliment plastique offert et le poids de la substance vivante formée, les conditions étant d’ailleurs égales et l’activité végétative identique.
2) Je ne saurais ranger le Bacillus cyanogenus parmi les microbes à peptone, vu que cette espèce, bien que pouvant se développer aux dépens de la peptone seule, est alors incapable, sans accompagnement d’autres corps, d’engendrer de la matière colorante.
M. W. BEYERINCK.
contrôler, vu que les matériaux nécessaires abondent clans tous les laboratoires, ne sera pas contestée, je pense, et il me semble que nous devons y reconnaître un élargissement très notable de nos idées sur les phénomènes biologiques en général.
La première question qui s’impose, à ce nouveau point de vue, est celle du produit secondaire auquel doit donner naissance la nutrition purement peptonique. Cette question est double, la peptone fonctionnant à la fois comme aliment plastique et comme aliment respiratoire. En ce qui concerne la nutrition plastique, une simple addition de la peptone au protoplasme, au besoin avec polymérisation ou déplacement d’atomes, pourrait probablement être admise lors de la formation de la substance vivante nouvelle.
Les produits secondaires mis en liberté avec la génération de la force nécessaire à cet effet, donc avec la respiration, - laquelle force doit être fournie par la décomposition d’une autre portion de la peptone, — c’est-à-dire, les substances excrétoires qui naissent à côté de l’acide carbonique par l’absorption de l’oxygène respiratoire, pourraient différer suivant les conditions expérimentales. A des températures plus ou moins élevées, et aussi dans d’autres circonstances défavorables, il se forme toujours, comme produit final, de l’ammoniaque, qui dans les cultures se présente très souvent à l’état de phosphate ammoniaco-magnésien. '). En cas de conditions nutritives plus favorables, par exemple si les sels, les acides, les alcalis et autres corps non assimilables se trouvent dans les proportions les plus avantageuses et surtout si les conditions thermiques sont le mieux appropriées à la vie, il pourrait au contraire
>) Cette substance n’est nullement propre aux microbes à peptone; elle se trouve aussi comme produit d’excrétion chez des organismes dont le schème de nutrition est tout différent, par exemple, chez les bactéries à peptone et carbone, qui, outre la peptone, exigent encore quelque matière carbonée particulière, telle que le sucre, la glycérine, etc. A ce groupe appartiennent, entre autres, la bactérie lumineuse ordinaire (Photobcicterium phosphorescens).
LA BIOLOGIE D’UNE BACTERIE PIGMENTAIRE
se former, aux dépens de la peptone, des produits de dédoublement moins avancés. Tout au moins, l’obtention de produits de décomposition cristallins est alors beaucoup moins facile que dans le cas précédent. Peut-être cela tient-il en partie à l’enzyme albuminique sécrété par les bactéries à peptone, enzyme qui, surtout à des températures un peu élevées, agit très énergiquement et décompose même la peptone en leucine et en tyrosine.
Une autre question qui, au point de vue de la nutrition exclusivement peptonique, paraît avoir de l’importance, est celle de la possibilité ou de l’impossibilité de l’anaérobiose dans cette forme d’échanges nutritifs. A cet égard, malheureusement, il n’y a pas grand ’chose à dire jusqu’ici. Je ne saurais encore décider si, dans le règne des microbes, un développement anaérobie peut à un degré quelconque avoir lieu, lorsqu’on leur offre seulement de la peptone ou des corps albumineux susceptibles de protéolyse 1 ) ; certains processus de putréfaction semblent, il est vrai, l’indiquer, mais ces processus n’ont pas encore été suffisamment étudiés 2). Chez le Bacillus cyaneo-fuscus , qui est strictement aérobie, il ne saurait naturellement être question d’un pareil phénomène. Mais le développement n’est qu’une des nombreuses fonctions vitales d’un organisme, et lors même que ce développement exige la présence d’oxygène libre, il ne s’ensuit nullement qu’il doive en être de même pour d’autres fonctions3); c’est ce que nous apprend d’ailleurs le fait de la réduction, par beaucoup de
1) Les anaérobies qui me sont connus d’un peu près demandent, comme sources de carbone et d’azote, deux corps différents.
2) Note postérieure. Le Bacillus putrefaciens coli peut se multiplier, fonctionner et produire des spores à l’abri des derniers traces d’oxygène libre, dans une solution qui ne contient que de la peptone.
3) Une réserve d’oxygène, c’est-à-dire une provision d’oxygène fixé, précipité en quelque sorte sur le protoplasme, est indispensable à tous lesaérobies, pour toutes les fonctions vitales; mais l’existence ne s’en laisse démontrer que par des expériences sur le développement. A l’observation directe, cet oxygène fixé sur la matière vivante reste jusqu’à présent inaccessible.
M. W BEYEKINCK.
schizomycètes aérobies, du bleu d’indigo en blanc d’indigo, — réduction que nous avons trouvée aussi, à un faible degré, chez le B. cyaneo-fuscus, — ou du salpêtre en nitrite, réduction qui naturellement doit avoir lieu sans l’intervention de l’oxygène. D’autres bactéries à peptone peuvent également fonctionner, sans développement il est vrai, en l’absence d’oxygène libre, comme je pourrais le prouver par plusieurs exemples.
Sur l’affaiblissement de la force végétative chez le Bacillus cy aneo-f uscus.
Mon intérêt particulier pour la biologie du B. cyaneo-fuscus a été éveillé par la circonstance que cette bactérie pigmentaire m’a appris à connaître, avec une netteté extrême, certains phénomènes provoqués par des influences de température, fort analogues à ceux que plusieurs observateurs ont décrits en détail pour les microbes pathogènes et que moi-même j’avais retrouvés, plus ou moins distinctement, chez maints autres saprophytes. Ces phénomènes ont rapport à la perte de caractères, surtout à l’affaiblissement de la force végétative et aussi, dans une moindre mesure, à la disparition de la faculté de produire du pigment et même de former de l’enzyme.
Ces trois phénomènes sont, chez notre bactérie, dans une certaine corrélation, qui toutefois ne peut pas être regardée comme fondamentale, par la simple raison déjà qu’on n’en trouve pas trace chez des formes voisines, qui dans des conditions déterminées montrent également des pertes de caractères.
Le point essentiel, dans ces phénomènes, a déjà été maintes fois mis en lumière; pourtant, on verra dans les lignes suivantes que les changements observés par moi renferment assez de neuf pour que l’exposition n’en paraisse pas superflue ; je crois même, en traitant de l’action prolongée des températures optima sur la végétation, toucher à un sujet d’intérêt général.
Après ces préliminaires, considérons de plus près le phénomène lui-même.
LA BIOLOGIE d’üNE BACTERIE PIGMENTAIRE.
Lorsque, en juin 1890, la température de mon laboratoire oscillant autour de 15° C., j’entrepris l’étude d’une culture de B. cyaneo-fuscus qui venait d’être isolée de l’eau de conduite, les ensemencements sur de l’eau de canal solidifiée par 10 % de gélatine se montrèrent très actifs. Pour obtenir des colonies de germes isolés, je procédai comme d’habitude : une trace de la matière d’ensemencement fut agitée dans un petit matras avec de l’eau stérilisée, puis cette eau fut versée sur une épaisse couche de gélatine figée dans une boîte de verre, après quoi on la laissa rapidement s’écouler, de sorte que çà et là seulement des germes isolés restaient adhérents à la surface de la gélatine. Les colonies de notre bactérie commencèrent à se développer au bout de trois ou quatre jours et continuèrent ensuite à s’étendre lentement, en liquéfiant le terrain de culture. Dans la cage vitrée où se trouvaient les cultures, on eut soin de ne jamais laisser s’élever la température au-dessus de 22° C; le plus souvent elle restait au-dessous de 17° C. 1 ).
Après avoir pratiqué avec ces colonies, dans les conditions indiquées, plusieurs réinoculations régulières, donnant lieu à un développement vigoureux, je remarquai, au commencement de septembre, en faisant la huitième culture, qu’il n’était plus possible d’obtenir la croissance sur gélatine. A la vérité, les cinquième, sixième et septième ensemencements avaient aussi déjà présenté, dans le retard et l’irrégularité de la croissance, des phénomènes d’affaiblissement, mais je n’en compris clairement le sens que lorsque, à la huitième répétition, rien ne se développa plus.
