III. — EXTRAITS AQUEUX DES ALGUES HACHEÉES

Malgré le peu d'intérêt des produits obtenus, on peut toujours pratiquer utilement l'épuisement aqueux des algues entières : une grande quantité de pigment est ainsi éliminée. La diffusion des sels est malheureusement difficile dans ces mêmes conditions : avec Îles gommes, beaucoup d'éléments minéraux sont retenus à l'intérieur des thalles.

Les algues sont ensuite hachées en menus fragments et traitées par l'eau distillée bouillante pendant 20 à 30 minutes. De nombreuses spores sont dispersées dans le liquide: on laisse reposer plusieurs heures, puis on décante et on exprime les algues dans un linge épais. On a ainsi traité, par 10 litres d'eau, un lot de Lemanea nodos« (récolté en juillet) qui pesait à l’état frais 2 kilos 5.

L'extrait, jaunâtre, est opalescent même après filtration: concentré à feu doux, il devient visqueux. Additionné alors d'eau iodée, il ne prend aucune trace de la coloration brune qu'on observe avec les solutions diluées de glycogène. On peut s'assurer d'ailleurs que le contenu des cellules est resté, après le traitement, intensément colorable par l'iode. Des matières gomimeuses non colorables ont été séparées : l'opération est donc facile, quand la fragmentation des algues n’a pas été poussée trop loin.

A concentration moyenne, l'extrait flocule par le carbonate de sodium et par la baryte, surtout à chaud; après filtration, on peut examiner la liqueur au polarimètre: elle est nettement dextrogvre. La soude caustique ne produit pas de floculat. Le sous-acétate de plomb, le nitrate mercurique, l'acide phosphotungstique déféquent abondamment; l’iodure complexe de potassium et de mercure agit fort peu.

Très concentré, l'extrait précipite par l'alcool fort en grand excès : les substances gommeuses qu'il contient sont, dans ces conditions, bien plus solubles que du glrcogène. La précipitation alcoolique opère entre ces substances un certain fractionnement, et nous à permis de les étudier avec précision. A cet effet la solution mucilagineuse, réduite au volume de 200 em$ environ, est additionnée de 2 vol. d'alcool à 95. Il se forme un précipité (P1) blane grisètre, fibreux, qu'on sépare par filtration sur un linge fin. La liqueur alcoolique est ensuite concentrée à 13 em environ, et additionnée à nouveau d'alcool fort. 11 se produit un précipité (P2), qui est séparé comme le précédent.

On ne parvient pas ainsi à précipiter intégralement la substance en solution : il reste dans le filtrat (Li un corps hrdrolysable dont nous indiquerons d'abord les caractères, On étudiera ensuite les précipités P1 et P2,

1) La liqueur L.

L'alcool est évaporé, et l’on reprend par un peu d'eau. La solution ainsi obtenue est jaunètre, opalescente. Disposant d'une quantité minime de produit, on s'est borné à en faire deux parts qui ont été soumises AUX ESSAiS SUIVANIS :

1° Une moitié est déféquée à fond par l'acide phosphotunestique. On obtient ainsi 1S em d'une liqueur dextogvre.

EC

l'hydrolyse par l'acide sulfurique à 2? % demande environ une heure, à l’autoclave (120°), et fournit une liqueur réductrice :

Rédueteur %

Déviation en glucose) Cal + D'1f 0,58 19-20

2° L'autre moitié est hrdrolrsée telle quelle dans les mêmes conditions. On obtient une liqueur réductrice :

Rédueteur ©

Déviation 3 (en glucose) La] LS 0,99 15

Forcément imprécis, ces résultats suffisent cependant à montrer l'existence d'un corps dextrogrre soluble dans l'alcool fort, précipitant partiellement par l'acide phosphotungstique et différent, d'après ses produits d'hydrolyse, des sucres précédemment reconnus,

RHODOPHYCÉES D'ÉAU DOUCÉ 4)

2) Le précipité P2

A en juger d'après les résultats des hydrolyses, ce précipité est moins complexe que PI, c’est pourquoi nous Fexaminerons en premier lieu. Séché et broyé, il se présente comme une poudre jaunâtre (1 gramme environ), très hygroscopique, sans réaction spéciale au au contact de liode, un peu soluble dans Falcoo! à 80 bouillant, soluble presque entièrement dans l’eau en une liqueur opalescente, vis queuse,

Additionnée d'acide sulfurique (2 %), cette liqueur s'éclaircit au bain-marie bouillant après 10 minutes, ce qui rend possible une lecture au polarimètre. Voici la marche d'un hydrolvse dans ces condi-

tions.

