MODE DE DÉNITRIFICATION ET SUR LE SCHIZOMYCÈTE QUI LA PRODUIT
PAR
E. GILTAY et J. H. ABERSON.
A l’occasion d’une étude sur l’action que les bactéries exercent dans le sol, nous nous sommes occupés assez longuement de la réduction des nitrates par les schizomycètes.
Il n’y a pas encore longtemps que cette action bactérienne est connue tant soit peu exactement.
En 1868, M. Reiset 1) attira l’attention sur le fâcheux développement de vapeurs nitreuses dans la fermentation alcoolique du suc de betterave. Selon l’auteur, ce phénomène avait déjà souvent été regardé comme dû à la réductien de nitrates; mais lui-même ne pouvait partager cette manière de voir, parce qu’alors, à son avis, il serait incompréhensible que l’addition de 2 gr. d’acide sulfurique par litre de jus empêchât infailliblement l’apparition des susdites vapeurs. M. Reiset pensait que le dioxyde d’azote provenait d’ammoniaque, et que l’acide sulfurique ajouté fixait cette ammoniaque, de telle sorte qu’elle ne se laissait plus décomposer.
M. Schloesing, toutefois, s’éleva contre cette explication 2). L’un de ses prédécesseurs à l’Ecole des Tabacs, M. Ch. Rey, avait observé que lorsque du jus de tabac fermente en vase clos, il se dégage de l’oxyde d’azote. M. Schloesing, en colla-
J) Comptes rendus , T, LXI, p. 227.
// u n II h 237 .
E. GILTAY ET J. H. ABERSON.
boration avec M. Rey, détermina donc la proportion des nitrates dans le jus avant et pendant la fermentation; de ces dosages il conclut que le dégagement d’oxyde d’azote s’accompagne toujours de la disparition de nitrate, et réciproquement. Quand le jus ne contient pas de nitrate, aucune production d’oxyde d’azote n’a lieu.
De l’urine, à laquelle on avait ajouté du nitrate, donna en se putréfiant de l’oxyde d’azote et du dioxyde d’azote.
De l’eau sucrée, amenée à fermenter par l’addition d’un peu de fromage, donnait C02, iV, NO et N02 lorsqu’à la solution il avait aussi été ajouté du nitrate, mais seulement CO 2 et H quand le nitrate manquait.
Dans des solutions de nitrate où l’on avait mis des débris de plantes, il y eut également décomposition de nitrate aussitôt que la fermentation se fut établie.
L’obstacle que la présence d’un acide apporte à la production de N ou de gaz contenant N, fut reconnu aussi par M. Schloesing. Il n’obtint même jamais la décomposition des nitrates avant que les liquides ne fussent devenus neutres ou alcalins. Son explication, toutefois, est autre que celle de M. Reiset. Il cherche la cause du phénomène dans ce fait que la fermentation s’opère ordinairement dans des milieux neutres ou alcalins, et qu’en général les matières organiques fermentantes exercent une forte action réductrice.
La réduction des nitrates, aux yeux de M. Schloesing, n’était donc pas elle-même un processus de fermentation, mais simplement une conséquence d’un pareil processus.
En 1873, M. Schloesing J) trouve, dans la terre, une décomposition de nitrates s’opérant de façon que de l’azote seul est mis en liberté; mais l’action qui avait lieu en ce cas ne consistait pas uniquement en réduction des nitrates, car il se dégageait plus d’azote que le nitrate n’en contenait.
En 1875, M. Meusel 2) observa, dans des eaux naturelles,
1) Comptes rendus , T. LXXVII, p. 353.
2) Journal de Pharmacie et de Chimie , 4eSér.,T. XXII, p. 430.
SUR UN MODE DE DENITRIFICATION ETC
la formation de nitrites aux dépens de nitrates; il attribue cette transformation à des organismes inférieurs, vu qu’elle est empêchée par l’action de substances antiseptiques.
L’apparition du monoxyde d’azote par réduction de nitrates sous l’influence d’un peu de terre, fut constatée aussi, en 1882, par MM. Dehérain et Maquenne. 1 ).
En 1879, M. Warington 2) avait publié une étude sur la nitrification. Il en résultait qu’aux dépens du chlorure d’ammonium il peut se former aussi bien du nitrite que du nitrate, en proportions variables. La raison de ces différences lui était restée inconnue: Il présume seulement que „la condition
du ferment” y jouait un rôle. M. Duclaux 3) pense à cet égard, en 1883, que là où des nitrites prennent naissance à côté de nitrates, il a dû intervenir aussi bien un ferment nitrifiant qu’un fermant dénitrifiant.
Les recherches les plus importantes dont nous ayons à parler sont celles de MM. Gayon et Dupetit 4).
Selon ces auteurs, la plupart des microbes possèdent plus ou moins le pouvoir de former des nitrites aux dépens des nitrates. Ils ont même trouvé une bactérie qui, dans un bouillon contenant 1 % de nitrate, réduit tout ce sel à l’état de nitrite.