La première question qui se posait, était de savoir si la culture servant à l’ensemencement avait dépéri par l’une ou l’autre cause Pour résoudre cette question, de larges lignes d’inoculation furent tracées sur des plaques de gélatine, puis, au bout de plusieurs jours, examinées attentivement à la loupe. Cet examen y révéla non seulement une légère liqué-
1 ) Cette cage se trouve dans une partie de mon laboratoire où il arrive seulement de la lumière diffuse très faible.
M. W. BEYEKINCK.
faction du terrain de culture, mais aussi l'existence de très petites colonies incolores, dont bientôt, toutefois, la croissance s’arrêta complètement, et pour toujours.
D’une manière différente, et plus définitive, je réussis pourtant à mettre en évidence que la mort n’était pour rien dans le phénomène. En effet, lorsque les bactéries qui avaient cessé de pouvoir se développer sur la masse formée de 10% de gélatine et d’eau de canal furent portées dans des solutions de % de peptone sèche dans de l’eau de conduite, les phénomènes ordinaires se reproduisirent, de telle sorte que c’est à peine si quelque indice d’affaiblissement se laissait remarquer. Le liquide devint d’abord d’un beau vert, ensuite il se forma contre le verre un anneau méniscoïde bleu, et finalement le tout se colora en brun assez foncé; seulement, cette couleur finale n’atteignit pas la profondeur d’intensité qu’elle avait dans les cultures primitives, non affaiblies.
Avec cette culture peptonique furent maintenant pratiqués de nouveaux ensemencements sur gélatine, mais ceux-ci ne donnèrent aucune trace de développement, preuve que l’affaiblissement était héréditaire.
Lorsque, au contraire, une gouttelette de cette même culture peptonique fut introduite, à l’aide d’un fil de platine, dans une nouvelle solution de \°/Q de peptone dans de l’eau de conduite, tout redevint, en apparence, normal; la croissance et la formation du pigment semblaient aussi intenses que dans la culture précédente. Les autres conditions culturales avaient été maintenues, autant que possible, identiques; la température, en particulier, n’avait jamais dépassé 22° C.
De nouveaux ensemencements eurent ensuite lieu à de courts intervalles, chaque fois avec la culture faite en dernier lieu. En quatre semaines de temps furent ainsi obtenues six cultures peptoniques, qui devaient évidemment embrasser une longue série de générations. Quand, au commencement d’octobre, je pratiquai le septième ensemencement, je soupçonnai qu’il en résulterait quelque chose de nouveau, tellement le
LA BIOLOGIE D’UNE BACTERIE PIGMENTAIRE 253
sixième ensemencement avait tardé à se développer normalement. Cette présomption était fondée: il se produisit, à la vérité, une végétation bactérienne très caractéristique, jaune orangé, grossièrement granuleuse, mais celle-ci était extrêmement pauvre en substance, et, ensemencée à son tour, se montra incapable de développement ultérieur. La série de ces essais se trouva ainsi close.
Comme mes expériences sur plusieurs autres bactéries m’avaient préparé à ce résultat, et que je savais qu’en certains cas une basse température prévient les difficultés culturales, j’avais, dès le mois de juin, établi quelques cultures dans la cave du laboratoire, à une température presque constante de 10° C, qui ne descendit au-dessous de ce point qu’au mois d’octobre. C’étaient aussi des cultures de B. cyaneo-f uscus dans des solutions à \ % de peptone sèche.
Aussitôt qu’eut été obtenu le résultat d’affaiblissement ci-dessus mentionné, j’opérai, au commencement d’octobre, un ensemencement sur gélatine avec une des cultures établies dans la cave, culture qui datait du 10 juin. Au bout de trois ou quatre jours on put observer les premières traces de développement, et après dix autres jours j’étais de nouveau en possession d’une belle et très vigoureuse culture en colonies, sur eau de canal avec 10% de gélatine. Il ressortait en tout cas de là, sans la moindre ambiguïté, qu’un processus de dépérissement spontané ne pouvait être la cause de l’affaiblissement dont il s’agit. Mais dans la cave, à la basse température qui y régnait, et en l’absence de réinoculations, la division cellulaire avait été extraordinairement retardée. Comment se comporterait, à cette température, une lignée continuellement inoculée à nouveau et embrassant par conséquent aussi une longue suite de générations?
Pour résoudre cette question, des cultures pures avaient été commencées dans la cave tout au début du mois d’octobre et furent continuées dans le laboratoire aussitôt que les froids de l’hiver se firent sentir; les boîtes de verre y étaient placées
M. W. BEYERINCK.
sur une table de pierre, dont la température resta, en décembre, à environ 5° C. Dans ces conditions, la végétation était ralentie, mais pourtant très florissante. Pour donner la première impulsion au développement, les plaques de gélatine étaient, à chaque nouvelle inoculation, tenues pendant deux ou trois jours à une température de 12 à 15° C, puis portées sur la table de pierre dès que les colonies devenaient visibles. Après une douzaine d’inoculations successives, ainsi conduites, la croissance n’avait subi aucune atteinte, et des ensemencements de ces différentes générations, dans des solutions de peptone, s’y développaient normalement et leur communiquaient d’abord la couleur verte, puis la couleur noire. Par inoculation en retour, de ces solutions sur la gélatine, on obtint aussi, jusqu’à la fin, des colonies ordinaires.
Dans le cas décrit plus haut, une influence thermique pouvait donc seule être la cause de l’affaiblissement.
Bien que ce résultat s’accorde en général avec ce que l'expérience a appris des bactéries pathogènes, dont les formes mitigées naissent de la matière virulente par l’influence d’une élévation de température, on ne saurait méconnaître que, sous un rapport important, les phénomènes décrits pour le Bacillus cyaneo-fuscus étendent la notion déjà acquise. Tandis que jusqu’ici la chaleur n’avait été appliquée, pour ainsi dire, que comme agent de laboratoire, on reste, avec mes expériences, dans les limites climatologiques d’un été ordinaire. Ainsi M. Pasteur *), en 1880, et M. Chauveau * 2), en 1883, ont obtenu le bacille du charbon à l’état atténué en le cultivant à des températures artificiellement élevées. M. Chauveau, ayant ensemencé du bouillon avec du sang de rate, laissa le développement s’opérer d’abord tout un jour à 42° C, puis chaulfa la culture pendant une heure à 47° C, ce qui donna un premier degré d’atténuation. En continuant à appliquer cette même chaleur de 47° C,
») Comptes rendus , T. 91, p. 673.
2) Ibid ., T. 96, p. 615.
LA BIOLOGIE d’üNE BACTERIE PIGMENTAIRE.
il obtint au bout de deux heures un second degré d’atténuation, et au bout de trois heures une forme complètement privée de virulence D’après M. Chauveau, cette propriété était héréditaire.
M. Pasteur 1 ) a également employé cette méthode pour obtenir le vaccin du charbon, et MM. Koch, GafFky et Loffler 2 ) ont constaté, de leur côté, les faits en question.
Chez moi, au contraire la température active de l’affaiblissement n’avait pas, nous l’avons vu, dépassé 22° C.
Il existe, toutefois, encore une autre série de recherches, qui se rapproche plus de la mienne et que je rapporterai succinctement. Ce sont les observations de M. Schottelius sur la perte de l’aptitude à former du pigment chez le Bacillus prodigiosus, la bactérie universellement connue du „pain saignant”. De cette bactérie, qui suivant M. Schottelius végète le mieux aux températures comprises entre 15 et 25° C, il obtint, simplement par la culture sur des tranches de pomme de terre, à 41° C, des modifications blanches, héréditaires. Quant à la température exigée, il remarque ce qui suit 3): „Au sujet de tous ces changements produits par la chaleur, il faut retenir que la durée de l’action et le degré de la température sont dans une corrélation telle, que l’effet déterminé par une exposition plus courte à une température supérieure est également obtenu par un séjour plus long à une température inférieure.”
Moi-même j’ai décrit des changements analogues, observés chez les bactéries lumineuses à peptone 4).
Je ne puis quitter ce sujet, sans dire encore un mot delà manière dont on doit se représenter l’action de la chaleur dans les cas en question. '
1) Ibid., T. 92, p. 430; 1881.
2) Mitth. Gesundheitsamt, T. 2, p. 150, 1884.
3) Biologische Untersuchungen über den Micrococcus prodigiosus, Festschrift fur Kôlliker , 1887, p. 12.
