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point que les tubes de culture avaient repris sensiblement la même coloration rouge que le tube témoin, placé à l’étuve: dans les mêmes conditions. Nous tenons à signaler ce fait intéressant car, si au lieu de suivre heure par heure la marche de la réaction, nous étions simplement revenu voir l’état de nos tubes quelques heures après les avoir ensemencés, nous aurions pu croire que le neutral-roth n'avait pas viré, et douter de la nature du coli que nous avions isolé. Nous avons refait l'expérience de nombreuses fois et quelquefois en 1 ou 2 jours, toujours au bout de 3, le même phénomène se reproduisit.

Or, si d’après les recherches de Guerbet, le glucose est l’origine de cette sorte de « caméléonage » (1) du neutral-roth, il était facile de s’en assurer en préparant des milieux qui en étaient dépourvus.

Expériences personnelles.

A cet effet, nous préparons des tubes comme ïl suit: Bouillon ordinaire : 10 cc3.

Solution de neutral-roth au 100e: V gouttes.

Nous stérilisons.

Pour être certain de l’absence du glaucose, nous faisons au préalable dans notre bouillon la recherche de cet élément par la liqueur de Fehling. Elle est négative. Nous trailons ensuite 100 ce3 de ce bouillon, par 1 cc3 d’Hel pur pendant un quart d'heure au bain marie à 100 degrés, afin de provoquer la saccharification des hydrates de carbone, el spécialement du glycogène qui pourrait s'y trouver. Nouvel essai au Fehling: négatif. Nous avons donc bien un milieu exempt de glucose. Six tubes de cette nature sont ensemencés de coli, trois avec chaque échantillon { Tubes 1).

À côté nous mettons le même nombre de tubes contenant,

(1) Ce terme de «caméléonage », qui rend bien compte de la nature du phénomène, est une expression empruntée à M, le Professeur Ferré

outre le milieu précédent, du glucose suivant la formule ordinaire cilée plus haut. L’ensemencement est fait de même, après stérilisation (Tubes 2). |

Enfin six tubes renfermant simplement sans bouillon, 10cc3 de solution de glucose à 25 pour cent, et 5 gouttes de solution de neutral-roth au 100€ soht aussi stérilisés et ensemencés. (Tubes. 3). |

Le tout est mis à l’étuve à 37 degrés, avec un tube témoin pour chacun des divers milieux 1, 2, 8.

Trois heures après nous avons les résultats suivants: tous les tubes 1 ont viré au jaune el présentent par réflexion une fluorescence très nette ; de nombreuses bulles gazeuses à la surface. Les tubes 2 présentent {ous la même réaction que les précédents ; on ne peul y faire aucune différence appréciable.

Les tubes 3 n'ont pas changé ; le microbe n’y a pas cullivé, car les milieux sont restés aussi limpides que le témoin.

Six heures après, dans les tubes 1 et 2, virage et fluorescence s’accentuent ainsi que les bulles gazeuses qui sont plus nombreuses. Les tubes 3 restent clairs et gardent leur coloralion initiale. Au bout de 24 heures, la fluorescence commence à disparaître dans les tubes 1 et 2. Les bulles gazeuses diminuent aussi. Mais, tandis que le virage au jaune canari est de plus en plus net dans les tubes 1, les {ubes 2: tendant à redevenir rouges. Après 3 jours, les tubes 1 sont complètement ‘jaune canari, les tubes 2 ont repris la coloration rouge rubis primitive. Les tubes 3 sont restés intacts ainsi que les trois témoins.

Nous laissons le tout à l’étuve pendant 8 jours sans constaler de nouveau changement.

Interprétons maintenant ces résultats: Nos tubes 1 ont bien présenté la réaction classique, telle qu’elle est habiluellement observée ; cependant il n'y a pas de glucose dans le milieu. Donc, celui-ci ne nous paraît pas nécessaire. Le virage, la fluorescence, les bulles gazeuses se sont produites aussi nettement que dans les tubes 2. Le microbe s’est

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nourri des matières protéiques du bouillon ; nous avons pu constater la présence de composés ammoniacaux à l'odeur dégagée par louverture des tubes el aussi à la présence des fumées blanches à l'approche d'une baguette de verre trempée dans l'Hel. Les bulles gazeuses proviennent bien de la décomposition de ces matières azotées. C'est une vérilable réduction, une dégradation analogue aux phénomènes de putréfaction, donnant naissance à divers gaz, surtout H, AzEB, Co2, H2S, CH“ Guerbetl, dans son expérience, obtient la fluorescence avec l'hydrogène, seul qui la crée, nous dit l'auteur, en troublant le milieu par son dégagement. C'est une théorie difficile à vérifier certainement, mais très plausible ; nous avons vu en effet, que, tant que les bulles augmentent, et par suite que le milieu est troublé, la fluorescence augmente, alors qu'au bout de trois jours nos tubes 1 el 2 ont perdu peu à peu leurs bulles de gaz en même temps que leur fluorescence.