Temps Déviations Rédeucteur [x] (en glucose)

20 m. (2281 30 m. 1° 26” — ile Mar, lon12? 0,50 2 h, 104: — on 56° —— 4 h. 30 m. 44” 0,90 Han 23001 40° = 6 h. 40 0,90 37

Après cinq heures environ, Fhydrolvse ne progresse plus, même à l’autoclave. Quelle est la nature des substances libérées ? Faute d’une quantité suffisante de matière, nous n'avons pu résoudre cette

question.

3) Le précipité Pr

A l'état sec, ce précipité pesait près de 9 grammes. C’est une subtance grisâtre en poudre, non colorable par liode, riche en azote 2,6% et en cendres 10% (CI, $, P, K, Mg, Ca, Fe). Dans l’eau, elle se redissout lentement et partiellement. L'examen optique direct est impossible.

L’acide sulfurique à 2 % en volume, à 106°, l'hydrolyse assez fa-

cilement, avec production de corps réducteurs. Voici la marche d'une

50 ÏJ. AUGIER

expérience, effectuée sur une solution à 5 % de matière gommeuse. Après cinq minutes, on à séparé par filtration des grumeaux de ma:

tière noirâtre, insoluble.

Temps Déviations Réducteur 0/0 [x] (en glucose) (] illisible 0 DNS + 12 — 15 m. LE 4 — 2D eme 0 1,00 DH + 6 — AND: SENTE — h. 30 m. 6: 1585 UE 2 24 1,40 SAN LAN 24 1,45 D DPIOSnT 26-28 1,50 14 ALI —— 1,50

Ainsi l'attaque paraît terminée après trois où quatre heures : le poids du réducteur libéré, évalué en glucose, représente alors la moitié du poids de matière mis en œuvre. Au cours de la première demiheure apparaissent les deux tiers de ce réducteur, tandis que la déviation polarimétrique, d'abord nettement positive, diminue: elle atteint un minimum, puis croît, cependant que la quantité de réducteur continue d'augmenter, mais lentement. La liqueur est jaune: les déviations sont faibles, et donc les modifications optiques sont difficiles à suivre avec précision: l'existence d'un minimum paraît cependant indubitable., Peut-être a-t-on affaire à un mélange de deux substances, l'une plus dextrogyre que ses produits d'hydrolyse, facilement attaquable; l'autre lévogvre, plus résistante, d’où naissent des corps dextrogvres.

On a tenté de fractionner le produit brut au moyen de l'alcool, suivant deux procédés :

1° On traite 2 gr. 5 de poudre par de l'alcool bouillant de titre de plus en plus bas. Il faut descendre jusqu’à 40° pour dissoudre une quantité notable de substance. La liqueur obtenue, opalescente, visqueuse, est décantée; on évapore et on reprend par un peu d'eau. On obtient ainsi une solution très visqueuse, à peine jaunâtre, opalescente, neutre. Elle se trouble légèrement par l’acide sulfurique ; avec la soude, on n'abtient pas de précipité, mais seulement, à chaud, une

RHODOPHYCÉES D'EAU DOUCE 5l

coloration jaune clair; la liqueur de FEnriING, à chaud, provoque un floculat, mais non pas le sulfate de cuivre seul, même concentré; la baryte produit un précipité blanc, d'aspect cireux, soluble dans l'eau chaude. |

Voici la marche de l’hydrolyse (SO*H? 2 %, 100) :

Temps Déviations Rédeucteur % [a] (en glucose) Dem + 1055 25 m. + if il dt — 9° 2 h. + 20° HN 0 h. + 4 3,10 Si + 52 9,10 13-14

On retrouve ici, avec une plus grande netteté, les caractères du produit total étudié précédemment,

Le traitement à lalcoo! 40° à jaissé un résidu grisâtre qui, desséché, pèse O0 gr. 90. On le dissout dans l’eau en proportion de 3 %, et on le soumet à l’hydrolyse dans les conditions habituelles.