4) Sur V aliment photogène et V aliment plastique des bactéries lumineuses, dans Arch. néerl., T. 24, p 369.
M. W. BEYERINCK.
Rappelons d’abord qu'il existe plusieurs méthodes d’après lesquelles peuvent être produites des cultures atténuées ,). La première et, à ce que je crois, la plus importante découverte dans cette direction est due à M. Pasteur i 2 ), qui trouva que des cultures du bacille du choléra des poules avaient, an bout de 9 à 10 mois, perdu leur virulence et ne pouvaient plus donner lieu, chez les animaux inoculés, qu’à des symptômes locaux. Plus tard on a reconnu, pour toute une série de bactéries, que les vieilles cultures sont en partie dépouillées de leurs propriétés, pathogènes ou autres, c’est-à-dire que, si l’on en forme par ensemencement des colonies séparées, on obtient des formes différentes, se distinguant entre elles par la circonstance que les caractères spécifiques ne sont plus complets chez toutes. C’est ainsi que quelques-unes ou la totalité des colonies des bacilles du choléra, de l’érvsipèle, du typhus, de la morve perdent peu à peu leur virulence; celles du Photobacterium phosphorescens perdent leur pouvoir lumineux ; celles des bactéries butyriques du lactate de chaux, leur pouvoir de ferment. Ce qui donne à ces faits un intérêt spécial, c’est qu’on ne saurait douter que le changement ne soit dû à l’action exercée sur ces organismes par leurs propres produits d’excrétion. Quant à vouloir expliquer cette action sur la matière vivante des bactéries, nous devons provisoirement y renoncer. Il convient seulement de remarquer que les faits cités conduisent à la conclusion, sinon nécessaire au moins très probable, que les influences thermiques ne sont pas nuisibles directement, mais le deviennent en exaltant l’action nocive des „ produits d’excrétion”. Si j’emploie ce terme, ^produits d’excrétion”, ce n’est nullement que je me figure les matières actives comme se trouvant nécessairement en dehors du corps des bacilles ; je crois, au contraire, qu’en cas de crois-
i ) Un bon et court aperçu de ces méthodes a été donné par M. Elfving, Studien über die Einwirkung des Lichtes auf die Pilze , p. 135, Helsingfors, 1890.
2) Comptes rendus . T. 91. p. 670; 1880.
LA BIOLOGIE ü’üNE BACTERIE PIGMENTAIRE. 257
sance très vigoureuse, — cas si fréquent à une température un peu élevée, — les matières en question (sans doute des corps protéiques, ne diffusant que très lentement) ne s’éliminent pas avec une rapidité suffisante et deviennent alors tout particulièrement nuisibles, précisément parce qu’elles se trouvent encore à l’intérieur des cellules bactériennes, où, à cause de la température, elles peuvent agir très énergiquement.
D’après tout ce qui précède, je regarde l’action débilitante de la température, malgré sa haute importance, comme ne constituant que le facteur secondaire dans la production de cette forme la plus simple de la variabilité.
Est- il possible de rendre leur activité aux cultures affaiblies du Bacillus cy aneo -fuscus?
J’ai fait plusieurs expériences pour trouver la réponse à 1a, question posée en tête de ce paragraphe. Un résultat positif était évidemment à espérer de la culture longtemps prolongée, à basses températures, des bacilles affaiblis. Antérieurement déjà, j’avais recueilli quelques résultats d’expériences dans cette direction, au sujet de la bactérie lumineuse de la mer du Nord ( Photobacterium luminosum), qui perd très facilement sa faculté photogénique, — pour cela il suffit par exemple de la cultiver à la température ordinaire des appartements, — mais la récupère par une longue croissance à des températures au-dessous de 9° C. Ces expériences avaient fait voir qu’il est particulièrement favorable d’établir des cultures dans lesquelles une grande masse nourricière ne reçoit qu’un petit nombre de germes, de façon que des divisions très nombreuses puissent avoir lieu avant que le terrain nourricier ne soit épuisé et avant que les produits propres des échanges nutritifs ne deviennent nuisibles.
Le Bacillus cyanogenus, la bactérie du lait bleu, m’avait donné des résultats analogues. A une forme qui, par suite
M. W. BEYERTNCK.
de culture prolongée à une température dépassant 20° C, était privée de la faculté de produire du pigment dans le lait bouilli, j’avais pu restituer ce caractère en la cultivant longtemps à des températures inférieures à 15° C.
Chez ces deux bactéries, j’avais déjà remarqué que, outre la température, il y a encore une autre circonstance dont il faut soigneusement tenir compte, à savoir, la concentration de la masse nourricière. Je trouvai avantageux, en effet, — et cela pourrait bien être d’une application générale aux microbes plus ou moins difficiles à cultiver, — de ne donner l’aliment qu’à l’état dilué: l’affaiblissement est alors plus facile à prévenir que chez les cultures en terrain trop riche. Pour les expériences de stimulation du B. cyaneo-fuscus , je n’ai, en conséquence, employé que des dissolution de { % de peptone sèche dans de l’eau de conduite, et pour les cultures subséquentes sur substratum solide, j’ai fait usage d’une masse ne contenant que 10 % de gélatine, également dissoute dans de l’eau de conduite. L’effet de la condition dont il s’agit pourrait s’expliquer de la même façon que celui de la première; il tient peut-être à ce que, dans les solutions nutritives étendues, les produits d’excrétion, qui déterminent l’affaiblissement, interviennent eux aussi à l’état dilué, et agissent alors avec moins d’énergie 1 ).
Pour le Bacillus cyaneo-fuscus , partant de celle de ses formes qui continuait encore à croître avec sécrétion de pigment dans
J ) Pour plusieurs de mes bactéries, reconnues très faibles et difficiles à cultiver, j'ai cherché à les maintenir constantes en mettant une trace de la culture en suspension dans de l’eau de conduite, ou de l’eau de mer. Mais ces essais n’ont donné aucun résultat positif. Peut-être atteindrait-on le but en conservant à l’état sec les formes qui ont prouvé pouvoir supporter la dessiccation. J’ai entrepris des expériences dans cette direction. En ce qui concerne le Bacillus cyaneo-fuscus , je n’ai pas encore réussi à le dessécher de telle sorte qu’il reste en vie. Sous ce rapport, toutefois, il y a à tenir compte de beaucoup de circonstances, qui influent sur le résultat de la dessiccation: la plus importante de celles-ci est la proportion des matières dissoutes dans la masse servant à l’expérience.
LA BIOLOGIE D’UNE BACTERIE PIGMENTAIRE
les solutions de peptone, mais qui ne pouvait plus être cultivée sur gélatine, je me proposai de lui rendre cette dernière propriété. Comme je ne suis pas encore parvenu à restaurer complètement l’activité amoindrie, et que la solution précise de la question, si simple que celle-ci paraisse au premier abord, laisse subsister maints doutes quand on y regarde de plus près, je ne veux pas me prononcer déjà définitivement. Pourtant, je suis, dans ce cas aussi, sur la voie qui conduit à des résultats positifs, et dès à présent je puis affirmer que les Bacillus cyaneo-fuscus affaiblis recouvrent leur activité, au moins partiellement, lorsqu’ils sont cultivés pendant longtemps à de basses températures, — assez élevées toutefois pour permettre encore une croissance sensible, — et lorsqu’en outre on fait usage de solutions nourricières étendues, renouvelées assez fréquemment. Il m’a été possible, en effet, après six semaines d’inoculations répétées dans des solutions à j % de peptone, à une température au dessous de 6° C.. de ramener une culture, devenue incapable de vivre sur une gélatine à 10 %, à un état où elle se développait, sur ce terrain solide, en un mélange de petites colonies faiblement liquéfiantes, avec ou sans zone pigmentaire.
Lorsque, en opérant ainsi sur d’autres espèces adaptées à des degrés de chaleur élevés, on les maintient pendant plusieurs semaines à une température très basse (voisine de 0° C., où la croissance est complètement arrêtée), on observe, après l’ensemencement sous des circonstances favorables au développement pour les formes normales, une diminution qui ne disparaît qu’après une ou deux inoculations nouvelles sous ces circonstances favorables. J’appuie donc sur la remarque, déjà faite plus haut, que, là où il s’agit de réveiller par un abaissement de température l’activité des formes affaiblies, je regarde comme efficace unë température un peu supérieure au minimum encore tout juste suffisant pour la croissance, mais pourtant beaucoup plus basse que la température optimum de végétation des cultures fraîches. Sans croissance aucune’,
Archives Néerlandaises, T. XXV. 18
M. W. BEYERINCK.
le rétablissement de l’activité des bactéries individuelles affaiblies me paraît impossible.