Dans nos tubes 2,le microbe a,en plus des aliments azotés, du glucose qu’il fait fermenter. A l'inverse des phénomènes de réduction des albuminoïdes qui conduisent à la formation de produits alcalins divers, la fermentation des sucres fait de l'acidité. N'est-ce pas cette acidité que nous cherchons lorsque nous ensemençons dans des bouillons glucosés ou lactosés au tournesol, des microbes dont nous connaissons l’action fermentative sur les sucres? Cette acidité, Guerbet le premier l’a signalée, nos expériences le prouvent aussi, nuit au virage du neutral-roth, qu'elle ramène à sa coloration primitive.

La quantité de glucose dans les tubes en expérience doitelle être considérée ? Cela est évident, la valeur de l'acidité élant proportionnelle au poids de sucre décomposé. Or, nous pouvons dire que des quantités très faibles de glucose, suffisent au retour à la couleur primitive.

Nous avons refait des expériences avec des tubes 2 contenant pour 10cc. de bouillon, non plus 1cc. de la solution à 25 pour cent de glucose, mais 5 gouttes. Les résultats ont

été identiques et, dans ces conditions, la quantité de glucose était notablement inférieure à celle de tous les milieux classiques au neutral-roth.

Il nous semble donc que, pour avoir une réaction durable et facile à observer avec le coli-bacille, il soit nécessaire de faire des milieux au neutral-roth, exempts de glucose. Si l'on veul conserver des milieux glucosés, il serait alors intéressant de voir comment se comportent vis-à-vis des sucres les autres microbes faisant virer le neutral-roth. Car, S'ils n'ont pas d'action fermentative, le retour à la coloration primilive, dernière phase de la réaction, pourrait êlre considéré comme un caractère spécifique du coli-bacille.

Le fail qu un microkbe se développe aussi bien sur un milieu purement azolé, que sur un milieu auquel on ajoute un hydrate de carbone, peut surprendre au premier abord. L'on sait, d’après les travaux de Kendall, Farmer, Bagg, que lorsque les bactéries se trouvent en présence à la fois d'hydrates de carbone et de matières proléiques et qu'elles peuvent utiliser ces deux aliments, elles s'attaquent de préférence aux hydrates de carbone, tout en détruisant cependant la quantité de proléiques nécessaire à leur nulrition azolée. Ces auteurs, dans leurs études sur des types de microbes du groupe intestinal (coli, protéus), ont montré le rôle d’'épargne des hydrates de carbone vis-à-vis’ des protéiques. Ils ont fait, dans des milieux de composition connue, d'une part des dosages d’ammoniaque libre pour voir le degré de destruction des matières azotées, et d'autre part des dosages d’acidité marquant celle des hydrates de carbone. Ils concluent qu'en présence du glucose il y a une moins grande production d'ammoniaque et acidificalion du milieu. Comme il est nécessaire pour avoir une fluorescence et un virage nets dans la réaction du neutral-roth, d'éviter l'acidité, ces résultats confirment ce que nous avons dit du rôle du glucose dans les milieux employés.

Allant plus loin dans leurs recherches, les mêmes auteurs ont émis l'hypothèse que, en l’absence des hydrates de

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carbone, certaines bactéries pouvaient produire même des acides en utilisant probablement lé radical hydrocarboné des matières protéiques. Ce n’est certes qu'une hypothèse, mais elle nous permettra de comprendre quelques observations expérimentales que nous avons faites.

Nous avons eu l’idée de remplacer le neutral-roth dans nos tubes 1 et 2, par quelques gouttes de teinture de tournesol. Les tubes 2 ont rongé, comme nous nous y atlendions, puisqu'il y avait formation d’acidité aux dépens du glucose. Les tubes 1 sont restés bleus pendant 12 heures, mais se sont mis eux aussi à virer au rouge ensuite, beaucoup plus légèrement loutefois que les tubes 2. Cette réaction acide nous étonnait dans un milieu qui nous paraissait devoir rester alcalin, puisque les mêmes tubes au neutral-roth restaient virés sous l'influence de cette alcalinité. Remplaçant le tournesol par la phénolphtaléine dans ces mêmes tubes 1, à aucun moment nous n'avons vu apparaître une coloration rosée, signe d’alcalinité. Cependant, les microbes ont bien pullulé dans ces milieux, car nous nous élions assuré que des bouillons renfermant 3 gouttes de solution de phtaléine du phénol, ou de teinture de tournesol, permettaient bien à nos microbes de se développer.