Temps Déviations 5 m + 12’ 5 m. + 5 25 m + 4 INR 0en + 9 Dane + 12°

etc.

Ces résultats sont analogues à ceux que l’on obtient en hydrolxsant le produit total.

Le procédé que nous avons employé n'aboutit donc pas à un fractionnement. Mais il est à retenir si l’on se propose de purifier rapidement les matières gommeuses : l'alcool entraîne peu les composés azotés.

Examinons plus en détail les caractères du produit ainsi purifié. D’après le poids de réducteur en fin d’hydrolyse, et la déviation polarimétrique observée au début, le pouvoir rotatoire initial dépasse + 30°. On à remarqué que la liqueur au minimum de déviation, après une heure environ, devient lévogyre. Quelle est la nature des produits d’hydrolyse ? A ce sujet, nous ne pouvons encore affirmer

que peu de chose. Il s'agit certainement d'un mélange de corps réducteurs dont les uns sont dextrogyres, les autres lévogyres. On à pu les séparer, au moins partiellement, de la manière suivante :

L'hydrolysat est déféqué par l'acide phosphotungstique, puis évaporé à sec. On reprend par l'alcool à 80 bouillant, pendant une dizaine de minutes; on laisse reposer deux jours, puis l'alcool est décanté et distillé. On reprend par un même volume d’eau la fraction soluble dans l'alcool et la partie non dissoute.

a) La première présente les caractères suivants : LS R% (ein glucose) 1,50 I} np =°2%538;:

La liqueur se colore en rouge orangé en présence d'orcine, en milieu chlorhydrique : elle est neutre et ne précipite pas par SO*H*. Nous n'avons pu obtenir d'osazone, et nous disposions d'une quantité trop faible du produit pour songer à le fractionner.

b) La seconde fraction (la moins soluble dans l'alcool) offre les propriétés suivantes :

x = —2$ R % (en glucose) 0,55 La] D = — 42,

Avec l'orcine, la réaction est bien moins intense, compte tenu de la dilution.

Par addition d'acide sulfurique à la liqueur neutre, il se forme un abondant précipité de sulfate de barvum. Lors de Félimination de l'acide phosphotungstique par la baryte et le carbonate de baryum (1), une certaine quantité de ce métal était donc demeurée à l'état de sel soluble, Il persiste en proportion très appréciable après l'élimination des chlorures par un peu de zéolithe argentique: le milieu ne renfermant d'ailleurs pas de nitrates, on doit conclure à la présence de sels organiques de baryum. Il est possible qu'il s'agisse d’uronates car la réaction à la naphtorésorcine est nettement positive.

Ajoutons que l'élimination du baryum ne modifie pas le pouvoir rotatoire.

2° Un second procédé de séparation des matières gommeuses consiste à dissoudre dans l’eau le produit brut et à pratiquet la précipitation fractionnée par l'alcool à 95. Opérant sur 5 gr. environ, on a

obtenu un précipité pl pesant 4 gr. 4 et un précipité p2 pesant 0 gr. 53.

1) Voir plus haut l'exposé de cette technique, p. 21.

RHODOPHYCÉES D'EAU DOUCE 53

Cette méthode est efficace et continue le fractionnement opéré une première fois déjà (cf. p. 48): p2 ressemble à P2 et pi à P1. Voici par exemple les caractères de lhydrolyse de la substance p2 (solution à 2,5 %) :

Réducteur %

Temps Déviation l É en glucose [xl

5 m. — 19207 traces 1S5enT 1012 30 m. 12421 LPS 0 TR) LES:

ou: JON 1,00 41h90 tn: 44” 1,05 32 5 h. 32’ 1,15 93

Quant à la substance pl, elle présente des caractères analogues à ceux de PT; on observe au cours de l’hydrolyse un minimum négatif de la déviation polarimétrique.

