MILIEU DE CULTURE (MILIEU SYNTHÉTIQUE TYPE

Les milieux synthétiques que je viens d'examiner ne permettent pas l'obtention des cristaux verts. J’ai donc essayé si l’introduction d'éléments nouveaux ne déterminerait pas leur formation. Après de longs tâtonnements, j'ai réalisé un milieu chimiquement défini, où une semence déterminée produit, en un temps donné, un poids maximum et à peu près constant de substance verte. Ces recherches nombreuses sont d’ailleurs pleinement justifiées, d’une part, par le fait que les bouillons peptonés conviennent mal à la production de la chlororaphine et que, d'autre part, en ces milieux à base de peptone, il est très difficile, simon impossible, de suivre l'analyse des phénomènes physiologiques. La composition du milieu synthétique type adopté est la suivante :

HAUT 7 PR ee er OU ON ASPATAEINO" SAT INONEET RE ER 0 ,700 Glyéétine ME RERO 2 ,500 Phosphate dipotassique. . . . . . 0 ,100 Sulfate de magnésie . . .”". . . . 0 ,500 Ghloruredé calcium T0 0 ,040

Sula oerrauR TM AMENER 0 ,010

L'eau distillée du laboratoire est redistillée dans un appareil en verre et sous pression réduite. Les produits chimiques, soumis à une purification aussi sévère que possible, doivent être rigoureusement exempts de traces de fer décelable par les réactifs. La dissolution des différents éléments du milieu étant effectuée, on obtient une liqueur que l’on peut à volonté, soit légèrement acidifier (acidité voisine de 0°,030 exprimée en H, SO,), soit laisser neutre, soit alcaliniser faiblement (alcalinité voisine de 0°",030 exprimée en H, SO, et déterminée en présence de phénolphtaléine). Les milieux alcalins sont propres à une végétation rapide, mais de courte durée, car nous verrons que la Bactérie alcalinise le milieu et qu’une certaine alcalinité s’oppose à la multiplication bactérienne. Il s’ensuit donc que les milieux neutres ou acides permettront une végétation plus longuement soutenue.

Le bouillon est distribué dans des ballons. L’avidité de la Bactérie pour l'oxygène exige que le liquide nutritif soit mis en couche mince. On obtient ce résultat en introduisant dans les ballons une quantité de liquide telle qu’elle représente le sixième ou mieux le septième de la capacité totale du récipient. Les vases de culture utilisés sont en verre d’Iéna. Enfin, le milieu est stérilisé à 1159. L’ensemencement est effectué avec des cultures de deux à trois jours au maximum et présentant déjà des cristaux. Ce dernier caractère n’est pas à négliger, car nous verrons plus loin que certaines races produisent la chlororaphine plus abondamment que d’autres. En empruntant la semence à une culture qui présente déjà des formes cristallines, on est donc plus certain de s'adresser à une race favorable.

À la température de 259 C., B. chlororaphis ensemencé dans le milieu cité donne une culture offrant trois caractéristiques principales : développement bactérien avec voile épais; production de cristaux verts; éclaircissement du milieu et jaunissement des formes cristallines. Accessoirement, on note parfois une légère et éphémère fluorescence. On observe fréquemment une troisième substance chromogène soluble dans le milieu et variant du jaune pâle au jaune citron. Enfin, exceptionnellement, les cultures peuvent être de couleur brune plus ou moins foncée.

Douze à quinze heures après l’ensemencement, la partie supérieure du milieu offre l’aspect d’un louche blanc laiteux, la partie inférieure du liquide restant limpide.

Au bout de vingt-quatre heures, la culture est entièrement trouble et présente un voile; quelquefois, on perçoit à la surface une couche fluorescente de 5 à 6 millimètres (fluorescence qui, d’ailleurs, disparaît bientôt).

La culture vieillissant, le voile s’épaissit et les cristaux verts apparaissent. Parfois, on observe l’apparition des formes ceristallines le deuxième jour, mais généralement c’est vers le troisième ou quatrième jour que la chlororaphine se précipite. On constate fréquemment, avant l’apparition des cristaux, que le milieu présente une coloration jaune, dont l'intensité et la nuance sont variables. Il semble que l’intensité de cette coloration diminue à mesure que s'effectue la précipitation des cristaux, sans que, pour cela, elle disparaisse complètement.

