ÉTUDE DE LA FONCTION FLUORESCIGÈNE

Ensemencé dans les milieux favorables à la production de la substance fluorescente, B. chlororaphis donne un faible développement bactérien avec éclaircissement rapide du milieu. Celui-ci devient généralement alcalin, mais son alcalinité est extrêmement variable. Telle est l’allure générale d’une culture fluorescente; je vais maintenant essayer d'indiquer les causes qui régissent la fonction fluorescigène.

GessArpD, dont le nom est intimement lié à l’histoire des bacilles chromogènes, indique, comme milieu de culture de composition minimum pour les bacilles fluorescents, le type suivant :

Succinate d’ammoniaque . . . . . . 1 Phosphate {de pDotasse ee 0,5 Eau . FU ns 100

Le B. chlororaphis, ensemencé sur ce milieu, donne une culture faible, sans voile ou à voile réduit à une très mince pellicule. La végétation dure peu de jours et la fluorescence est variable suivant la semence, quelquefois même nulle; jamais on n’observe de cristaux.

La végétation du Bacille dans un tel milieu impliquerait, semble-t-il, que la cellule peut vivre en l’absence de certains

BACILLUS CHLORORAPHIS 4

éléments (le soufre, par exemple) que l’on considère en général comme indispensables à son élaboration. DucLaux fait remarquer que « l’existence d’un végétal se passant de soufre pour ses besoins alimentaires impliquerait l'existence d’un protoplasme sans soufre aussi, et on n’en connaît point de pareil ».

A quoi la Bactérie emprunte-t-elle le soufre dans le milieu succinate d’ammoniaque, phosphate de potasse? A la semence initiale? Le fait est possible, quoique je n’apporte qu’un très petit nombre de cellules, car on sait que les cellules mortes, macérant, peuvent être attaquées et dissoutes par les ferments (trypsines) produits dans les cultures. Cependant, cette explication, citée souvent, est bien peu satisfaisante et il y a lieu de chercher ailleurs les origines du soufre.

MEYER, dans ses recherches sur la nutrition des levures, avait vu le soufre apporté par le sucre; j’ai donc recherché ce métalloïde dans le succinate d’ammoniaque. Le phosphate de potasse avait d’ailleurs été préparé en partant de potasse et d’acide phosphorique reconnus exempts de soufre par l’analyse chimique.

Le succinate d’ammoniaque utilisé, vendu comme produit chimiquement pur pro analysi, donne, à la calcination, 22 milligrammes de cendres par 100 grammes. En opérant sur une assez grande quantité de cendres, on caractérise le soufre, la magnésie et un peu de calcium. Si on soumet ce succinate à des purifications successives, on s’aperçoit que plus le produit obtenu est pauvre en cendres, plus les cultures deviennent difficiles et que l'addition de soufre et de magnésie à ces produits purifiés favorise la végétation et la fluorescence. Je n’ai pu obtenir de succinate d’ammoniaque rigoureusement exempt de cendres, il ne m'a donc pas été donné de vérifier expérimentalement si le Bacille se développait en milieu dépourvu de soufre. Mais nous verrons que la Bactérie a besoin de doses relativement grandes de soufre et de magnésie, pour donner un voile épais et des cristaux. Il semble done probable que si on arrivait à priver totalement le Bacille de soufre et de magnésie, il ne se reproduirait plus. L'organisme paraît avoir la faculté de se

CULTURES EN MILIEUX SYNTHÉTIQUÉS o1

contenter de très peu de ces éléments dans certaines circonstances, mais lorsqu'il les rencontre autour de lui, il manifeste ses conditions de vie facile par une exubérance de développement.

Si l’on ne peut concevoir de végétation en l’absence de soufre, a priori il semble qu’une cellule ne peut vivre en l’absence de phosphore. PASTEUR a depuis longtemps, en effet, insisté sur la nécessité de l’acide phosphorique dans les milieux de culture.