Plus particulièrement, toutefois, ils se sont occupés de la dénitrification dans laquelle il se dégage des produits gazeux. Les décompositions étudiées étaient dues à deux organismes, qu’ils distinguent comme Baderium denitrificans a et
Ces organismes furent cultivés surtout dans du bouillon nitraté et dans un liquide nutritif artificiel contenant outre 10 % de nitrate, principalement de l’acide citrique, de l’asparagine, du phosphate de potasse et du sulfate de magnésie,
1) Comptes rendus , T. XCV, p. 691.
2) Journal of the Chemical Society , Juill 1879.
3) Chimie biologique , p. 714.
*) Recherches sur la réduction des nitrates par les infiniment petits. Nancy, Berger-Levrault & Cie, 1886,
E. GILTAY ET J. H. ABERSON.
puis de petites quantités de chlorure de calcium, de sulfate de fer, de sulfate d’alumine et de silicate de soude, et autant d’ammoniaque qu’il en fallait pour neutraliser le liquide.
Le Bacterium denitrificans a, avec le liquide nourricier artificiel, donne toujours, comme produits de décomposition gazeux, de l’azote et du monoxyde d’azote; lorsqu’il n’y a pas d’asparagine, il se dégage seulement de l’azote; dans le bouillon nitraté il se forme des nitrites, lesquels manquent dans le liquide nourricier artificiel ; cette bactérie agit avec plus de force que la seconde, tout le nitrate du liquide nutritif, dans lequel elle vit, pouvant être décomposé.
Le Bacterium denitrificans p ne donne toujours que de l’azote et laisse intact beaucoup de nitrate ; aussi bien dans le bouillon nitraté que dans le liquide nutritif actificiel, il forme des nitrites.
Les auteurs expérimentèrent surtout avec la forme a, à cause de son activité plus grande. Une température d’environ 35° C. est très favorable à la dénitrification. L’intervention de l’air diminue la quantité de nitrate qui est décomposée Dans une fermentation épuisée, l’énergie vitale des bactéries décroît très rapidement. En ce qui concerne l’influence de la proportion de nitrate, la fermentation dans le bouillon se montrait la plus active lorsque celui-ci contenait environ l°/o de nitrate. L’opération se faisait dans une espèce de petits matras où il ne restait, au-dessus du liquide, qu’une très petite quantité d’air „une quantité absolument négligeable”, selon les auteurs.
Sur le rapport dans lequel se forment l’azote et le monoxyde d’azote, différentes circonstances ont de l’influence. La proportion de N O était plus forte à 35° qu’à 15°, plus forte en cas d’ensemencement léger qu’en cas de semis abondant, plus forte aussi quand le liquide nutritif était plus concentré.
La signification du processus est aussi devenue mieux connue à la suite des recherches de MM. Gayon et Dupetit. Us ont fait voir que leurs bactéries réductrices, en cas de manque d’oxygène, ne se développaient bien que si, outre les autres matières nutritives, il y avait des nitrates dans le liquide.
SUR UN MODE DE DENITRIFICATION ETC
La décomposition du nitrate ne pouvait donc être quelque chose de secondaire, un effet accessoire de la fermentation ; elle devait avoir de l’importance pour la vie des bactéries.
M. Heraeus ') a étudié l’action de différentes bactéries sur des matières contenant de l’azote. Il en a trouvé deux qui ramenaient l’acide nitrique à l’état d’acide nitreux et d’ammoniaque, l’urée à l’état de carbonate d’ammoniaque ; une troisième consommait les nitrates sans réduction et transformait l’urée en sels ammoniacaux; une autre consommait également du nitrate sans le réduire à l’état de nitrite, mais ne formait pas de sels ammoniacaux aux dépens de l’urée; il y en avait une qui n’exerçait aucune action sur les matières azotées, tandis qu’une autre laissait inaltéré l’acide nitrique, mais transformait l’urée en sels d’ammoniaque. Avec d’autres formes encore, il observa une faible oxydation du carbonate d’ammoniaque. Le fait de la réduction ou de l’oxydation fut trouvé indépendant de l’accès de l’air; les bactéries réductrices, dans de minces couches de liquide, ne produisaient toujours que la réduction, jamais d’oxydation.
L’action réductrice d’un très grand nombre (32) de microganismes, pTovenant de l’air et de l’eau, fut examinée, en 1888, par M. Frankland 2) Avec aucun d’eux, l’auteur n’obtint la réduction complète de l’acide nitrique, et jamais même la réduction n’alla plus loin que la formation d’acide nitreux. L’ammoniaque qui apparaissait était toujours, d’après l’auteur, dérivée de la peptone du liquide nourricier. La réduction fut reconnue indépendante de l’accès ou de l’exclusion de l’air.
Nos propres recherches ont porté sur l’action dénitrifiante d’une espèce de bactérie qui dans nos alentours est souvent très généralement répandue, tant dans le sol que dans l’air.
Nous avons isolé ce schizomycète de la terre, par la mé-
1) Zeitschrift fur Hygiene, herausgegeben von Dr. R. Koch und, Dr. C. Flügge, T. I, 1886, p. 193—231.
