ÉCHANTILLON PRÉLEVÉ APRÈS

12 heures d’ensemencement. Pas de coloration

72 Teinte verdätre fugace 96 |- Légère teinte verte 108 Coloration verte

120 | Quelques rares cristaux Coloration verte, intense

144 Cristaux abondants |Coloration verte un peu plus faible

Il ressort de cette expérience que la Bactérie produit d’abord une substance soluble susceptible de verdir par réduction et ce n'est que lorsque ce corps est en quantité suffisante dans le milieu que la précipitation des cristaux s'effectue.

Cette substance soluble n’est autre que la xanthoraphine, Nous verrons plus loin qu’il est possible d'isoler ce chromeogène des cultures sous la forme d’un corps eristallisé soluble donnant, par réduction en milieu acide, une belle teinte verte; de plus, les cultures ainsi privées de xanthoraphine ne verdissent plus sous l'action de Zn et HCI.

La xanthoraphine existe dans toutes les cultures pouvant

(1) Je rappelle que cette coloration n'a rien de commun avec le chromogène Îluorescent, et il reste bien entendu que j'étudie exclusivement les chromogènes du groupe de la chlororaphine.

verdir par réduction même dans celles qüi semblent n’offrir aucune teinte Jaune; d’ailleurs, filtrées sur bougies Chamberland, elles donnent toujours ün liquide jaune plus ou moins foncé. La filtration met donc en évidence la présence du chromogène qui n’était apparent que dans les cultures colorées et que, seule, la réduction décelait dans les milieux paraissant incolores.

Nous venons de démontrer que l’existence de la xanthoraphine dans les cultures précède l’apparition des cristaux verts. Il nous reste à prouver que c’est aux dépens de ce chromogène que ceux-ci s'organisent, ce qui revient à déterminer le mécanisme de précipitation des formes cristallines.

On sait que la production de certains chromogènes bactériens est sous la dépendance de phénomènes d’oxydation (exemple de la pyocyanine, de la syncyanine), mais le jaunissement des cristaux verts sous l'influence de l’air et les propriétés nettement réductrices de toutes les cultures de B. chlororaphis dans lesquelles la chlororaphine s’est précipitée plaident peu en faveur d’une intervention oxydante. |

L'expérience suivante conduit à la même conclusion. Des cultures donnant par Zn et HCI une belle teinte verte sont filtrées sur bougie et le filtrat obtenu est fractionné. Certaines parties sont soumises à des modes d’oxydation variés, d’autres sont réduites par des réducteurs divers. Les premières ne donnent jamais de cristaux et lorsqu'une coloration apparaît, elle varie du rose au rouge vineux.

La réduction en milieu acide donne une teinte verte, mais jamais de formes cristallines, ce que lon comprend aisément si l’on sait que les cristaux verts sont solubles dans les acides; nous avons vu, d’ailleurs, les formes cristallimes se précipiter présque toujours en milieu alcalin et bien exceptionnellement en présence d’une acidité extrêmement faible. Il était donc logique d’orienter les recherches vers lPemploi de réducteurs agissant en milieu neutre ou alcalin. Après de nombreux essais, j'ai adopté le mode de réduction suivant :

La culture filtrée est additionnée de sulfate d’ammoniaque, de lamelles de Zn et de fer en fil. On la porte à 40° CG. pendant

BACILLUS CHLORORAPHIS 7 e

quelques minutes pour amorcer la réaction et on l’abandonne à la température du laboratoire. La réduction est très lente; au bout de vingt-quatre heures, généralement, on observe la formation d’un précipité cristallin très fin en suspension dans le liquide. Vers la quarante-huitième heure, le précipité commence à se déposer au fond du vase sous l’aspect de flocons verdâtres. Après soixante-douze heures, la réaction est termmée. L'examen microscopique montre de magnifiques cristaux verts présentant les mêmes groupements cristallins que dans les cultures. On peut améliorer sensiblement la méthode en transvasant le liquide dans un autre récipient dès l’apparition du louche cristallin dans le filtrat réduit et en y ajoutant un peu de sulfhydrate d’ammoniaque. On obtient ainsi, après quelques heures, d’admirables cristaux verts qui souvent flottent à la surface du liquide et peuvent former un voile d’un vert magnifique. Les cristaux verts sont-ils de la chlororaphine ?

L'examen microscopique montre les rosaces, les faisceaux, les houppes que l’on trouve dans les cultures.

D'autre part, le point de fusion de la chlororaphine n'étant pas assez précis, nous allons transformer nos cristaux verts en cristaux Jaunes insolubles et nous comparerons le point de fusion du corps ainsi obtenu avec celui de loxychlororaphine. A cet effet, les cristaux verts sont dissous dans l’acétone. Dans cette solution se déposent des cristaux Jaunes fondant à 236-2370 C. De plus, mélangés à l’oxychlororaphine, le mélange fond également à 236-2370, L’oxychlororaphine fondant à 23698 (Fc), on peut conclure qu’il y a identité complète entre les cristaux obtenus par réduction chimique de la xanthoraphine et ceux précipités dans les cultures sous l’influence du Bacille.

Il est à remarquer que j’opérais sur un liquide filtré et d’une richesse saline considérable qui devait entraver tout développement bactérien ; néanmoins, pour éviter toute critique, j'ai répété les expériences en opérant en milieu rigoureusement aseptique. À cet eflet, le liquide filtré était distribué dans des vases stérilisés, le zinc et le fer d’une part, le sulfate d’ammoniaque de l’autre l’étaient aussi séparément. De plus, je me suis assuré

que, pendant toute la durée de la réaction, aucun développement microbien ne s'était produit dans la liqueur réduite. Même en opérant ainsi, J'ai obtenu des résultats rigoureusement identiques aux premiers.