La conclusion pratique à tirer de ce qui précède, pour la culture des bactéries dans le laboratoire, est, essentiellement, qu’il faut veiller avec soin à ce que les préparations conservées pour des expériences ultérieures ne soient pas exposées à des températures trop voisines de l’optimum de croissance. Ces préparations doivent donc toujours être maintenues à de basses températures, qui peuvent toutefois être différentes, selon les espèces. L’action longtemps prolongée de températures très basses doit également être évitée, vu qu’il peut en résulter une dépression — passagère, il est vrai, mais pourtant bien sensible et temporairement héréditaire — des fonctions les plus importantes. L’emploi d’aliment dilué est aussi à recommander. En suivant ces préceptes, il sera probablement tout aussi facile de cultiver, sans la moindre perte de virulence, les bactéries du choléra, de l’érysipèle, de la morve, du typhus, etc., qu’il l’a été, dans mes expériences sur le Bacillus cyaneo-fuscus , organisme si extraordinairement sensible, de maintenir intactes la production pigmentaire et la force végétative.
Déperdition de la force végétative chez les plantes supérieures et chez les animaux.
Dans les lignes suivantes, je désire appeler l’attention sur une analogie qui me semblerait mériter un examen plus approfondi. Je n’apporte à son appui aucun résultat d’expériences personnelles; néanmoins, l’importance du sujet me fait croire que cette première tentative de généralisation, si imparfaite qu’elle soit, ne paraîtra pas inopportune.
L’histoire des sciences biologiques citera indubitablement, comme la seconde œuvre capitale de Darwin, la longue série de ses recherches sur la nature de la sexualité. Le résultat général auquel il a été conduit, condensé en une proposition
LA BIOLOGIE T)’üNE BACTERIE PIGMENTAIRE.
unique, se laisse énoncer en ces termes : La matière reproductrice des plantes et animaux supérieurs est susceptible d’éprouver une déperdition de sa force végétative; le rôle de la sexualité est de prévenir cette déperdition ou, si elle a déjà eu lieu, de la réparer ').
Darwin fait voir que cette perte de force végétative, qui s’accompagne souvent de la régression d’autres caractères chez les descendants, peut être la conséquence d’autofécondation ou de reproduction végétative prolongée.
Les recherches et les méditations de Darwin 1 2) l’amènent ensuite à conclure que l’essence de la sexualité est le fusionnement de deux protoplastes de la même espèce végétale ou animale, lesquels protoplastes (gamètes, oosphère et spermatozoïde ou contenu du pollen) ne diffèrent l’un de l’autre qu’en ce qu’ils proviennent de deux plantes ou de deux animaux qui ont été engendrés et se sont développés dans des conditions vitales différentes.
Ces découvertes, qui, combinées avec la théorie de la descendance, ont jeté une vive lumière sur des milliers de phénomènes naturels obscurs et de constructions organiques compliquées, constituent l’un des plus grands progrès que les connaissances humaines aient jamais faits, et rivalisent avec cet autre triomphe de la biologie expérimentale contemporaine, la réfutation, par Pasteur, du dogme de l’abiogenèse
Quand on se demande jusqu’à quel point les phénomènes d’affaiblissement végétatif, observés par Darwin à la suite de l’autofécondation, concordent avec les phénomènes analogues ci-dessus décrits pour les bactéries, il semble que le rapport
1) Ch. Darwin, The effects of Cross and Selffertilisation in the Vegetable Kingdom , London, 1876. — The Variation of Animais and Plants under Domestication , Vol. II, p. 92 seq , London, 1875.
2) The Origin of Species by means of Natural Sélection , or the Préservation of Favoured Races in the Struggle for Life, 6th ed., p. 76, 234, London, 1878. La vue en question se trouve aussi déjà dans la première édition, de 1859.
M. W. BEYEETNCK.
soit assez intime pour qu’on puisse les considérer à un même point de vue ; dans les uns et les autres, en effet, il ne s’agit que de deux catégories de faits, — abaissement de l’énergie de croissance et perte de caractères, — faits qui n’admettent qu’une interprétation unique, quelles que soient d’ailleurs les différences qui peuvent exister quant à leurs causes plus lointaines. Que chez les organismes supérieurs il n’ait pu se manifester, sous ce rapport, que des modifications relativement légères, cela est tout naturel, puisque chez eux, où les actes physiologiques sont si étroitement enchaînés et si complexes,, une régression un peu profonde serait incompatible avec la vie elle-même. Pour cette raison seule, déjà, il était à présumer que les microbes inférieurs, avec leurs conditions vitales simples, présenteraient les phénomènes d’affaiblissement sous une forme plus aisément accessible à l’observation et dans une extension plus grande.
La facilité relative de l’institution des expériences et la rapidité du développement des bactéries contribuent également à faire de celles-ci des sujets d’étude extrêmement favorables pour ces recherches comparatives.
En admettant maintenant que la déperdition dont il s’agit soit réellement une propriété générale des organismes, tant des plus élevés que des plus rudimentaires, la question se présente de savoir dans quelle mesure des conditions extérieures semblables peuvent déterminer aussi des effets semblables dans les sections les plus éloignées entre elles du système des êtres vivants. Pour obtenir une réponse non ambiguë, il faudra abandonner la voie de l’investigation biologique, suivie par Darwin, et revenir à l’enquête physiologique.
Le premier point à décider sera évidemment celui-ci: Les influences de température ont-elles chez les plantes et les animaux supérieurs, en ce qui concerne les altérations héréditaires de leur énergie de croissance, la même importance que chez les bactéries? En d’autres termes, ces organismes supérieurs éprouvent-ils aussi un affaiblissement végétatif à la suite du
LA BIOLOGIE d’üNE BACTÉRIE PIGMENTAIRE
développement et de l’accroissement, longtemps continués, aux températures qui doivent être considérées comme les plus favorables à cette fonction ?
Chez les animaux à sang chaud, ce devrait être précisément la température du sang qui, par elle-même, causerait le préjudice à la vitalité des cellules reproductrices/ préjudice pouvant être réparé par la fusion sexuelle avec un protoplaste d’origine différente ,).
Chez les animaux à sang froid et chez les plantes, ce seraient les surélévations de la température du milieu extérieur qui devraient entraîner les effets nuisibles.
Pour les bactéries, comme nous l’avons vu, s’imposait l’hypothèse que la température n’exerce qu’une action indirecte dans la production de l’affaiblissement ; ce seraient certains produits d’excrétion de la matière vivante qui détermineraient primairement l’altération proprement dite, héréditaire, du protoplasme, mais l’action de ces produits serait considérablement exaltée par l’élévation de la température. En supposant que cette hypothèse se laisse appliquer aussi aux plantes et animaux supérieurs, il est incontestable qu’une foule de relations et de caractères se trouveraient éclairés d’un jour tout nouveau.
Si dans le dernier énoncé il ne s’agit que d’hypothèses, souffrant à peine un contrôle direct, le précédent se prête tout ou moins à l’institution d’expériences, qui, de haute importance si elles conduisaient à un résultat positif, ne pour-
«) Un argument capital à l’appui de cette manière de voir est fourni, me semble-t-il, par le fait que. même chez les animaux à sang chaud (et plus encore chez les animaux à sang froid), toutes les fonctions n’ont pas le même optimum de température. C’est ainsi, par exemple, que dans le processus respiratoire la quantité d’acide carbonique s’élève certainement encore quand la température dépasse l’optimum pour la croissance, et des différences analogues se rencontrent probablement dans une foule d’autres actes physiologiques II ne paraît donc pas impossible que, dans le corps d’un animal à sang chaud, certains processus doivent s’accomplir, nécessairement et continûment, à une température un peu supérieure à celle qui leur conviendrait le mieux dans la durée des temps.
M. W. BEYEK1NCK.
raient être regardées comme inutiles dans le cas contraire. Sous ce rapport, le plus simple serait d’expérimenter sur des plantes, et cela de la manière suivante.