2) Journal of the Chemical Society , p. 373 — 391,
E. GILTAY ET J. H. ABERSON.
thode habituelle, au moyen de cultures gélatineuses. La masse nourricière consistait le plus ordinairement en une infusion à 0,2 pour cent de terre dans l’eau, mêlée avec 10 % de gélatine. On peut toutefois employer également bien du bouillon gélatine ordinaire; dans l’une et l’autre masse nourricière le champignon se développe en colonies de même aspect. Pour le recueillir de l’air, nous abandonnions librement à lui-même, dans un laboratoire de l’Ecole d’agriculture de Wageningen, du liquide nourricier contenant des nitrates. La fermentation dénitrifiante s’établissait-elle dans ces conditions, la bactérie active était obtenue à l’état de pureté de la même manière que lorsqu’elle avait été extraite du sol.
Nous parlerons d’abord de la forme extérieure de ce champignon, auquel, pour abréger, nous donnerons un nom, celui de Bacillus denitrificans.
Partons d’une culture en gélatine et infusion de terre. Au moyen d’un fil de platine, préalablement rougi à la flamme, une gouttelette d’une colonie est déposée sur un porte-objet. Comme la bactérie rend la gélatine fluide, le transport se fait très facilement si l’extrémité du fil de platine a été convenablement recourbée en anneau
Beaucoup des bactéries s’agitent vivement. Même chez celles qui sont immobiles, la forme n’est pas facile à étudier, parce qu’elles tranchent très peu sur le reste du champ. Aussi avons nous, pour notre examen, fait usage surtout de préparations colorées par la fuchsine. La fuchsine s’emploie en solution aqueuse étendue ; nous laissons agir celle-ci sur les bactéries pendant 1 3 jours. L’étude
des préparations se faisait toujours avec un objectif apochromatique de Zeiss à immersion dans l’huile, de 2mm de distance focale et de 1.30 d’ouverture numérique, et avec les oculaires à compensation qui se rapportent aux lentilles apochromatiques.
La forme qu’on rencontre le plus communément est celle de bâtonnets doubles, tels que les fig. 1, 2 et 3 (PI. IX) les représentent en contour. La longueur totale du bâtonnet double est d’environ L<,5 à 3.". Les deux articles ne se trouvent or-
SUR UN MODE DE DENITRIFICATION ETC. 347
dinairement pas dans le prolongement l’un de l’autre, de sorte que l’ensemble paraît plus ou moins courbé.
L’épaisseur de bâtonnets est d’environ (V,5.
Outre ces bâtonnets doubles, on rencontre aussi des bacilles simples. Les plus petits de ceux-ci sont longs d’environ 1^ (fig. 4), les plus grands atteignent une longueur de près de 1^,5 (fig. 5 et 6). Parmi ces derniers, toutefois, il y en a beaucoup qui montrent déjà des indices de division.
Dans quelques cas, on trouve des filaments composés de plus de deux articles (fig- 7, 8). Lorsque les bâtonnets doubles unis bout à bout présentaient tous les deux une courbure manifeste, nous avons toujours vu celle-ci dirigée en sens différent.
Dans les liquides que nous avons employés, et dont il sera parlé plus loin, la bactérie acquiert une forme ressemblant sous beaucoup de rapports à celle qui vient d’être décrite. Ici également, on trouve des bâtonnets simples (fig. 9, 10, J 1), qui parfois sont notablement plus épais à une extrémité qu’à l’autre; les formes les plus fréquentes sont de nouveau des bâtonnets doubles (fig. 12, 13, 14) et l’on rencontre aussi des doubles bâtonnets doubles (fig. 15, 16), où toutefois les séparations des cellules ne sont souvent qu’indistinctement visibles. Mais les dimensions ne sont pas les mêmes que chez les*bactéries développées dans l’infusion de terre gélatinée. En premier lieu, ces bactéries sont ordinairement plus longues : les bâtonnets simples atteignent, par exemple, plus de 2«, les bâtonnets doubles de 3(< à 4^,5 ; ensuite, l’épaisseur est moins uniforme chez les différents individus, comme on peut s’en assurer en comparant les fig. 14 et 15 aux fig. 9, 10, 1 2 et 13.
Une première question qui se présente, à l’occasion de cette description, est celle de savoir si notre bactérie est morphologiquement identique avec celle de MM. Gayon et Dupetit, la seule bactérie dénitrifiante qui, à notre connaissance, ait été décrite avec soin.
En ce qui concerne l’épaisseur, il y a accord; celle-ci, en effet, est de O7, 4 — 0W,6 pour le Bacterium denitrijîcans «, de
E. GILTAY ET J. H. ABERSON.
0,5 — 0M,7 pour le B. denitrificans p de Gayon et Dupetit, et de 0W,4 — 0-a,7 pour notre bacille. Il y a similitude aussi sous le rapport de la difficile visibilité des bactéries non colorées. Mais l’accord n’existe plus quant à la longueur. MM. Gayon et Dupetit ont donné pour celle-ci 2 à 4a. Nous aussi, à la vérité, nous trouvons des filaments de cette longueur; mais, pour beaucoup de ceux-ci, il est douteux s’ils ne sont pas composés de 2 cellules, et la longueur la plus ordinaire des filaments qui sont indubitablement des bâtonnets doubles s’élève précisément à 2 — 4.w. Il est certain, en outre, que quantité de nos bâtonnets ont une longueur notablement moindre que 2^. La figure qui accompagne le Mémoire de MM. Gayon et Dupetit, figure faite d’après une photographie, est trop peu nette et à grossissement trop faible pour donner des éclaircissements suffisants.