Enfin, la végétation s’arrête, le bouillon s’éclaircit et les cristaux verts jaunissent peu à peu. La culture est alors alcaline, elle dégage une odeur pénétrante, caractéristique, parfois partiellement masquée par celle de l’'ammoniaque.

Le corps odorant, que nous retrouverons dans les produits de distillation de la culture, est différent de ceux que nous avons eu l’occasion d'étudier jusqu'ici et dont l’odeur se rapprochait de celle de la coumarine.

On peut observer exceptionnellement des cultures présentant de bonne heure une légère teinte brune qui, allant en s’accentuant, aboutit au brunissement complet du milieu. Dans de telles cultures, le développement est normal; mais la production des cristaux est sensiblement inférieure à celle des cultures types décrites plus haut. Il est à noter que toutes les cultures brunes ont présenté, au début de leur développement, une fluorescence plus ou moins marquée. Ce fait est intéressant à constater, car il nous aidera à interpréter le mécanisme du brunissement de différents milieux.

J'ai eu l’occasion de qualifier de favorable ce milieu; en effet, la Bactérie y offre une végétation active et relativement de longue

durée. La vitalité et la faculté de produire des cristaux s’y conservent infiniment mieux qu’en bouillon peptoné. Enfin, le quantum de chlororaphine produit dépasse considérablement celui que le Microbe fournit avec les peptones.

Maintenant que nous connaissons l'allure générale d’une culture, nous allons rechercher l'utilité de chaque élément du

milieu dans la production des cristaux verts.

Aliment azoté. — La suppression de l’aliment azoté empêche tout développement bactérien. Avec des quantités d’asparagine inférieures à 0*°,7, la production des cristaux et le développement de la Bactérie diminuent notablement, tandis que l’apport de quantités supérieures à 1 gramme favorise la végétation, mais n’influence guère la formation de chlororaphine. On peut substituer à l’asparagine, l’urée, l’acide aspartique, le glycocolle, le succinate d’ammoniaque. Par contre, les tartrate, lactate, sulfate, nitrate d’ammoniaque ne permettent pas l’obtention de cristaux.

Aliment hydrocarboné. — En l’absence de glycérine, la Bactérie donne des cultures souvent fluorescentes pendant quelques jours; le développement microbien est faible et le voile fait défaut ou est réduit à une mince pellicule; on n’observe jamais de cristaux. Des apports de glycérine inférieurs à 2 grammes déterminent une faible production de cristaux et la quantité de chlororaphine produite s’accroît avec l'apport, mais les doses de 4, 5, 10 grammes n’augmentent plus sensiblement le poids de substance verte. La glycérine est donc indispensable à la production de chlororaphine et à une végétation active.

On peut remplacer la glycérine par la mannite, le glucose, le lévulose et le saccharose. Les alcools méthylique, éthylique, le glycol, la dulcite, l’arabinose, le rhamnose, le lactose, le maltose, l’inuline, la dextrine, l’amidon ne permettent jamais la production de cristaux. Enfin, le mannose et le galactose présentent des propriétés spéciales que nous aurons l’occasion d'étudier plus loin.

Eléments minéraux. — Phosphate de potasse. — La Bactérie ne peut se développer en l’absence de l’acide phosphorique. Dès que le milieu renferme environ 50 milligrammes de phosphate de potasse, on constate la précipitation de cristaux verts. La production de chlororaphine augmente sensiblement jusqu’à 100 milligrammes, mais des quantités supérieures à cette dose ne semblent pas influencer la fonction chromogène. La dose optima est donc voisine de 100 milligrammes.

L'apport de phosphore organique par des glucoses impurs, des glycérophosphates de sodium, de potassium, de magnésium ne donne pas de résultats supérieurs à ceux fournis par le phosphate de potassium. La production des cristaux est, au contraire, généralement inférieure; tandis que Simon (1908), dans son étude sur le B. syncyanus, obtenait les meilleurs résultats avec les glucoses impurs. Le phosphate de soude donne de mauvais rendements, mais associé à une trace de potasse ou de sels potassiques, il permet une aussi belle production de chlororaphine que le phosphate de potassium.