Des individus d’origine identique seront cultivés, les uns au-dessus, les autres au-dessous de la température reconnue pour correspondre à l’optimum de végétation, mais dans des conditions d’ailleurs identiques, et telles, que ces individus soient réduits à l’autofécondation. Les descendants provenus des graines de ces deux séries de plantes seront placés dans des conditions égales sous tous les rapports, — égales aussi en ce qui concerne la température, — et abandonnés à eux-mêmes jusqu’à maturité. Finalement, le produit de la récolte sera apprécié suivant la méthode de mensuration de Darwin, c’està-dire que la hauteur et le poids des plantes entières, ainsi que le nombre des fruits et des graines, seront déterminés pour chacun des deux groupes et comparés de l’un à l’autre.
Si l’hypothèse se confirme, les descendants par autofécondation des plantes soumises à la chaleur donneront, à la récolte, des nombres inférieurs à ceux que fournira la progéniture, également obtenue par autofécondation, des parents cultivés à une température plus basse que celle de leur optimum de végétation.
(Jn point essentiel, dans l’exécution de l’expérience, serait que cette température plus basse, à laquelle on cultiverait l’un des groupes de plantes, ne fût pas trop éloignée de celle de l’optimum. Il est probable, en effet, que l’action longtemps continuée de températures très basses déterminerait, tout comme chez certaines bactéries, un abaissement de l’énergie végétative, abaissement héréditaire, au moins pour quelque temps, même à la température optima réelle.
Il est à présumer aussi, en ce qui concerne les plantes soumises à la chaleur, que des températures de beaucoup supérieures à celle de l’optimum donneraient lieu à un affaiblissement végétatif plus énergique que les températures voisines de ce point. On peut croire, enfin, que l’influence de la température
LA BIOLOGIE D’UNE BACTERIE PIGMENTAIRE
pourrait devenir sensible, probablement suivant la nature des espèces, ou bien dès la première nouvelle génération, ou bien seulement après un certain nombre de générations, dérivées les unes des autres par propagation asexuehe ou par autofécondation. Pour cette dernière raison, les recherches comparatives sur des plantes vivaces, cultivées à température supérieure et à température inférieure, offriraient peut être des chances particulières de succès.
Sur la présence du Bacillus cy aneo-fuscus dans le fromage.
Ce sujet demande, vu son importance pratique, à être traité à part; au point de vue de la science pure, il présente un certain intérêt, d’abord à Cause des phénomènes de coloration qu’on observe dans le fromage attaqué, puis à raison de l’état d’affaiblissement et de dépérissement où tombent les bactéries, par suite des transformations chimiques qui s’opèrent dans la masse caséeuse dès le début de la maturation, et peut-être aussi par suite des changements de température dont ces tranformations sont accompagnées.
Quelques mots sur la structure microscopique du fromage ne seront probablement pas déplacés ici, car dans les ouvrages traitant de l’industrie laitière je n’ai trouvé, relativement à cette structure, que des données insuffisantes, de sorte qu’on doit la supposer peu connue. Ce que j’en dirai a principalement rapport au fromage „d’Edam”, très réputé aux Pays-Bas.
La caséine du fromage mûr se présente au microscope sous l’aspect d’une masse compacte, amorphe, dans laquelle on ne découvre que par places des globules de graisse (/ fig. 7), et qui doit, en tout cas, être imprégnée par imbibition de cette dernière matière. Une coupe mince de fromage laisse encore reconnaître, outre ces gouttelettes de graisse, des bulles de gaz ( ^ fig. 7), disséminées dans la masse caséeuse. Par suite de l’inégalité
M. W. BEYERINCK.
de pression, les gouttelettes de graisse et les bulles de gaz s’éloignent souvent beaucoup de la forme sphérique.
Si l’observation de ces détails assez grossiers est facile, celle des autres éléments structuraux du fromage l’est un peu moins. Comme tels, un examen attentif m’a fait distinguer: 1° Des sphérocristaux (t fig. 7) d’une substance analogue à la tyrosine (peut-être, de la tyrosine elle-même), 2° Des cellules de levure (h) du Saccharomyces tyrocola. 3° Des bactéries en bâtonnets (m) du bacille de l’acide lactique. Parmi ces éléments, les plus importants, de beaucoup, sont les bactéries. Considérons chacun d’eux un peu plus en particulier.
En ce qui concerne les sphérocristaux ( t fig. 7), je dois faire remarquer qu’on ne peut pas les rencontrer dans toute particule de fromage, quelle qu’elle soit. Dans les fromages fabriqués avec ce qu’on appelle du „petit-lait filant”, fromages qui mûrissent rapidement, les sphérocristaux sont extrêmement communs. La formation en dépend évidemment de causes localisées, et je ne doute pas que l’accumulation, en certains points, des bâtonnets et microcoques lactiques ne joue sous ce rapport le rôle principal. Ces sphérocristaux possèdent, tout comme les grains d’amidon, une petite tache nucléaire, d’où rayonnent les petites aiguilles cristallines à peine visibles. Ce qui nous intéresse ici plus spécialement, c’est l’aptitude de ces corps à emmagasiner la matière colorante brune produite par le Bacillus cyaneo-fuscus et à prendre ainsi une couleur presque noire; surtout le corpuscule nucléaire, cidessus mentionné, a une grande affinité pour la matière colorante, et il consiste peut-être en une substance protéique particulière, qui se trouverait par rapport à la caséine dans la même relation où la calcoglobuline de Harting 1 ) se trouve par rapport à l’albumine, dans les sphérites calcaires que ce savant avait obtenues par la précipitation de solutions albumineuses.
Le Saccharomyces tyrocola (h fig. 7), qui a la propriété d’agir
LA BIOLOGIE D’UNE BACTERIE PIGMENTAIRE
comme ferment sur le sucre de lait et de le transformer en alcool et acide carbonique, se trouve disséminé, quoique assez irrégulièrement, dans toute la masse caséeuse, et n’est manifestement actif que dans les premiers stades de la maturation.
Les bacilles lactiques (m fig. 7) — dans les fromages préparés avec du „pertit-lait filant” je n’ai trouvé que des microcoques, dont je n’ai toutefois pas essayé la culture *) — sont répandus en nombre immense dans la masse du fromage et se trouvent, pour ainsi dire, partout. Lorsqu’on prépare une gélatine au sérum de lait faiblement acide, et qu’on y trace, avec une aiguille de platine préalablement enfoncée dans le fromage, une ligne d’inoculation, on obtient souvent une file continue de colonies uniquement composées de ferments lactiques, mais seulement des colonies isolées, disséminées entre les premières, de la levure du fromage. En étudiant séparément les colonies développées par le fromage d’Edam, j’y ai trouvé environ cinq variétés constantes, qui se laissent distinguer au moyen de la forme des bâtonnets et se différencient encore par beaucoup d’autres particularités accessoires, mais qui toutes se ressemblent en ce qui concerne l’aptitude à transformer en acide lactique le sucre de lait, le sucre de canne, la maltose, la lévulose, la glucose et la galactose. L’acide lactique produit est l’acide de fermentation ordinaire, dont le sel calcique renferme cinq molécules d’eau de cristallisation.
D’accord avec l’extrême abondance des bacilles lactiques dans le fromage, celui-ci renferme une très forte proportion d’acide lactique. Dans divers titrages directs, j’ai eu besoin de 15 à 20cc de potasse normale pour neutraliser 100 grammes de fromage, d’où résulte une teneur en acide lactique de 1,35 à 1,8 % * 2). Au premier abord, il paraît singulier que
• ) Par contre, j’ai cultivé les bactéries du *petit-lait filant” lui-même, de sorte qu’elles me sont bien connues
2) Si, comme expression probable de la fermentation lactique du sucre de lait, on admet l’équation
C**H%iOil + H1 0 = 4 C3H*03,
M. W. BEYERINCK.
d’aussi fortes quantités d’acide se fassent si peu remarquer dans le fromage; cela tient évidemment à sa teneur en sel, substance dont le goût masque celui de l’acide. Qu’une pareille proportion d’acide détermine la mort complète d’un organisme aussi sensible que le Bacillus cyaneo-fuscus, il n’y a certes pas lieu de s’en étonner.