Nos figures ont été exécutées avec soin, à l’aide de la chambre claire, d’après des préparations colorées par la fuchsine. L’emploi de la chambre claire, pour le dessin des bactéries, paraît être peu usité ; pourtant, avec les moyons appropriés, il est très possible et très recommandable.
En premier lieu, il faut naturellement un système fortement grossissant. Nous nous sommes servis, comme il a déjà été dit, de l’objectif aprochromatique de Zeiss à immersion homogène, de 2mm de distance focale et de 1,30 d’ouverture. Quand cet objectif était employé avec l’oculaire à compensation 18, l’image projetée sur la table au moyen de la chambre claire était grossie 2500 fois. Une amplification aussi considérable ne fait pas, il est vrai, voir plus que ce qu’on peut déjà observer à un grossissement beaucoup moindre *);mais, lorsqu’il s’agit de dessiner de très petits objets, un pareil surgrossissement offre une grande commodité. Pour les objets
i) Voir les importants résultats, encore trop peu connus, des recherches de M. Abbe : Beitràge zur Théorie des Mikroskopes und der mikroskopischen Wahrnehmung , dans Max Schultze, Archiv. für mikroskopische Anatomie , T. IX, 1873. Pour un exposé succinct, on peut consulter: E. Giltay, Sept objets regardés au microscope , Leide, E. J. Brill, 1890, septième objet.
SUR UN MODE DE DÉNITRIFICATION ETC
tels que des préparations fortement colorées de bactéries, son usage est d’ailleurs sans inconvénient, vu que ces préparations permettent un éclairage très intense.
Cherche-t-on maintenant, sur du papier éclairé de la manière ordinaire, à suivre avec un crayon les contours des bactéries, on y éprouve une grande difficulté, parce que la pointe du crayon tranche trop peu sur le reste du champ. Il est très facile, toutefois, de parer à cet inconvénient, en plaçant tout près du papier une lampe vivement éclairante On a soin d’intercepter, à l’aide d’un écran, la chaleur rayonnante, qui pourrait gêner pendant l’exécution du dessin. Le contraste entre le papier et la pointe du crayon devient alors très marqué. A la vérité, l’image du papier fortement éclairé rend moins distincte l’image des bactéries, mais un léger défaut de netteté se supporte beaucoup mieux chez l’objet à calquer que chez la pointe du crayon. En tout cas, il est maintenant facile de trouver, par le réglage de l’intensité lumineuse du papier, le point optimum, où le crayon se détache d’une manière suffisante, tant par rapport aux bactéries que par rapport au reste du champ 1 ).
Après que le contour a été tracé, il est bon de déplacer légèrement le papier, de façon qu’en se servant de la chambre claire on voie l’un à côté de l’autre l’objet et le dessin, puis de les comparer entre eux. Cette comparaison gagne considérablement en sûreté lorsque la figure a été dessinée tout près du bord du papier. Le petit glissement à imprimer à celui-ci peut alors se faire de telle sorte que la rétine, à l’endroit où tombe l’image de la bactérie, ne reçoive pas d’image du papier. En ce cas, la grande clarté de l’image du papier ne vient pas nuire à l’observation de l’objet lui-même. L’objet
i) "Voir, pour des détails plus précis concernant le réglage de l’intensité lumineuse dans l’emploi de la chambre claire: E Giltay, Inleiding tôt hel gebruik van den microscoop , Leiden, E. J. Brill, 1885, p. 187 et suiv., ou bien: Théorie der Wirkung und des Gebrauches der Caméra lucida, von Dr. E. Giltay, Zeitschrift fur wissenschaftliche Mikroskopie; Bd. I, p.ll etsuiv.
E GILTAY ET J. H. ABERSON.
et le dessin se voient donc tous les deux très nettement et se prêtent à une comparaison minutieuse ; le dessin peut être corrigé jusqu’à ce qu’il présente avec l’objet le degré d’accord nécessaire.
En ce qui concerne le mode de culture, nous avons déjà dit comment nos cultures pures ont été obtenues. Comme milieu liquide, nous avons employé surtout le bouillon et un liquide nourricier artificiel, préparé d’abord suivant le précepte de MM. Gayon et Dupetit, ensuite sous deux formes modifiées.
La première de celles-ci, qui sera aussi la première dont nous dirons comment les bactéries s’y comportent, contenait, par litre d’eau, 2 grammes de nitrate de potasse, 1 gr. d’asparagine, 2 gr. de sulfate de magnésie, 5 gr. d’acide citrique, 2 gr. de monophosphate de potasse, 0,2 de chlorure de calcium et une couple de gouttes de perchlorure de fer. L’acide était neutralisé par l’addition de potasse.
La, modification apportée au liquide nourricier consistait donc essentiellement dans l’emploi de moins de nitrate et dans la neutralisation par la potasse au lieu de l’ammoniaque. Les motifs de ces modifications étaient, en premier lieu, que 10 % de nitrate dégageaient trop de gaz, ce qui présentait des inconvénients eu égard à la capacité de notre étuve pour cultures ; en second lieu, que, pour mieux pouvoir étudier le changement subi par le N du nitrate lors de la fermentation, nous ne voulions pas introduire dans le processus, par l’addition d’ammoniaque, des complications éventuelles. Pour cette même raison, l’asparagine aussi fut plus tard remplacée par la glycose, comme nous le verrons.