Sulfate de magnésie. — B. chlororaphis, dans un milieu où l’on supprime le sulfate de magnésie, donne des cultures incolores, à voile faible, ne présentant jamais de cristaux. La dose optima de ce sel est voisine de 0,500. Le sel magnésien agit-il par son acide, par sa base, ou a-t-il une action spécifique?

A cet effet, J'ai substitué au sulfate de magnésie différents composés magnésiens. Avec le chlorure de magnésium, on obtient des cultures Jaunes présentant de très rares cristaux ou dépourvues de formes cristallines. Mais la réduction de la culture filtrée, par le zinc et l’acide chlorhydrique, fait apparaître une belle coloration verte. Avec le succinate de magnésie, la Bactérie offre des cultures jaunes à cristaux peu nombreux. La réduction, effectuée comme ci-dessus, donne une belle teinte verte à la culture.

Enfin, le phosphate de magnésie donne des cultures incolores. Les sulfates alcalins, le sulfate d’ammoniaque ne permettent pas la production des cristaux. En étudiant le mécanisme de formation des cristaux verts, nous verrons qu’ils sont solubles dans les acides et dérivent par réduction d’une substance jaune,

soluble dans l’eau. Cette substance s’est formée dans les milieux à chlorure et à succinate de magnésium, et c’est elle qui a donné à la culture sa coloration jaune. Les deux sels de magnésium considérés peuvent donc permettre la formation de la substance mère des cristaux verts, mais ils ne paraissent pouvoir assurer la seconde transformation : sa réduction, et, par suite, la précipitation de la chlororaphine.

Il résulte donc que le magnésium est indispensable à la production des cristaux et que, seul, le sulfate de magnésium donne des résultats constants. Cette observation est à rapprocher de celle faite par Kunrz (1900), qui montre que le soufre et le magnésium sont indispensables à la formation du pigment chez B. prodigiosus. SAMKOW (1903), dans une autre étude, confirme l’influence des sels de magnésium sur la fonction chromogène de B. prodigiosus. Enfin, Suzzivan (1905) montre que la présence de sulfate de magnésie est nécessaire à la formation des pigments rouges produits par BP. prodigiosus, B. rosaceus metalloides, PB. ruber balticus et des pigments violets de B. violaceus, B. janthinus. De tous ces faits, 1l semble résulter que des bactéries diverses, pour l’élaboration de substances absolument différentes, ont des exigences communes. Celles-ci peuvent, non seulement être d'ordre qualitatif, mais encore d’ordre quantitatif. Ainsi, SIMON (1908) montre que la dose optima de sulfate de magnésie est comprise entre 0%",4 et 0*,5 pour B. syncyanus, alors qu’elle est voisine de 0%,5 pour B. chlororaphis.

Ces rapprochements seraient dépourvus d'intérêt si le rôle du sulfate de magnésium dans le: milieu de culture que j’ai décrit était établi. Or, si j'ai pu montrer son utilité, je n’ai pas mentionné son rôle. Le magnésium entre-t-il dans la composition de la substance chromogène? SAMKOW a essayé, mais en vain, de le déceler dans le pigment du PB. prodigiosus et Je n’ai pas été plus heureux avec la chlororaphine. Que le sulfate de magnésie joue un rôle dans la nutrition de la cellule, le fait est à peu près certain; mais que son rôle soit aussi simple, cela est bien peu probable. En effet, nous avons vu la cellule se contenter de quantités si faibles de chaque élément, qu’un apport de 0°°,500 (dose

optima) peut paraître exagéré pour assurer simplement la nutrition de l'organisme. D'autre part, l'action singulièrement favorisante du sulfate de magnésie comparativement à celle exercée par les autres sels de magnésium, l'impossibilité où l'on est de remplacer le sulfate de magnésie par l'association d'un sulfate et d’un sel de magnésium, montrent une influence spécifique due au sulfate de magnésie.

Chlorure de calcium. — Le chlorure de caleium semble favoriser la produetion des cristaux. En son absence, les cultures ne présentent pas de chlororaphine, ou n’en présentent que de faibles quantités.

Les chlorures de sodium. de.potassium ne peuvent remplacer le chlorure de caleium. Une conclusion rigoureuse sur l'utilité du chlorure de calcium ne peut être donnée qu'en opérant sur un milieu absolument privé de caleium. Or, il est possible que, malgre toutes les purifications auxquelles j'ai soumis les différents élèments, le milieu renferme des traces de ce métal, insuffisantes pour être décelées par les réactifs chimiques utilisés, mais suflisantes pour satisfaire aux exigences de la Bactérie.