Conclusions. — L'étude que nous avons ébauchée nous montre que les substances extraites de ZLemanea par la technique décrite, n'ont aucun rapport avec le glvcogène. Il s’agit d’un mélange de matières gommeuses. On peut en distinguer deux au moins :

1° l’une (P2) dextrogyre, ([4]D>80). Au cours de l'hydrolyse, pénible, le pouvoir rotatoire diminue régulièrement, pour se fixer vers 930.

2° L'autre (P1) dextrogyre, ([z]n>30). Au cours de l'hydrolyse, le pouvoir rotatoire passe par un minimum. Sa valeur finale est voisine de + 10.

Peut-être a-t-on affaire ici au mélange de deux Corps :

L'un dextrogvre, dont l'hydrolyse facile s'accompagne d'une diminution du pouvoir rotatoire,

L'autre lévogvre, donnant des produits d’hydrolyse dextrogyres, et rappelant, par conséquent, la gomme qui diffuse lors du traitement de salgues entières par l’eau chaude (Cf. page 46.)

S'il existe des sucres parmi les produits de dégradation de toutes ces substances, nous ne pouvons encore déterminer lesquels, vu la difficulté d'obtenir leurs composés avec la phénylhydrazine. La faute

en est aux acides organiques réducteurs présents dans l’hydrolysat, et dont les sels de baryum sont entraînés même dans l'alcool absolu froid. Nous avons émis plus haut l'hypothèse qu'il s'agit d'acides uroniques. Cette opinion semble confirmée par le dégagement de gaz carbonique qui accompagne lhydrolyse de la gomme sous l’action de HC1 à 18% : le poids de CO? dégagé représente 5 % du poids de gomme. (Au sujet de cette réaction, voir la thèse de RICARD 146] p. 168).

Si l’on attaque la matière gommeuse par l'acide iodhydrique, selon la méthode de Meyer, il se produit de l’iodure de méthyie : celleci contiendrait done un groupement méthyle ou méxothyle.

Les procédés biochimiques d'analyse ne permettent pas d'apporter d’autres précisions. Le mélange de gommes a été mis en présence des divers milieux fermentaires ci-dessous indiqués, sans qu'aucun ait manifesté de pouvoir hydroiysant: orge germée, poudre de pancréas (Pancréatine Choay), suc gastrique d'escargot, poudre d’Aspergillus niger, luzerne germée, enveloppes de Phallus (1).

A partir des Sacheria frcina, traitées dans les mêmes conditions que les Lemanea, on à retiré de même des mélanges assez variables de gommes, non colorables par l’iode.

Voici les résultats obtenus en hydrolysant, tel quel, un extrait de Sacheria (SO? 2 %).

res Dérauoe | Réducteur % La] (au tube à 1 dem.) en glucose a

10 m. 8 Die 30 m. + 18

Th: + 32°

2h. + 20° dST

à hi: 20%m. + 20° 0,67

autoclace 120°

(1) Au sujet de l’activité fermentaire des enveloppes de ce champignon, voir H. Corn et M. Qurrrer, Comptes rendus, 195, 1932, p. 1313-1315.

RHODOPHYCÉES D'EAU DOUCE : 55

Au cours de l’hydrolyse, le pouvoir rotatoire passe par un maxi-

mum.

Il peut arriver que, sans avoir poussé très loin la fragmentation des algues, on obtienne néanmoins des extraits mucilagineux colorables en brun rouge par l’iode : ils sont analogues à ceux que préparait ERRERA à partir des algues broyées. Ce fut le cas pour un lot de Lemanea nodosa, pesant frais 1.450 gr., récolté en août et particulièrement riche en spores : il fournit 8 grammes de gomme brute sèche, se colorant légèrement par l'iode.

Ce produit diffère peu des précédents par les caractères de l’hydrolyse sous l’action des acides. L’extrait mucilagineux concentré, additionné d'alcool, fournit un précipité P1. Remise en solution aqueuse à 3 % et hydrolysée, la substance donne lieu aux observations sui-

vantes :

en glucose Temps Déviation Réducteur % (FA 52m. + 283 10 m. + 14 Sem + 13° 30 m. 410" hi. + 10° 1,35 Done + 18 1,50 à due + 30° 1,60 4e 50! — SL Ji GA) 55, + 28 1,60 14

Ces résultats ne sont de nature à fournir aucune indication sur la présence éventuelle, dans la gomme, d’une petite quantité de glycogène.