Cependant GEssarD a vu le B. pyocyaneus se développer et donner de la pyocyanine en l’absence de phosphore. Mais l’auteur a-t-il bien pris les précautions nécessaires pour éviter tout apport de ce métalloïde? Le B. chlororaphis, dans'un milieu dépourvu de phosphate, ne se multiplie pas. Il exige même des doses relativement élevées d'acide phosphorique. Au-dessous de 5 milligrammes de PO, K,H % il n’y a aucun développement, même après plusieurs semaines. À 15 milligrammes, 60% des ballons ensemencés sont fluorescents, 20% sont incolores et 20% stériles. A partir de 30 milligrammes, la fluorescence se développe régulièrement dans tous les ballons et ne semble pas augmenter avec des doses supérieures (50-100-200 milligrammes). La dose de 15 milligrammes de PO, K,H semble donc être au voisinage de la dose minimum compatible avec la vie de la Bactérie.

Nous sommes loin de la sensibilité du B. pyocyaneus qui peut déceler 1/8000 de phosphate de potasse par la manifestation de sa fonction chromogène. Cette sensibilité avait permis à GEssARD de montrer l’existence d’une proportion de phosphate constituant ,« une sorte de ration d'entretien » imdispensable à la vie du Microbe. La quantité de phosphate qu’on apporte en plus dans son milieu de culture ne serait alors pas nécessaire; elle constituerait une réserve que le Bacille mettrait à profit pour la production de la fluorescence.

A ce sujet, je ferai remarquer que CATHELINEAU (1896), étudiant B. viridis (LESAGE), n’a pu vérifier ce rôle important des phosphates dans la manifestation de la fonction fluorescigène.

BACILILUS CHLORORAPHIS SEMBLE-T-IL SE COMPORTER COMME BACILLUS PYOCYANEUS ?

Aux doses de 15 milligrammes de phosphate de potasse, nous avons vu des cultures incolores et des ballons rester stériles; de même certaines semences ont pu donner un faible développement avec ou sans fluorescence dans des milieux renfermant 10, 11, 12 milligrammes de PO, K, H.

Cela tient à ce que les exigences en acide phosphorique varient avec les cellules. En effet, les cultures incolores ensemencées dans un milieu plus riche en phosphore donnent de la fluorescence et ces cultures fluorescentes, reportées en milieu primitit plus pauvre en phosphate, n’en donnent plus. Ce fait correspond bien à l’idée de deux doses : une indispensable au développement et une supplémentaire déterminant l’apparition de la fonction fluorescigène. Mais, si on examine les cultures restées incolores, on voit qu’elles sont beaucoup plus maigres que les cultures fluorescentes.

D’autre part, l'examen microscopique montre des éléments allongés, peu ou pas mobiles, à grains métachromatiques nombreux; on a l’impression que la cellule vit difficilement et qu’elle traduit cette difficulté de végétation par la disparition de sa fonction fluorescigène. D'ailleurs, nous voyons disparaître la iluorescence des cultures chaque fois qu’un agent quelconque diminue l’activité végétative. Et on peut citer, comme exemple de ce genre, les cultures faites à la température de 370 ou eftectuées dans une atmosphère pauvre en oxygène, ou encore en milieu trop alcalin, ete.

Il est un élément du milieu que je n’ai pas encore étudié : c’est l'aliment azoté dont l’importance a été mise en évidence par LEPIERRE (1895) dans ses belles recherches sur la fonction fluorescigène.

GessarD (1892) a montré que la prédominance de l’aliment azoté se traduit par la production de la pyocyanine et celle des

phosphates par la fluorescence. C’est ce qui m’a amené à cultiver B. chlororaphis en milieu suivant :

Asparagine,

Sulfate de magnésie, Phosphate de potasse, Eau,

dans lequel on fait varier le phosphate de 30 milligrammes à 500 milligrammes et l’asparagine de 0,4 à 2° 1% (l’asparagine à 0,7% donne sensiblement les mêmes résultats que le succinate d’ammoniaque à 1%). Je n’ai jamais observé la formation d’un seul cristal vert et la fluorescence n’a paru présenter aucune modification intéressante.