Suljaite ferreux. — Si une quantité très faible de caleium est suffisante pour assurer la fonction chromogène de B. chlororaphis. il n'en est plus de même en ce qui concerne le fer: celui-ei doit se trouver en quantité pondérable dans le milieu pour que l’on puisse obtenir une quantité appréciable de chlororaphine.

Les doses de sulfate ferreux qui donnent les meilleurs résultats sont comprises entre 4 et 12 mulligrammes, mais on peut les abaisser notablement: ainsi l'apport de 1 milligramme de sel de fer permet d'obtenir, d'une façon constante, la chlororaphine. On obtient encore quelques cristaux en ajoutant seulement 0" 5, mais des quantités de sulfate ferreux inférieures (0% 3) ne favorisent plus la production de la substance verte, La présence du sulfate ferreux dans un milieu défini favorisant la production de la substance chromogène, on peut se demander sous quel état agit le fer. Le fer ajouté au milieu se précipite et il n’en reste en solution que des doses très faibles, insuffisantes pour déterminer la formation régulière et abondante de la chlororaphine (pour

10 milligrammes de sulfate ferreux, il ne reste que 0"#°03 à 0,04 de fer dissous). Il faut donc admettre que le fer précipité primitivement dans le milieu agit favorablement. A l'appui de cette interprétation, il convient de noter que du fer se redissout peu à peu à mesure que la végétation se poursuit dans les cultures. La quantité de fer qui se dissout à nouveau peut atteindre 5 à 8 milligrammes (exprimés en sulfate ferreux). Ce fer, qui repasse en solution, donne les réactions des sels au minimum.

Le sulfate ferreux agit par sa base; en effet, on peut remplacer ce sel par le citrate ferreux ou le chlorure ferrique; néanmoins le sulfate semble préférable.

L'action du fer est spécifique; j'ai, en effet, essayé sans succès le manganèse, le nickel, le cobalt, le zinc, le chrome et le bore, à des doses variant de 0,1 à 80 milligrammes.

Nous avons vu que si l’on ajoute seulement 0"*,3 de sulfate ferreux, il n’y a plus production de chlororaphine; ce fait tend déjà à montrer que le fer est indispensable à sa formation. D’autre part, si, à des cultures faites dans un milieu dépourvu de fer, on ajoute cet élément après un, deux, trois, quatre, cinq, Quinze jours d’ensemencement, on constate un regain de végétation et une production de substance verte. Cet apport ne doit cependant pas être fait trop tardivement sous peine d'insuccès. Chaque culture a, en effet, ses besoins particuliers : telle semence exigera que le fer soit additionné, au milieu, au plus tard le troisième jour après l’ensemencement: telle autre se contentera d’un apport fait le cinquième ou le sixième jour. Il est donc impossible de fixer une date limite aux apports tardifs de sulfate ferreux.

Les cultures sur milieux ne renfermant pas de fer sont fluorescentes, le voile n’existe pas ou est réduit à une mince pellicule et il n’y a pas formation de chlororaphine.

Par quel mécanisme agit le fer? Jusqu’à présent, à mon avis, et dans le même ordre d'idées, on n’a étudié l’action du fer que dans les cultures de l’Aspergillus niger. RAuLIN (1870), dans son étude classique, admet que « par le fait même du développement de l’Aspergillus en l'absence des sels de fer, 1l a dû se former une

substance vénéneuse pour la Mucédinée, substance que les sels de fer empêchent de se produire, mais ne peuvent détruire». Pour Linossier (1890-1891), l'apport de fer au milieu de Raulin favorise la sporulation en apportant un élément indispensable qui entre dans la composition du pigment des spores. Enfin SAUTON (1910) explique le rôle du fer en montrant que non seulement ce métal, mais aussi l'oxygène, semblent nécessaires pour la sporulation. Pour lui, la formation des spores paraît s'accompagner d’une fixation d'oxygène par un phénomène analogue à celui de Wozr (1909-1910). Et il émet l'hypothèse que le fer agit comme porteur d'oxygène dans le liquide de Raulin.