L'action des amylases est plus intéressante à considérer. Mélangeons une très petite quantité d’une amylase — du malt, du pancréas, ou rapidase — à quelques ce. de la solution mucilagineuse concentrée. Aussitôt celle-ci perd la propriété de se colorer en brun au contact de liode. Le changement est manifeste, mais quélle en est la signification ? On peut y voir l’indice de l’action spécifique de l’amylase sur une substance glycogénique. Cependant cette interprétation ne s'im-

pose pas.

Considérons en etfet une solution de gélose (1) fraîchement préparée et de concentration suffisante. Par addition d'eau iodée, elle prend une teinte rouge brun. Cette propriété disparait si l'on ajoute à la solution une très petite quantité d'amylase. La gélose n'est cependant pas une matière amylacée, et n'a d'ailleurs pas subi de modification chimique, au moins pendant la durée très courte de l'expérience. Dans ce cas, la diastase est intervenue seulement par sa nature de matière albuminoïde : par suite de son affinité pour l'iode, elle masque la réaction de la gélose. Des albumines variées sont aptes, à des degrés divers, à produire le même effet. On peut facilement prouver qu'il en est bien ainsi. Evaporons presque à siccité quelques gouttes de la solution de gélose additionnée d'’amylase. Après refroidissement, ajoutons une goutte d’eau iodée : la coloration rouge apparaît, aussi intense qu'en l’absence de diastase. Desséchée où coagulée, celle-ci ne masque plus la gélose, qui donne dès lors avec l'iode la réaction habituelle.

Si l’on soumet aux mêmes essais une solution de glycogène, on constate que le milieu, qui se colorait en brun, perd cette propriété, mais cette fois d’une façon définitive : l'amylase a dégradé chimiquement le glucide.

Les changements dans la réaction à l'iode, notés de leur caractère définitif ou seulement transitoire, peuvent ainsi fournir des indications analytiques, faciles et rapides. L'extrait de Lemanea que nous étudions se comporte, à ce point de vue, comme une solution diluée de glycogène. Ce glucide + est done probablement présent.

Il s'y trouve toutefois en si faible quantité, qu'on ne réussit guère à mettre en évidence le sucre réducteur issu de son hvdrolyse diastasique. Et d’ailleurs, étudiant l'action de l'amylase sur ce milieu complexe et riche en gommes, on ne peut interpréter correctement l'apparition de réducteur sans avoir déterminé la nature de ce dernier. Certaines gommes en effet, comme la gélose de Rhodymenia, sont dégradées lentement, avec production de réducteur, par l'amylase du malt et la rapidasé (GUÉGUEX [47], p. 5S). Pour savoir à quel corps ont touché les amylases, il est indispensable d'identifier les produits d'hydrolyse.

(A) On trouvera, dans une note de NSAUVAGEAU [48] l'indication de quelques sources de gélose colorable par l'iode. Nous avons employé une gélose du commerce, que nous avons vérifiée exempte de glrcogène.

RHODOPHYCÉES D'EAU DOUCE 517

Cela suppose ces produits préparés en quantité suffisante. Nous sommes done amenés à rechercher un procédé meilleur pour extraire des algues la substance colorable par liode,

Il convient de débarrasser d’abord, le plus possible, les algues des mucilages : le traitement par l’eau doit être, à cette fin, renouvelé cinq ou six fois au moins. Pour éviter d'entraîner en même temps la substance colorable, on fut amené à traiter d’une part les fragments de la plante mère, et de l’autre les spores, mises en liberté dans l’eau, et facilement séparables par décantation. Les spores en effet, offrent au solvant une surface de contact énorme, et sont aussi plus riches en matière colorable : celle-ci diffuse plus facilement. Par contre, on a pu, en bien des cas, soumettre les fragments de thalle à de nombreux épuisements — même à 120° pendant une heure — sans en tirer autre chose que des mucilages non colorables.

Occupons-nous d’abord de ces fragments, très appauvyris mainte

nant en matière gommeuse,