Le mode de préparation du liquide nourricier, mode qui n’est pas indifférent au point de vue de l’obtention d’une dissolution limpide et incolore, était le suivant. Dans un premier vase à précipité le nitrate de potasse et l’asparagine étaient dissous dans environ 250cm,c d’eau; dans un second vase, les autres matières, dans environ 500cmc d’eau. Dans
SUR UN MODE DE DÉNITRIFICATION ETC
ce dernier vase on neutralisait d’abord l’acide citrique par la lessive de potasse, puis les deux liquides étaient mélangés dans un matras de jauge, refroidis jusqu’à 15° C. et portés, par l’addition d’eau, au volume de 1 litre.
Lorsque la dissolution du nitrate de potasse et de l’asparagine est opérée simultanément avec celle des autres sels, une décomposition se produit entre l’acide citrique et le nitrate de potasse, et l’acide nitrique mis en liberté exerce une action oxydante sur les matières organiques du mélange. Le liquide se colore en brun et contient de l’acide nitreux.
Le second liquide nutritif artificiel renfermait, au lieu d’asparagine, de la glycose, à savoir, 2 grammes par litre. Dans ce liquide surtout, il faut neutraliser très exactement par la potasse, vu que le moindre excès de celle-ci détermine de l’humification quand on stérilise le liquide.
A ces matières nutritives liquides nous avons ordinairement, surtout la seconde année de nos cultures du Bacillus denilrificans, ajouté un peu de carbonate de chaux pulvérisé. La première année, une action réductrice suffisante avait à la vérité été obtenue même sans cette addition; plus tard, néanmoins, nous en avons presque toujours fait usage, parce que la réduction en était manifestement favorisée.
Que le carbonate de chaux ne joue pas un rôle indifférent dans la vie des schizomycètes, c’est ce qui ressort encore du fait que, dans le dépôt, la bactérie se développe en application directe sur les petits cristaux de ce carbonate 1 ), comme le représente la fig. 17. Dans cette figure, plusieurs bactéries sont placées plus ou moins obliquement par rapport
i) La fig. 17 est dessinée à trop petite échelle pour que nous puissions répondre, au même degré que dans les fig. 1 — 16, de la parfaite exactitude des formes et des dimensions des bâtonnets. Aussi est-elle destinée seulement à montrer la situation relative des bactéries et des cristaux. — Un recouvrement du même genre a été observé par M. Winogradsky, dans ses cultures pures de bactéries nitrifiantes, par rapport à de petits cristaux de carbonate basique de magnésie (Annales de V Institut Pasteur, 1890, p. 226)
E. GILTAY ET J. H. ABERSON.
aux arêtes des cristaux; mais cela paraît tenir à ce que, pendant la préparation, il y en a toujours quelques-unes qui sont dérangées de leur position primitive.
Nos premières cultures datent de l’hiver de 1889 — 1890. Elles n’eurent que peu de succès. A l’origine, il était facile d’obtenir la réduction. Nous n’avions qu’à abandonner un peu de liquide nutritif au contact de l’air, pour voir la fermentation apparaître au bout de quelques jours. Elle s’établissait encore plus rapidement quand le liquide nutritif recevait une addition de terre, et les cultures pures dans la gélatine se faisaient aussi sans aucune peine. Mais, avant que toutes les difficultés qui se présentaient dans l’étude quantitative du processus de réduction eussent été surmontées, nos cultures se mirent à fermenter de moins en moins, et finalement elles ne fermentèrent plus du tout. Ni par l’ensemencement avec la terre, ni par l’exposition à l’air, une réduction tant soit peu notable ne put plus être provoquée. D’un grand nombre de manières, entre autres en apportant à nos liquides des modifications très variées, nous cherchâmes à obtenir de nouveau des cultures douées de l’activité primitive. Toutes ces tentatives échouèrent. Aussi, des résultats trouvés à cette époque, nous ne mentionnerons qu’un seul. Quand par une culture on fait passer sans interruption un fort courant d’air stérilisé, nulle décomposition de nitrate ne s’opère. MM. Gayon et Dupetit avaient d’ailleurs déjà reconnu que lorsque la culture a lieu dans une mince couche de liquide nutritif, la dénitrification diminue dans une très forte mesure, bien que, de cette manière, une partie du nitrate soit encore toujours décomposée.
Dans l’hiver de 1890 — 1891, nous fûmes plus heureux.
Au commencement du mois de novembre dernier, nous pûmes de nouveau obtenir facilement en culture pure, tant aux dépens de l’air que de l’eau, une bactérie fortement dénitrifiante, dont l’aspect extérieur concordait avec celui du microbe que nous avions cultivé l’année précédente.