Ces tentatives d'explications sur le rôle du fer dans les cultures de l’Aspergillus ne permettent pas de se rendre compte d’une façon satisfaisante de l'influence de ce métal sur la production de la chlororaphine. En effet, on ne peut guère admettre la formation d’une substance vénéneuse dans les cultures (explication de Raulin). Seul, le fait qu’un apport trop tardif de fer ne favorise plus la végétation et la formation des cristaux, pourrait permettre de supposer la présence de produits microbiens tels que l’ammoniaque (très toxique pour le Bacille). Il faudrait alors admettre que la Bactérie attaque différemment l’élément azoté et carboné suivant qu'il y a absence ou présence de fer. Il est, en effet, des cas où la présence du fer semble influer sur la fermentation, tel est l’exemple indiqué par le tableau ci-dessous :

AMMONIAQUE 3 avant hydrolyse| AZOTE TOTAL GLUCOSE du milieu analysé en H, SO, exprimé en N

NATURE ALCALINITÉ

grammes grammes grammes grammes .

Témoin 0,0098 0,0021 0,126

Culture 9 jours avec fer, nombreux cris- TAUX ERIC ER 0,0001

Culture 9 jours sans fer, pas de cristaux.

Tous les chiffres se rapportent à 100 centimètres cubes d’un

bouillon où la glycérine a été remplacée par du glucose. L’examen des résultats analytiques montre que le milieu dépourvu de fer à une alcalinité très forte, l’hydrolyse de l’asparagine est accentuée et le glucose peu attaqué, tandis que la culture renfermant du fer a une réaction sensiblement neutre. L’asparagine est plus faiblement hydrolisée, mais le glucose a fermenté beaucoup plus activement.

L’action du fer sur la fermentation semble donc indéniable. Mais cette conclusion n’est pas susceptible de généralisation, elle ne peut pas être appliquée à tous les milieux, et, de ce fait, elle perd toute sa valeur.

L'interprétation donnée par LiNossier ne paraît pas plus adéquate, car Je n’ai pas pu déceler de fer dans 100 milligrammes de chlororaphine. Enfin, si J'ai pu constater, ainsi que Sauron l’a fait pour l’Aspergillus, que la présence simultanée du fer et de l'oxygène est indispensable à la production des cristaux, il me semble difficile d'attribuer simplement au fer le rôle de porteur d'oxygène, ce rôle est beaucoup plus complexe; nous verrons, en effet, le fer intervenir encore dans le brunissement de certaines cultures.

Quoi qu’il en soit, de tous ces essais d'explication, un fait reste acquis, c’est que la présence de fer dans les milieux chimiquement définis est indispensable à la production de la chlororaphine.

L'étude physiologique du milieu synthétique propre à la formation de la chlororaphine exige la solution de deux ordres de questions. Il faut montrer l’influence des éléments de ce milieu et déterminer le rôle de chacun d’eux. La première question a été résolue, sauf en ce qui concerne le chlorure de calcium: nous avons vu simplement que ce sel favorise la production de la chlororaphine, mais il n’a pas été démontré qu'il soit imdispensable. Quant à la deuxième, je n’ai fait que l’effleurer. RAuLIN (1870) a imaginé une méthode de vérification de l’utilité des éléments nutritifs, qui consiste en leur apport tardif; appliquée au milieu qui nous intéresse, elle a confirmé les résultats obtenus précédemment, mais n’a conduit à aucun aperçu nouveau sur leur rôle physiologique.

BACILLUS CHLORORAPHIS 5

L’étude de la transformation des éléments du milieu seul nous renseignera sur le rôle de l’aliment azoté et hydrocarboné ainsi que nous le verrons plus loin.

RÉSUMÉ

En résumé, sur milieu synthétique B. chlororaphis peut donner plusieurs substances chromogènes qui peuvent se résumer ainsi :

Fluorescente, peu abondante, éphé-

/ | Soluble | mère, assez rare.

Substance | dans le milieu | Jaune, assez fréquente. chromogène | . Brune, rare.

Insoluble : : ; | LE Cristalline, verte ou jaune, constante.

dans le milieu

L’asparagine, le phosphate de potasse, la glycérine, le sulfate de magnésie et le sulfate ferreux sont indispensables à la production des cristaux, le chlorure de calcium la favorise.