Passons maintenant à ce qui concerne la présence de cette bactérie pigmentaire dans la niasse caséeuse, et commençons par examiner la structure microscopique des taches foncées qu’elle y produit '). Ces taches se distinguent, de la substance non altérée, en premier lieu par leur couleur. Celle-ci est due à la présence de grains noir bleuâtre ou bruns et d’une matière colorante foncée diffusée dans le fromage lui-même, matière qui se trouve accumulée surtout dans les sphérites de tyrosine. En second lieu, les taches se distinguent de la masse normale par l’entassement, à leur centre, de bâtonnets du ferment lactique; il peut arriver, toutefois, que cet entassement fasse défaut. Les bâtonnets du Bacillus cyaneo-fuscus lui-même ne sont, d’ordinaire, pas distinctement reconnaissables dans les taches.
Les grains de matière colorante noire sont identiques avec les sphérites de B. cyaneo-fuscus , telles que nous avons appris à les connaître plus haut. La réduction par l’hydrosulfite de sodium et l’oxydation par l’acide nitrique, le peroxyde d’hydrogène ou d’autres agents d’oxydation, produisent sur eux la même décoloration que sur les susdites sphérites. La couleur disparaît aussi presque entièrement, surtout quand la température est un peu haute, sous l’influence de l’air. M. Hugo de
les nombres ci-dessus correspondent exactement aussi à une proportion de 1,35 à 1,8 °/0 de sucre de lait dans la masse caséeuse originelle; c’est à peu près la moitié ou le tiers de la proportion de lactose dans le lait, proportion qui ne s’éloigne pas beaucoup de 3 à 5°/0.
i ) Des taches foncées peuvent naturellement se former dans le fromage par toutes sortes de causes. Quant à l’opinion que le rôle principal dans ce phénomène revient aux bactéries du lait bleu ( Bacillus cyanogenus), mes recherches ne l’ont pas confirmée.
LA BIOLOGIE d’üNE BACTÉRIE PIGMENTAIRE.
Vries 1 ) a appelé sur ce point l’attention particulière des producteurs de fromage, auxquels il conseille, pour se débarrasser de l’altération tant redoutée, des essais avec l’oxygène sous pression, à une température modérément élevée, non nuisible au produit. Peut-être vaudrait-il encore mieux introduire les fromages attaqués, qui, — les taches bleues le démontrent elles-mêmes, — ne contiennent pas d’oxygène à leur intérieur, dans une enceinte où l’on ferait le vide ; les cavités du fromage laisseraient alors échapper peu à peu les gaz qu’elles enferment et, après la suppression du vide, elles se rempliraient d’air atmosphérique, lequel, se diffusant dans la substance, atteindrait les taches et les décolorerait. Ce serait aux praticiens de fixer la température à laquelle la masse pourrait être portée sans dommage pour le goût et la facilité de conservation. Des températures comprises entre 20 et 30° C donnant déjà lieu à une décoloration très parfaite, il n’y aurait pas à craindre, sous ce rapport, des difficultés insurmontables. Au reste, il serait naturellement bien préférable de prévenir entièrement la formation des taches, ce à quoi l’on parviendrait sans aucun doute au moyen d’une extrême propreté, et surtout par l’emploi exclusif de lait stérilisé, autant que possible, au sortir même du pis de la vache.
Revenons, toutefois, aux changements de couleur qui peuvent être observés dans les taches de fromage. Lorsqu’un fromage tacheté de bleu est coupé en morceaux et que ceux-ci demeurent exposés à l’action de l’air, on voit, en même temps que les anciennes taches se décolorent, s’en former de nouvelles, souvent en grand nombre. Toutes ces taches récentes restent petites. Je crois devoir expliquer ce phénomène de la manière suivante. Dans une masse caséeuse infectée de Bacillus cyaneo-fuscus , toutes les bactéries ne se développeront pas en colonies simultanément. Les colonies qui se forment les premières produiront les taches les plus grandes, et ces taches auront déjà pris leur
J ) Over blaauwe kaas , dans Maandblad der Hollandsche Maatschappij van Landbouw , mai 1887, n° 5.
M. W. BEYERINCK.
couleur définitive avant que l’oxygène inclus ne soit entièrement consommé par les ferments donnant naissance à l’acide lactique '). D’autres colonies, d’origine postérieure, auront pu, avant la disparition de l’oxygène à l’intérieur du fromage, arriver au stade de la formation du pigment vert, mais non à celui de l’oxydation complète du pigment, à sa transformation en pigment noir. Dans cet état, le manque d’oxygène et l’action de l’acide lactique, successivement produit pendant la maturation du fromage, feront mourir les bactéries ; par suite, les taches vertes resteront à peine visibles dans la masse, ou se déroberont complètement à la vue. Mais si un fromage pourvu de ces taches vient à être coupé en morceaux et exposé à l’influence de l’oxygène atmosphérique, la zone de diffusion, jusqu’alors inaperçue, prendra une couleur foncée, phénomène analogue à celui qu’on peut observer dans les solutions peptoniques infectées de B. cyaneo-fuscus, même quand elles ont été bouillies dans le stade vert et que les bactéries sont par conséquent tuées. Ces solutions peptoniques, tout comme les taches invisibles, demandent, pour prendre la coloration finale, l’action de l’air pendant un à trois jours.
Je terminerai ces remarques par la description de l’expérience suivante, dont je dois la connaissance à M. van Lookeren Campagne.
Un fromage sain et un fromage fortement marqué de taches bleues furent coupés par le milieu, puis les deux moitiés de l’un furent respectivement appliquées sur les deux moitiés de l’autre, dans le dessein d’apprendre jusqu’à quel point les morceaux sains, en contact avec les morceaux malades, se coloreraient. Après avoir été soigneusement enfermé dans une vessie de porc, chaque fromage composite fut laissé pendant environ six semaines à la température ordinaire d’appartement. Aux bords des surfaces de section, la masse s’était un peu contractée, de sorte que de l’air y avait pénétré et qu’une
1 ) Les ferments lactiques réduisent très facilement le bleu d’indigo soluble, mais n’ont aucun effet sur le stade noir du pigment du B. cyaneo-fuscus.
LA BIOLOGIE d’üNE BACTÉRIE PIGMENTAIRE.
abondante végétation mucédinéenne s’y était établie ; au milieu, le contact avait été bon, et manifestement il y était arrivé si peu d’oxygène, que la circonférence des surfaces limites seule avait pu en être saturée.
Lorsque les deux moitiés eurent été séparées, on reconnut immédiatement, à l’augmentation du nombre des taches, que l’oxydation des cbromogènes, précédemment invisible, avait eu lieu par la petite quantité d’air absorbé au moment de la coupûre; mais la couleur était restée exclusivement bornée à la moitié malade. Il ressort de là que ni le pigment vert, nile pigment oxydé et de couleur foncée, ne peuvent se diffuser; l’un et l’autre sont donc, pour ainsi dire, fixés chimiquement, ou du moins inclus à l’état solide dans la masse caséeuse. Indirectement, cette même expérience permet aussi de conclure que les B. cyaneo-fuscus sont morts dans toutes les taches; c’est d’ailleurs ce qui sera démontré, dans la section suivante, par des expériences directes.
Comment on isole le B a ci II us cyaneo-fuscus des taches du fromage. Origine de l’infection du fromage. Le traitement par le „petit-lait filant”.
Ce n’est qu’après avoir acquis la connaissance complète de l’histoire biologique du B . cyaneo-fuscus et avoir appris à régler convenablement l’influence de la température et les conditions nutritives, que j’ai réussi à isoler ces bactéries du fromage malade. Qu’on ne s’imagine pas, toutefois, que cet isolement puisse se faire au moyen de toute tache quelconque ; loin de là, car la très grande majorité des taches ne renferment que des bactéries mortes, ou des bactéries dans un état d’affaiblissement tel que la culture en est impossible.. Il faut remonter à des fromages très jeunes et pratiquer, de la manière qui va être décrite, de nombreux ensemencements, pour obtenir par-ci par-là un résultat positif. La pleine conviction que le
M. W. BEYERINCK.
B. cyaneo-fuscus est la cause principale de la maladie des taches n’a été acquise, —je ne veux pas négliger de le dire, — que lorsque, dans une masse de caséine préparée en faisant cailler du lait frais au moyen de la présure, j’eus réussi à provoquer expérimentalement, par l’inoculation du B. cyaneo-fuscus , l’apparition des taches, avec toutes leurs propriétés.