SUR UN MODE DE DÉNITRIFICATION ETC
Nos expériences portèrent principalement sur la descendance d’une culture pure qui avait été obtenue d’un tube à liquide nutritif dans lequel la dénitrification était apparue à la suite de l'exposition à l’air. Outre cette série, il y en avait toutefois encore d’autres en culture. Chaque jour, le plus souvent, une nouvelle culture était faite dans chacune des séries ; la semence était presque toujours fournie par la culture du jour précédent. Une culture en liquide nourricier contenant du nitrate était ordinairement trouble en moins de 24 heures et avait alors déjà commencé à dégager du gaz; au bout de deux fois 24 heures, la fermentation avait atteint son maximum.
Pour plus de sûreté, on intercalait de temps en temps entre les cultures en milieux nutritifs liquides, une culture sur gélatine. Probablement, toutefois, cette mesure de précaution a été superflue. Jamais, en effet, nous n’avons pu découvir de cette manière des impuretés dans nos cultures.
Les fermentations avaient lieu dans une étuve d’élevage, où la température, de 30 u C. pendant le jour, s’abaissait ordinairement la nuit jusqu’à 10° — 20° C.
Bien que, dans ce second hiver, nous ayons pu accomplir au moins une partie nettement circonscrite de la tâche que nous nous étions imposée, le cours des recherches fut pourtant interrompu une couple de fois par un affaiblissement considérable de l’énergie des fermentations. Mais, contrairement à ce que nous avions éprouvé l’hiver précédent, ces perturbations furent simplement passagères. La cause nous en est d’ailleurs restée inconnue, tout comme celle des premières.
Pour l’étude quantitative des fermentations nous avons fait usage, après divers essais, de petits matras d’une forme particulière (voir PL IX, fig. 18) que M. Geisler, de Bonn, construisit pour nous avec son habileté bien connue.
La partie A a une capacité d’environ 100 cmc. Elle porte latéralement une tubulure b, munie d’un petit robinet k. En haut, elle présente un col, sur lequel s’adapte exactement, usé à l’émeri, un petit tube à ampoule F. Ce tube est à
E. GILTAY ET J. H. ABERSON.
son tour recouvert d’un bouchon rodé, qui se termine en un tube plus étroit b'. Sur ce dernier s’adapte un tube abducteur en caoutchouc à parois épaisses, à l’autre extrémité duquel se trouve encore un petit tube recourbé b".
Le matras A est rempli du liquide nitritif, ordinairement jusqu’à la ligne pointillée 1. A l’aide du pycnomètre, on détermine exactement le poids spécifique du liquide nutritif, de sorte que le volume de celui-ci, introduit dans le matras, se trouve par la pesée. L’appareil entier est stérilisé dans un courant de vapeur d’eau, après qu’un tampon de ouate a été lié sur le petit tube b".
Lorsque le matras a été ensemencé, on ajoute au liquide nutritif un peu de carbonate de chaux stérilisé. Comme nous nous proposions d’étudier la fermentation surtout en cas d’absence ou du moins d’accès très faible de l’oxygène, on achevait de remplir le matras, jusqu’à la ligne pointillée 2, avec de l’huile stérilisée. Le reste de l’appareil était laissé rempli d’air; nous verrons tout à l’heure comment on déterminait le volume de celui-ci. Le gaz emmené par le tube abducteur est recueilli dans un eudiomètre, sur le mercure. Lorsque la fermentation est terminée, tout le gaz encore contenu dans l’appareil en est chassé par l’ébullition dans un bain de chlorure de calcium, et également recueilli sur le mercure. Pour empêcher que dans cette opération du gaz ne s’échappe, les différentes parties de l’appareil sont maintenues serrées les unes sur les autres par des ressorts à boudin en cuivre, attachés en dessous et en b'. L’ampoule V servait à prévenir que durant l’ébullition le liquide nutritif dilaté ne rencontrât subitement le tube abducteur très étroit, à obtenir par conséquent une ébullition paisible, et, en outre, à empêcher qu’une trop grande quantité du liquide ne passât dans l’eudiomètre. Finalement, on analyse aussi le gaz chassé par l’ébullition et, au besoin, on soumet encore le liquide à un examen ultérieur.
Pour savoir en quelle proportion les gaz recueillis ont été développés par la fermentation, et en quelle proportion ils
SUR UN MOUE DE DÉNITRIFICATION ETC
existaient déjà dans l’appareil avant ce processus, il faut naturellement déterminer d’abord la capacité de l’espace contenant de l’air, puis la quantité de gaz qui se trouve en dissolution dans le liquide nutritif. La capacité de la partie de l’appareil non remplie dë liquide se trouvait en introduisant d’abord de l’eau dans le matras jusqu’à la seconde ligne pointillée, et en y faisant ensuite arriver de l’eau, à l’aide d’une burette reliée au tube b , jusqu’à ce que l’appareil en fût entièrement rempli, l’eau affleurant à l’embouchure du tube b". Quand l’opération est exécutée avec soin, les résultats des déterminations répétées concordent toujours jusqu’aux dixièmes de centimètre cube.
La quantité de gaz que le liquide nutritif tient en dissolution dépend du temps écoulé entre la stérilisation et le début de la culture. A raison de cette circonstance, on détermina pour quelques matras, qui avaient été remplis et stérilisés de la manière ordinaire, mais qui ensuite étaient restés non ensecéens pendant des temps inégaux, la quantité de gaz dissous ; des résultats ainsi obtenus on déduisit, par le calcul, les données nécessaires.