Ces faits, en apparence contradictoires, nous pouvons les expliquer d'après l'hypothèse des : auteurs précédents :

Le coli attaque bien la matière azotée en faisant des produits ammoniacaux ; le neutral-roth en est l'indicateur. Mais à côté, le radical hydrocarboné de la molécule albuminoiïde est attaqué et produit de l'acidité comme le prouve le virage du tournesol. La réaction dans son ensemble apparaît donc comme très complexe, car acide et base en présence seraient dans un état tel quils agiraient chacun pour son propre compte, sur des réactifs différents, sans former de combinaison saline laissant une réaction définitive neutre, alcaline au acide suivant lélément en excès, Le tournesol el la phtaléine du phénol seraient, dans ces. conditions. sensibles à l'acidité, le neutral-roth le serait à l’alcalinité.

CHAPITRETIN

La réaction de l’indol.

Généralités.

Comme pour la réaction précédente, nous ne donnerons que quelques indications générales nécessaires pour comprendre les recherches spéciales que nous avons faites.

L'indol est un produit résultant de l’action, sur la matière portéique, de certains microbes, en particulier du coli-bacille. C’est Kilasato qui a montré l’importance et, la significalion que pouvait avoir la présence de l’indol dans les milieu de culture. Mais, le microbe ne fait pas d’indol avec toutes les matières azolées. Un court aperçu sur l’origine de cet élément nous permettra de bien comprendre, dans cette question, le point de vue auquel nous nous sommes placé.

Parmi les protéiques, ne sont capables de libérer de l’indol sous une influence imicrobienne déterminée que celles qui peuvent compter le tryptophane au nombre des acides animés résultant de leur hydrolyse.

Le tryptophane, acide indolaminopropionique, de constitulion suivante,

CH: C Ce CH /COOH Lu CH |

AzH ee °

PNR

en perdant son groupement amidogène, donne l'acide indolpropionique ; celui-ci, par simplifications successives, perdant HO et CO’, arrive, aux termes d'acides indolacétique, indolcarbonique et enfin d’indol,

CH: CH | | a

bS AzH Le

C'est donc dans un ‘milieu où le microbe pourra trouver le tryptophane sous sa forme la plus simple que la pro-, duction d’indol sera maxima. Parmi les corps naturels, nous avons, en premier lieu, le tryptophane lui-même que Dis- taso a expérimenté pour le coli et avec lequel il a eu de grandes quantités d'indol. Mais ce composé est peu employé, car on se le procure difficilement. On lui préfère les peptones, produits de dégradation de Ia matière albuminoïde sous l'influence des sucs digestifs, pepsine et trypsine. Ce terme de peptone renferme à lui seul un nombre infini de substances, présentant bien quelques réactions chimiques d'ensemble, mais différant dans leur composition en principes immédiats ; suivant que la digestion a élé poussée plus ou moins loin, leur composition varie, ce qui fait l’inconstance des résultats obtenus dans les milieux dont elles font partie. Dans cette confusion, on peut cependant faire une division en peptones pepsiques et {rypsiques ; ces dernières sont produites sous l'influence du suc pancréa- Üique qui pousse beaucoup plus loin que le suc gastrique la dislocation de la matière albuminoïde, et va seul jusqu’au lerme « acides animés », dont fait partie le tryptophane. Nous comprenons ainsi pourquoi on emploie généralement ces peplones pancréaliques dans la recherche de l'indol. Est-ce à dire qu'il soil nécessaire ou indispensable que le tryplophane soit sous sa forme libre, pour que le microbe en fasse de l’indol par une simple hydrolyse? Non. Il en donne fréquemment avec «les peptones pepsiques. Il semble

même que le microbe puisse jouer un rôle beaucoup plus grand dans la dégradation de la matière protéique, car Rettger a montré que le coli pouvait faire du tryptophane dans du bouillon de viande ordinaire ou des. solutions d’albumine d'œuf.

Mais, l’indol ne peut se produire qu'à deux conditions:

10 II faut que le milieu soit alcalin. En milieu sucré, rapidement acide par conséquent, il ny a pas production d'indol. Péré fait à ce ‘sujet une comparaison intéressante à citer: une culture de b. tétanique en milieu sucré perd beaucoup de sa toxicité { Vincent et Vaillard). Or, si on envisage l’indol comme une substance toxique, on voit le rapport qu'il peut y avoir ‘entre les deux faits. Rappelons aussi ce que nous disions dans le chapitre précédent sur le rôle de Facidité dans la réaction du neutral-roth, et l’influence alimentaire des hydrates de carbone, quand ceuxci sont ajoutés dans un milieu azoté.