De quelle manière le B . cyaneo-fuscus se laisse-t-il isoler des taches? Pour répondre à cette question, je commencerai par décrire les résultats de l’application aux taches du procédé ordinaire à la gélatine.
Cent centimètres cubes de lait de vache, à 35° C, furent additionnés d’un peu de présure en poudre 1 ) et, après coagulation, filtrés. Le liquide filtré était parfaitement clair, semblable à du petit-lait à fluorescence verdâtre. On y mêla 1 % de peptone sèche, 1 % de glucose et 7 % de gélatine, puis le tout fut bouilli, filtré et stérilisé. La réaction était amphotère, par suite de la présence de phosphates. Cette gélatine fut coulée en plaques épaisses dans des boîtes de verre, puis utilisée de la façon suivante.
D’abord, à l’aide d’une aiguille, on enleva une parcelle de la masse interne d’un fromage d’Edam, vieux et sain 2). Cette parcelle fut écrasée à la surface de la plaque de gélatine et étendue en lignes d’inoculation ; d’autres fois, elle était délayée dans l’eau, puis cette eau servait à arroser la surface de la gélatine, qu’on laissait ensuite égoutter parfaitement. Les germes susceptibles de se développer sur un terrain contenant du sérum de lait apparaissaient au bout de quelques jours, soit dans les lignes d’inoculation, soit en colonies isolées.
i; Voyez la Note 1 pag. 276.
2) Pour extraire d’une substance un peu de la matière intérieure, sans emporter en même temps quelque chose de la surface, il faut en rompre rapidement un gros morceau, afin d’obtenir des surfaces de cassure fraîches, sans glissements internes. Cela est à recommander surtout lorsqu’il s’agit de l’examen d’échantillons de terre, de parties de plantes et, en général, de substances cassantes.
LA BIOLOGIE d’üNE BACTÉRIE PIGMENTAIRE.
Dans un assez grand nombre d’expériences, le fromage sain ne m’a donné de cette manière, — ce qui est d’accord avec les résultats d’observation microscopique rapportés plus haut, — que deux espèces bien caractérisées, à savoir: une levure du sucre de lait, que j’ai nommée Saccharomyces tyrocola, et cinq variétés, appartenant à une seule et même espèce, de bactéries lactiques baculiformes ; ces dernières sont identiques aux ferments lactiques qui sont les agents essentiels dans la fabrication de l’acide lactique industriel au moyen des céréales, aussi bien que dans la préparation de l’acide du commerce au moyen du lait mélangé de sucre de canne et de fromage putréfié. Les variétés se distinguent l’une de l’autre par la différence de longueur des bâtonnets, assez constante à la reproduction, par la couleur plus ou moins jaunâtre des colonies et par une aptitude différente à produire de l’acide avec le sucre de canne, le sucre de lait et la glucose; mais toutes ces différences sont si peu importantes que je n’ai pas à m’en occuper davantage en cet endroit, d’autant plus qu’il a déjà été question ailleurs de la formation d’acide dans le fromage.
Quand, au lieu de la masse saine du fromage, on choisit pour ces recherches bactériologiques les taches bleues, on obtient les mêmes résultats; seulement, dans ces taches bleues, les bactéries de l’acidè lactique sont souvent très fortement accumulées. Cette accumulation doit être expliquée de la manière suivante. Les bactéries en question appartiennent au groupe des organismes à peptone-carbone, c’est-à-dire que pour leur nutrition elles exigent, outre la peptone, l’un ou l’autre composé carboné, par exemple, le sucre de lait Comme elles ne sécrètent pas d’enzyme tryptique, la caséine ne peut satisfaire à leur besoin d’azote. Elles en sont donc réduites, pour cela, aux peptones de la masse caséeuse. Or, le Bacillus cyaneofuscus exerçant une très forte action protéolytique et transforment alors la caséine en peptone, les taches bleues sont, précisément à cause de la peptone qui s’y forme en abondance,
M. W. BEYERINCK.
des lieux de reproduction très favorables pour les bactéries de l’acide lactique. — De bactéries d’autre espèce que les ferments lactiques, je n’en ai pas trouvées dans les taches.
Par ce qui précède, il avait donc été bientôt établi qu’au moyen de la gélatine nourricière indiquée il n’était pas possible d’isoler le Bacillus cyaneo-fuscus. J’ai alors étudié les taches de deux autres manières : premièrement , en
opérant sur la masse provenant d’une dissolution de 10% de gélatine pure dans de l’eau de canal, sans addition d’aucune autre matière : en second lieu, par l’ensemencement direct des taches dans des solutions de peptone diluées. Ces nouveaux essais laissaient espérer un résultat plus favorable, surtout par la raison que, comme nous l’avons vu, ces milieux de culture sont excellents pour le Bacillus cyaneo-fuscus , tandis qu’ils excluent complètement les ferments lactiques, dont la croissance exige, en outre des corps azotés susdits, la présence d’une espèce saccharine. Les cellules de levure sont, elles aussi, tout à fait incapables de se développer sur la gélatine pure ou dans une solution de peptone pure.
Pourtant, même ainsi instituées, les expériences de culture du B. cyaneo-fuscus ne réussirent pas à l’origine, et cela, aussi longtemps que j’y employai du fromage vieux. Mais quand je m’avisai de mettre à l’œuvre du fromage tout à fait frais, qu’un marchand m’avait spécialement fourni à cet effet, le résultat de trois ensemencements différents révéla que le B. cyaneo-fuscus peut parfois se trouver encore à l’état viable, et sans affaiblissement trop prononcé, dans les taches du fromage. Je dois insister, toutefois, sur la circonstance que la teneur en acide de ce fromage jeune était petite, car elle correspondait tout au plus à 5CC de solution potassique normale, pour 100 grammes de fromage. La condition d’une aussi faible proportion d’acide me paraît essentielle pour la réussite des expériences. Il n’y a point de doute, en effet, que l’abondance croissante de l’acide libre, due à la transformation du sucre de lait par les bâtonnets de l’acide
LA BIOLOGIE ü’üNE BACTERIE PIGMENTAIRE. 275
lactique, ne cause la mort du B. cyaneo-fuscus, ce qui explique pourquoi les taches du fromage vieux donnent toujours un résultat négatif dans les essais de culture.
Ainsi qu’il a été dit, ce sont surtout les solutions peptoniques diluées qui conviennent au développement de notre bactérie pigmentaire; aussi, est-ce avec elles que j’ai obtenu les résultats positifs sus dits. La culture directe sur gélatine, en partant du fromage, ne m’a jamais réussi. Mais lorsque, ayant obtenu au moyen du fromage des cultures de B. cyaneo-fuscus dans la solution de peptone, je les laissai, en décembre 1890 et janvier 1891, croître pendant des semaines à des températures variant de 1 à 5° C, en répétant, dès que les liquides verdissaient distinctement, l’ensemencement dans une nouvelle solution nourricière, je parvins finalement à activer une culture au point que la croissance put ensuite s’opérer sur une gélatine à 10 °/0 dans de l’eau de conduite, avec ou sans addition de peptone. Les cultures ainsi réalisées étaient, sauf un certain degré d’affaiblissement, parfaitement identiques aux formes spontanément isolées de l’eau.
Il m’intéressait tout particulièrement de savoir si le B. cyaneofuscus ainsi obtenu peut se développer dans le lait; que la croissance est possible dans la caséine séparée du lait par la présure, c’est ce que m’avaient déjà appris des expériences antérieures. J’ai trouvé que le lait, bouilli ou non, peut effectivement, à basse température, fournir un bon aliment au B. cyaneo-fuscus. Les phénomènes de coloration qui se produisent dans ce liquide sont comparables à ceux qui ont lieu dans les solutions de peptone: d’abord le vert, puis le bleu, ensuite le brun et finalement le noir brunâtre. Ce n’est qu’au bout d’un temps assez long que le corps foncé s’oxyde aux dépens de l’oxygène atmosphérique ; il laisse alors au lait une teinte brun sale, perceptible pendant des mois, mais qui, comparée à celle des solutions de peptone, pâlit très fortement.
De ce qui vient d’être dit, il ressort la possibilité que quelques rares bactéries de notre espèce, entrées dans le lait, s’y
Archives Néerlandaises, T. XXY. 19
M. W. BEYERINCK.
multiplient avant la coagulation par la présure. La lenteur de leur croissance explique pourquoi, dans le fromage mûr, le nombre des taches est, d’ordinaire, relativement petit.