Le gaz recueilli pendant la fermentation consistait toujours en un mélange d’azote, d’acide carbonique et d’oxygène.
De l’absence d’hydrogène nous nous sommes assurés en faisant jaillir dans le gaz, préalablement mêlé d’oxygène, des étincelles électriques. L’absence d’hémioxyde d’azote fut constatée, dans quelques analyses, en abandonnant, le gaz dégagé après absorption de l’acide carbonique par la potasse solide, au-dessus de l’alcool, dans lequel le gaz hilarant se dissout facilement. La preuve que le gaz ne contenait pas de dioxyde d’azote résultait d’abord de ce qu’il était incolore et ensuite de ce qu’un peu d’eau, qui avait été quelque temps en contact avec lui, ne donnait pas de réaction avec la diphénylamine ; le monoxyde d’azote aurait été converti par l’oxygène en dioxyde, de sorte que ce gaz non plus n’existait pas dans le mélange.
L’oxygène qui au début d’une culture se trouve dans l’ap-
Archives Néerlandaises, T. XXV. 24
E. GILTAY ET J. H. ABERSON.
pareil, au-dessus du liquide , ne se retrouve par tout entier à la fin de l’expérience.
Nous avons reconnu que cette absorption d’oxygène doit avoir été produite, au moins en très grande partie, par l’huile, et non par le liquide que celle-ci recouvrait. En effet, lorsque dans notre étuve nous placions des eudiomètres qui contenaient, au-dessus du mercure, ou bien une petite couche d’huile, ou bien une couche semblable recouvrant un peu de lessive de potasse et d’acide pyrogallique, la différence en absorption d’oxygène était une quantité qui tombait entre les limites des erreurs d’observation.
Pour déterminer la quantité d’azote, l’acide carbonique et l’oxygène étaient absorbés par la lessive de potasse et par l’acide pyrogallique.
Après l’ébullition, le liquide nutritif était filtré, puis la dissolution limpide était essayée quant à la présence de l’ammoniaque par le réactif de Nessler, quant à celle de l’acide nitreux par le sulfate de naphtylamine et l’acide sulfanilique, et quant à celle de l’acide nitrique par la diphénylamine. Dans cette dernière réaction, le mélange avec une quantité quadruple d’acide sulfurique doit être opéré dans un vase fortement refroidi, parce que, sans cette précaution, le liquide se colorerait en noir.
Pour les fermentations qui furent étudiées quantitativement, nous avons d’abord fait usage du liquide nourricier contenant de l’asparagine et 2 grammes de nitrate (voir p. 350). Avec ce liquide furent obtenus les résultats suivants :
Liquide nourricier contenu dans les matras, en cmc.
Analyse 1. Analyse 2. Analyse 3. Analyse 4. 97 94,1 92,4 101,5
De ce contenu on obtint successivement en azote, réduit à 0° et à 760mm de pression barométrique:
SUR UN MODE DE DENITRIFICATION ETC
a. dans le gaz échappé du matras durant la fermentation:
b . par
l’ébullition du contenu
du matras:
soit, ensemble:
Azote des gaz contenus dans les appareils, réduit à 0° et 760mm de pression barométrique:
a. dans l’air au-dessus du liquide:
dissous
dans le liquide :
soit,
ensemble :
de sorte que, pour la quantité d’azote dégagée par la fermentation, on trouve :
L’azote du nitrate contenu dans le liquide nourricier s’élevait, sous forme de gaz à 0° et 760mm, à:
La fermentation achevée, le liquide nourricier ne contenait dans aucun des appareils de l’acide nitrique ou de l’acide nitreux, mais dans tous de l’ammoniaque.
Le nitrate ayant donc été partout décomposé complètement, et la quantité de l’azote dégagé par la fermentation étant dans trois des quatre cas notablement supérieure à celle que pouvait fournir le nitrate, il faut qu’une partie de cet azote provienne de l’asparagine,
Mais, comme il s’est aussi formé de l’ammoniaque, il reste de l’incertitude quant à la manière dont l’azote du nitrate s’est comporté dans la fermentation. Pour savoir si le nitrate peut se dédoubler de telle sorte que tout son N apparaisse
E. GILTAY ET J H ABERSON.
à l’état de gaz, nous avons expérimenté aussi avec un liquide nourricier dans lequel le nitrate était la seule combinaison azotée, et où, comme matière organique, se trouvait, outre l’acide citrique, de la glycose.
Les résultats ainsi obtenus sont les suivants:
Liquide nourricier contenu dans les matras, en cmc. :
Analyse 5. Analyse 6. Analyse 7. Analyse 8.
De ce contenu on obtient successivement en azote, réduit à 0° et à 760mm de pression barométrique:
a. dans le gaz échappé du matras durant la fermentation;
b. par ]
L’ébullition du contenu
du
matras :
soit,
ensemble :
Azote des gaz contenus dans les appareils, réduit à 0° et à 760mm de pression barométrique:
a. dans l’air au-dessus du liquide :
/3. dissous
dans le liquide:
soit,
ensemble :
de sorte que, pour la quantité d’azote dégagée parla fermentation, on trouve:
L’azote du nitrate contenu dans le liquide nourricier s’élevait, sous forme de gaz à 0° et 760mm, à:
SUR UN MODE DE DENITRIFICATION ETC. 359
La fermentation achevée, on ne trouve, dans le liquide nourricier soumis à l'ébullition, ni acide nitrique, ni acide nitreux, ni ammoniaque.