Enfin, je n’ai pu obtenir de développement de la Bactérie avec d’autres sources d’azote telles que l’urée, le glycocolle, le tartrate ou le lactate d’ammoniaque. |

Influence du fer. — Nous verrons dans l’étude de la production de la chlororaphine l'influence considérable du fer; aussi, ai-je essayé d’additionner de sulfate ferreux le milieu précédent.

En présence du fer, le Bacille donne une culture fréquemment Îluorescente, mais qui, au bout de deux ou trois jours d’ensemencement, devient jaunâtre et perd sa fluorescence. Parfois les cultures sont jaunes dès le début. La réaction du milieu est étrangère à ce phénomène ainsi qu’en témoignent les chiffres suivants :

Alcalinité du milieu à l’appari-

tion de la fluorescence .. . . 0£r,049 (en H, SO, %) Alcalinité du milieu à la disparition de la fluorescence . . 0#r,098 (en H, SO, %)

L’alcalinité a doublé et cependant la fluorescence a disparu. Il faut donc chercher ailleurs l'explication de ce phénomène. À cet effet, des cultures jaunes, âgées seulement de trois ou quatre jours, sont filtrées et additionnées d’un excès d’ammoniaque. La base ne détermine pas instantanément l’apparition de la

fluorescence de la culture. La liqueur ainsi alcalinisée louchit et après quelques heures, il se dépose au fond du vase un précipité floconneux, surmonté d’un liquide très fluorescent qui devient incolore au bout de quelques jours.

Il semble donc que la coloration jaune des cultures soit due à une combinaison du chromogène fluorescent et du fer.

Action de différentes substances sur la fonction fluoreseigène. — L’addition d’alcool méthylique, éthylique ou de glycol au milieu nutritif n’a pas d’action sensible sur la fluorescence. Par contre, les sucres ont une influence variable suivant leur nature et celle de l’aliment azoté qui leur est associé; tous favorisent le développement bactérien. Il en est de même de la glycérine. On peut donc prévoir que la présence d’un aliment hydrocarboné permettra à la Bactérie d'utiliser des sources d’azote autres que l’asparagine et le succinate d’ammoniaque. Le milieu employé sera le suivant :

DOULCB A A ZOPE A: TAN PEN EN TR UE ni SuItAte; Te MATE ET TE 0,05 PhOSphAerdIDOIASSIQUE RE 0,10 Chlorure de CAC 0,0% AICOO LE OUESUCTER ER En 2 DE Pen OM EE IE re 00

L'importance du chlorure de calcium dans ce milieu est assez discutable; dans certains cas, sa suppression transforme la fluorescence verte habituelle en une faible fluorescence bleue; dans d’autres, son absence passe complètement imaperçue. La nécessité des autres éléments minéraux a été discutée précédemment, je n’y reviendrai donc pas.

L’aliment hydrocarboné étant représenté par la glycérine, la Bactérie donne des cultures fluorescentes avec l’urée, l'acide aspartique; incolores avec le glycocolle, le tartrate, le sulfate, le nitrate d’ammoniaque et le nitrate de potasse. Les milieux à urée et glucose, donnent une culture fluorescente vert pomme, admirable. Parmi les sources d'azote qui viennent d’être indiquées, le glycocolle méritait de fixer l’attention, car nous verrons

qu’en présence de fer, il permet la production des cristaux verts. J'ai done essayé de faire produire de la substance fluorescente à la Bactérie avec cette source d’azote. A cet effet, l’aliment hydrocarboné a été fourni successivement par des alcools (diols, triols, tétrols, hexols), des sucres (hexoses, disaccharides). Dans chaque milieu ainsi obtenu, les doses de glycocolle, de phosphate de potasse et même des autres éléments, ont été extrêmement variées, sans que jamais le Bacille ait donné de cultures fluorescentes.

Action de la température et de l’oxygène. — La température la plus favorable à la production de la fluorescence est voisine de 22-240 C. et les plus belles cultures fluorescentes s’obtiennent en étalant la couche de liquide ensemencé. La fonction fluorescigène ne se manifeste plus vers 36-370 C. ; quelques rares semences peuvent cependant donner encore, à cette température, des cultures fluorescentes. Suivant le degré de pauvreté de latmosphère en oxygène, la fonction fluorescigène est entravée ou supprimée.