Mais d’où viennent les germes isolés de B . cyaneo-fuscus qui causent l’infection première du lait?
D’après ce qu’on a vu au § 1, la réponse à cette question ne saurait être douteuse. Les germes arriveront dans le lait par l’eau dyant servi à nettoyer les seaux et autres ustensiles de la laiterie, ainsi que par toutes les causes de souillure amenant dans le lait des matières humides, exposées à l’infection spontanée par le B. cyaneo-fuscus.
J’appuie sur la remarque que le contact du lait avec des matières humides est particulièrement à craindre. Plusieurs expériences, en effet, ont eu pour but de décider jusqu’à quel point le B. cyaneo-fuscus peut être desséché sans que la mort s’ensuive. Des bandelettes de papier à filtre et des fils de platine furent chargés de culture de ce bacille, séchés, puis introduits dans des solutions de peptone. Comme je n’ai pas réussi, de cette manière, à revivifier l’organisme, je dois admettre que le B. cyaneo-fuscus ne se trouve pas non plus à l’état vivant dans les poussières de l’air, et que par conséquent l’infection du lait doit toujours avoir pour point de départ des objets humides *). Les solutions très étendues de corps albuminoïdes, — par exemple le lait mêlé d’eau, — qui ont été longtemps abandonnées à elles-mêmes à basse température, seraient tout spécialement à suspecter comme foyers d’infec-
i ) Les bactéries de la présure, au moyen de laquelle s’opère la coagulation du lait, ne me sont qu’imparfaitement connues. J’ignore si le B. cyaneo-fuscus peut vivre dans la présure; la forte proportion de sel ainsi que la présence de l’acide borique dans cette substance rendent la chose improbable. En tout cas, il est à recommander de se servir, pour la fabrication du fromage, de présure en poudre sèche, qu’on fait dissoudre, à la température convenable, dans du lait ou dans de l’eau pure, préalablement bouillie; dans cette poudre, le B. cyaneo-fuscus est certainement mort. On peut se procurer une préparation excellente dans la fabrique de produits de lait du docteur H. Graefe, à Alkmaar.
LA BIOLOGIE d’üNE BACTÉRIE PIGMENTAIRE.
tion. Comme sources originelles, toutefois, le rôle principal paraît devoir être attribué, de même que dans mes essais d’isolement, à l’eau de conduite ou de canal, ainsi qu’aux particules de terre. La pratique a donc à tenir compte de pareils habitats, et le seul moyen absolument sûr de rester à l’abri des atteintes de cette bactérie et de toutes les autres espèces nuisibles serait l’emploi général et exclusif de lait retiré à l’état stérile du pis des vaches. Dès l’année 1878, M. Lister a fait voir 1 ) que le lait des vaches saines est stérile, et que l’opération de le recueillir en cet état exige à la vérité des soins, mais est à la portée de tout le monde. Une prescription légale à cet égard, d’ailleurs parfaitement justifiée par l’importance hygiénique de l’opération, aurait promptement raison du préjugé de l’impossibilité de celle-ci.
Pour certains buts déterminés il faudrait alors, naturellement, ajouter quelque culture de bactéries. C’est ce qui se fait déjà actuellement en Nord-Hollande, où l’on emploie, dans la fabrication du fromage, le petit-lait dit „ filant” (culture, dans le petit-lait, d’un microcoque mucipare de l’acide lactique) 2); un grand progrès est ainsi réalisé, en tant que l’industrie fromagère, encore très primitive au sens bactériologique, peut maintenant combattre avec succès différentes maladies dangereuses, qui attaquent ses produits. De ce nombre est aussi la maladie des taches; dans les fromageries où elle apparaît,
1) Transactiotis Pathological Soc. of London, T. XXIX, 1878.
2) En Hollandais vlange wei ”. J’ai examiné cette matière remarquable par les méthodes bactériologiques, et j’ai trouvé que l’organisme mucipare est un ferment lactique qui produit aussi un arôme agréable, et dont la propriété la plus intéressante est de perdre bientôt, dans les cultures pures, la faculté de rendre le petit-lait filant; elle se change alors en un ferment lactique ordinaire Je n’ai pas encore eu l’occasion de rechercher la cause de ce phénomène. Voyez aussi : H. Weigmann, Der Organismus der sogenannten „lange Wei ”, dans: Milchzeitung , Jahrg. 8, p. 982, 1889.
C’est un simple paysan d’Assendelft qui a découvert, il y a un quarantaine d’années, l’utilité et l’usage de cette substance, devenue populaire seulement dans les derniers temps par les efforts de Mr. Roekel.
M. W. BEYERINCK.
le petit-lait filant apporte une amélioration considérable. L’action exercée dans le fromage par ces bactéries mucipares n’est pas encore complètement expliquée, pas plus que n’est élucidé, d’ailleurs, le processus de la maturation en général. Pour ce qui concerne, toutefois, leur antagonisme par rapport au B. cyaneo-fuscus , on s’en rend aisément compte. Il dépend de deux facteurs, à savoir, de la production d’acide lactique et de l’absorption complète d’oxygène par l’immense quantité de bactéries mucipares qu’on mêle avec la masse caséeuse. Que les acides empêchent la croissance du B. cyaneo-fuscus , nous l’avons déjà vu précédemment. Quant au nombre des bactéries, pour s’en faire une idée, il suffit de savoir qu’aux 25 litres de lait, employés à la fabrication d’un fromage d’Edam, on ajoute, en même temps que la présure, V2 litre de „petitlait filant” ; or, cette substance ne consiste pour ainsi dire qu’en une agglomération de bactéries excessivement petites, lesquelles, lorsqu’on fait écouler le petit-lait, restent presque toutes, à cause de leur nature mucilagineuse et gluante, enfermées dans le fromage, dont le volume n’atteint pas trois décimètres cubes. Qu’une pareille masse de bactéries, accumulée dans un si petit espace, puisse, tant par la formation d’acide lactique que par l’absorption d’oxygène, entraver ou prévenir le développement de bactéries aussi sensibles que le B. cyaneo-fuscus , il n’y a certes pas lieu de s’en étonner.
Laboratoire Bactériologique de la Fabrique Néerlandaise de Levure et d’Alcool à Delft.
Explication des figures.
(Planche II).
Fig. 1. Couche de gélatine (10°/o de gélatine et XA °/0 de peptone dans de l’eau de conduite), avec colonies de Bacillus cyaneo-fuscus, dans une boîte de verre, gw Paroi de la boîte, dg couvercle tourné vers le bas. Les colonies, fortement liquéfiantes, consistent en
LA BIOLOGIE D’UNE BACTÉRIE PIGMENTAIRE
une couche de bactéries bs , appliquée sur la gélatine ge ; tout autour, se trouve la zone brune dz de la matière colorante diffusée dans la gélatine, avec cristaux disséminés de carbonate de chaux.
Fig. 2. Œuf cuit dur et dépouillé de sa coque, avec plages d’inoculation du B. cyaneo-fuscus , liquéfiées au centre. (Comp. fig. 6)
Fig. 3. Cultures de B. cyaneo-fuscus dans de l’eau de conduite contenant % °/Q de peptone, à la température de 6° C.
a. Premier stade, ou stade vert, au cinquième jour après l’inoculation.
b. Stade bleu, au septième jour; la teinte brune est produite par oxydation à partir de la surface et se change bientôt en gris.
c. Stade brun, du neuvième jour.
d. Stade noir, au treizième jour.
e. Culture décolorée par l’oxydation lente sous l’influence de l’oxygène de l’air; dérivée du stade noir, au bout de deux mois, à la température de 6° C.
Fig. 4. Aspects des bactéries des cultures peptoniques.
a. Le liquide bleu du petit matras b fig. 3.
a, Bactéries incolores, vivantes, souvent mobiles. g. Bactéries brunes, mortes.
y. Corpuscules de matière colorante bleue. ô. Corpuscules de couleur foncée, à facettes cristallines.
b. Pellicule bactérienne, provenant d’une culture d fig. 3. Toutes les bactéries sont vivantes et très uniformément unies en une pellicule continue, dans laquelle on voit disséminées les sphérites de matière colorante bleue.
Fig. 5. Cultures de B. cyaneo-fuscus sur gélatine (10°/o) dissoute dans de l’eau de conduite.
«. Bactéries vivantes