A très peu de chose près, la quantité d’azote dégagée par la fermentation concorde maintenant avec la quantité de cet élément contenue dans le liquide nourricier; la différence, en effet, n’est que de 0,4 à 1,1 %. Dans les quatre cas, la première de ces deux quantités est un peu moindre que la seconde.
Cela conduirait peut-être à croire qu’il s’était pourtant formé un peu d’ammoniaque, et que celle-ci ne s’était pas retrouvée dans le liquide bouilli parce qu’elle avait passé à la distillation.
Mais cette idée ne saurait être admise, vu que, même après des fermentations non étudiées quantitativement et où le liquide n’avait pas subi l’ébullition finale, la présence de l’ammoniaque ne put jamais être constatée dans ce liquide.
Le léger déficit en azote doit être attribué en partie à l’assimilation de cet élément pour la constitution du plasma de la bactérie, et une faible quantité peut aussi s’être échappée par le tube de caoutchouc.
De tout ce qui précède, résultent les conclusions suivantes:
1. A Wageningen, dans l’automne de 1889 et de 1890, il se trouvait, très répandue dans la terre, dans l’eau et dans l’air, une bactérie capable de réduire complètement les nitrates.
Ce fait nous paraît mériter une mention spéciale, surtout si l’on considère que M. Frankland 1 ), qui pourtant étudia 32 bactéries, recueillies dans l’air et dans l’eau, au point de vue de la décomposition des nitrates, n’en trouva pas une seule qui exerçât une action aussi énergique. Lors même que la décomposition avait lieu, celle-ci, dans les cas où ce point fut examiné, n’alla pas plus loin que la réduction à l’état de nitrite.
i) Voir ci-dessus, p. 345.
E. GILTAY ET J. H. ABERSON.
2. La bactérie en question, que nous nommerons Bacillus denitrificans tant qu’elle n’aura pu être identifiée positivement avec quelque espèce déjà connue, présente, sous le rapport de la forme, plusieurs analogies avec le Bacterinm denitrificans a et (3 de Gayon et Dupetit ; les données ne permettent pas, toutefois, de se prononcer définitivement au sujet de l’identité morphologique.
3. La présence du carbonate de chaux favorise l’action dénitrifiante. Le schizomycète, en se développant, recouvre les petits cristaux du carbonate.
4. La fermentation occasionnée par notre bactérie n’est pas la même que l’une des autres fermentations déjà décrites. Elle se rapproche le plus des décompositions qu’ont étudiées M.M. Gayon et Dupetit.
Dans un liquide nourricier contenant du nitrate et de l’asparagine, le Bacterium denitrificans « de Gayon et Dupetit donnait toujours la décomposition totale du nitrate, sans formation d’acide nitreux, et comme produits gazeux l’azote et le monoxyde d’azote: le Bacterium denitrificans (t des mêmes auteurs laissait, dans le susdit liquide nutritif, beaucoup de nitrate inattaqué, donnait toujours du nitrite et, comme produit gazeux, rien que de l’azote. Notre Bacillus denitrificans , au contraire, décompose tout le nitrate, ne forme pas de nitrite et, comme produit gazeux, ne fournit que de l’azote. La question de savoir si tout l’azote du nitrate apparaît sous forme gazeuse, n’est pas facile à trancher quand le liquide nourricier contient de l’asparagine, parce que celle-ci renferme également de l’azote, et parce que. avec elle, la fermentation forme aussi de l’ammoniaque. Mais lorsque l’asparagine est remplacée dans le liquide nourricier par la glycose, on ne trouve pas d’ammoniaque après la fermentation, et la quantité de l’azote dégagé correspond à celle de l’azote du nitrate.
En ce qui concerne la signification physiologique du phénomène, on est conduit, eu égard à des données thermochimiques connues, à admettre que la décomposition du nitrate
SUR UN MODE DE DENITRIFICATION ETC
est une manifestation dn processus par lequel le Bacillus déni trificans sait se procurer de T énergie en cas d’accès insuffisant de l’oxygène. Le processus tout entier consisterait alors en ceci, que le schizomycète peut brûler de la matière organique au moyen du salpêtre, en émettant, comme produit accessoire, de l’azote. Cette décomposition fait songer, dans une certaine mesure, à l’explosion de la poudre à canon. Une petite partie du nitrate du liquide nourricier peut, naturellement, fournir aussi l’azote nécessaire à la substance corporelle du champignon.
L’explication du recouvrement des particules calcaires par le bacillus reste provisoirement obscure; à moins de supposer notre bacille tellement sensible à toute réaction acide, que le contact direct avec une matière neutralisante lui facilite la vie.
! li' ' '
' ■ w- Pi I
Arch.Neerl. Tome XXV
WBeyerznck dél-
it,- latte lïth ■ Berlà/v .
Bacillus cyaneo-fuscus.
Arth.Neerl T. XXV El.
Fig 1
ir.Sc]iaïk.Del.
Arc! i .N e erl T. XX Y