26 [1 faut que le milieu renferme l'azote sous la forme organique. En milieu minéral, en effet (liquides de Rémy et Sugg, liquide de Raulin, milieu de Küss), on n'a jamais observé de production d'indol ; pour notre part, nous l’avons cherchée sans résultat ; ce qui prouve que le microbe fait de l’indol, en dégradant des molécules complexes où ce corps existe déjà dans sa composition entière, mais qu'il ne peut en faire la synthèse au même titre que les végélaux font la synthèse de matières organiques sous l'influence de l'azote minéral, de l'acide carbonique et de l’eau.

Avant d'entrer dans l'exposé de nos recherches, voyons de quelle réaction nous pouvons nous servir pour déceler l'indol. Nous ne décrirons pas les nombreuses réactions de l’indo!, qui sont décrites tout au long dans les traités de chimie analytique. Disons simplement que celle du nitroso-indol de Salkowski et Nencki, celle d'Erlich à la paraanimobenzaldéhyde, celle de Dénigès à la vanilline, sont les plus couramment employées. C’est cette dernière que nous décri-

rons seule avec détail, car elle nous a conduit à des recherches spéciales :

Réaction de Denigès.

M. Denigès a montré que la plupart des aldéhydes aromatiques et furfuroliques donnaient, par condensalion avec l’indol. des produits colorés en présence d'acide chlorhydrique.

Parmi ces aldéhydes, il faut citer surtout:

Le pipéronal ; la benzaldéhyde ; la vanilline.

Appliquant ce procédé en microbiologie, voici la technique donnée par l’auteur pour rechercher l'indol dans un bouillon de culture :

Ajouter à 10cc3 du liquide, 3 à 5cc3 d'alcool concentré, et 1cc3 d’une solution de 'vanilline à 2 pour cent, et agiter. Verser ensuite dans le mélange 3à 4cc3 d'acide chlorhydrique pur et agiter encore pour mélanger. S'il ,y a de l'indol, il se développe une coloration rouge éosine ou rose très stable, présentant une large hande d'absorption dans le vert. |

MM Ferré et Buard ont utilisé ce procédé avec le colibacille, et en ont toujours obtenu les meilleurs résultats. Au lieu de verser l'Hel en masse, ils le laissent tomber goutte à goutte, ce qui permet de voir la coloration se développer de bas en haut. Ces auteurs ont encore remarqué que la coloration s'accentuait beaucoup 24 ou 48 heures après l'expérience, et nous avons pu le constater nous-même.

M. Porcher remplace, dans cette réaction, l'alcool par.

PDU

l’éther, pour en augmenter la sensibilité. Il se base sur le: fait que la coloration obtenue avec la vanilline est insoluble dans l’éther ordinaire et l’éther de pétrole, tandis qu’elle se dissout dans l’eau et l’alcool éthylique.

La modification qu'il apporte consiste à extraire l’indol par agitation, du milieu avec de l’éther ; il ajoute ensuite à l'extrait éthéré, la vanilline et l’Hel ; seul, l'Hel se colore avec beaucoup plus d'intensité qu'avec l'alcool, où la coloration est répandue dans tout le milieu. Peut-être ce procédé est-il préférable quand il faut doser l’indol par la méthode colorimétrique que donne M. Porcher, mais pour la recherche qualitative, l'emploi de lalcool est très suffisant. Dans nos essais, nous avons souvent comparé les deux méthodes et nous avons été très satisfait de celle de M. Denigès. Jamais, quand celle-ci était négative, nous n'avons pu déceler de coloration par la méthode à l’éther.

Expériences personnelles en milieu

à la gélo-peptone.

Nos microbes À et B ont été ensemencés dans des tubes à essai contenant 10 cc3 d’eau peptonée pancréatique à 3 pour cent. La dose la plus favorable varie de 3 à 5 pour cent. Certains auteurs ajoutent Ogr. 50 à 1 gr. pour cent de phosphates alcalins (Gauthier), qui augmenteraient la production d’indol.

En 48 heures, nous avons eu une réaction très nette par la méthode de Denigès, mais nous ferons remarquer qu'au bout de 5 à 6 heures seulement, la réaction élait déjà sensible.

D’après ce que nous avons dit de la composition variable des peptones commerciales, il est nécessaire, dans la recherche de l’indol, de faire au préalable l'essai de la pep-