Il résulie de ces essais que la chlororaphine dérive par réduction de la xanthoraphine qui, sous l’action de HCI et Zn, colorait en vert les cultures filtrées.

La précipitation des formes cristallines dans les milieux de culture est donc sous la dépendance d'agents réducteurs.

Mais si nous connaissons le rôle capital de la réduction dans la formation des cristaux, nous ignorons encore la nature des agents réducteurs; doit-on attribuer ce phénomène à une intervention diastasique ou à lavidité considérable de la Bactérie pour l’oxygène? D'autre part, si nous avons démontré comment s'effectue le passage de la substance soluble au composé insoluble, nous n’avons fait encore aucune recherche pour essayer de déterminer par quel mécanisme s’édifie la molécule de xanthoraphine.

L’édification est-elle sous la dépendance d’un phénomène réducteur ou d’une oxydation, ou bien encore des deux actions agissant simultanément ou successivement? Autant de questions qui nous conduisent à la recherche des diastases dans les cultures de B. chlororaphis. °

Lorsqu'on cultive le Bacille en présence de soufre précipité, de sulfomdigotate de soude, de sels ferriques, de chlorhydrate de tétraméthyl-paraphénylène-diamine, on constate que les liqueurs sont réductrices. J'ai essayé de déceler la présence de diastases en opérant directement sur des cultures d’âges variables. A cet effet, J'ai utilisé Les réactifs ci-dessous :

: ; RS! AR Solution incolore ; Chlorhydrate de tétraméthyl-paraphénylène-diamine bebe Teinture de résine de gaïac;

Teinture de résine de gaïac et H,0,,

Hydroquinone;

Pyrogallol;

Oxydes manganeux et manganique.

Tous les essais ont été effectués comparativement avec des tubes de culture portés préalablement à l’ébullition et avec des milieux non ensemencés. Dans aucun cas, je n’ai mis en évidence de caractères oxydants de la liqueur, je n’ai pu que confirmer le pouvoir réducteur. Y

On peut émettre l'hypothèse que le milieu renferme des agents oxydants et réducteurs, mais que l’action réductrice l'emporte sur l’oxydation. J’ai alors effectué une série d’essais pour tenter de mettre en évidence successivement chacun des agents de ces deux groupes. J’ai, à cet effet, à l’aide des réactifs cités plus haut, recherché les caractères des cultures dans des conditions spéciales :

19 En effectuant le mélange culture-réactif à des températures variant de 170 à 400 C: Ê

20 En modifiant préalablement la réaction du milieu, la rendant successivement acide, neutre, alcaline à l’hélianthine et à la phénolphtaléine, avant l'introduction des réactifs;

30 En filtrant sur bougie Chamberland et Berkefeld;

4° En utilisant l'influence de la réaction du milieu sur la filtrabilité des diastases (Hoznerer, 1909-1910);

5° En procédant à des précipitations fractionnées par l'alcool;

60 En portant préalablement les cultures à des températures variant de 500 à 14000 C.

Les essais 1 et 2 montrent que lorsque les cultures ont une action sur les réactifs, cette action est toujours de nature réductrice.

Les filtrats provenant de bougies Chamberland ou Berkefeld ne présentent ni caractères réducteurs ni caractères oxydants. Abandonnés aseptiquement soit à la température du laboratoire, soit à celle de l’étuve, ils ne donnent jamais de eristaux. La modification préalable de la réaction de la liqueur à filtrer n’influence nullement la nature du filtrat qui présente les mêmes caractères négatiis que ei-dessus. La précipitation par l’alcool donne des résultats du même ordre. Enfin, les cultures chauffées sont réductrices tant que la Bactérie n’est pas affaiblie ou tuée; au-dessus de la température mortelle, le caractère réducteur cesse de se manifester.

De ces essais, il résulte que le pouvoir réducteur de la culture disparaît lorsqu'on la prive de cellules microbiennes vivantes. Il n’a pas été possible de constater l'existence de diastases oxydantes ou réductrices, ce qui, d’ailleurs, n’infirme pas leur existence. Néanmoins, le pouvoir réducteur pourrait s'expliquer par l’avidité considérable de la Bactérie pour l'oxygène.

La précipitation de la chlororaphine est donc sous la dépendance d’un phénomène de réduction. En étudiant l'influence de l'oxygène sur la production de la chlororaphine, nous sommes arrivé à des conclusions analogues.

XANTHORAPHINE

Nous avons démontré que les cristaux verts dérivent par réduction d’une substance soluble dans l’eau que nous avons désignée sous le nom de xanthoraphine, c’est cette substance que nous allons étudier. Mais, auparavant, afin d’éviter toute confusion entre les composés cristallins, je rappellerai le schéma indiquant comment dérivent l’un de l’autre les corps colorés.

Xanthoraphine __ Réduction Chlororaphine 0#7dution. Oxychlororaphine

Substance jaune Substance verte Substance jaune cristallisable cristalline cristalline

soluble insoluble extrêmement dans l’eau. dans l’eau. peu soluble dans l’eau.

Extraction. — L’oxychlororaphine présentant, comme nous + À P P

le verrons plus loin, toutes les propriétés des alcaloïdes, il est logique de rechercher si la culture renfermant la xanthoraphine précipite par les réactifs des bases alcaloïdiques. L’expérience vérifie cette hypothèse et les cultures ainsi traitées donnent par filtration un liquide qui n'offre plus de teinte verte par réduction. La xanthoraphine a donc été complètement précipitée et l'extraction de cette substance est basée sur cette proprieté. J'ai opéré comparativement avec des cultures filtrées sur papier et d’autres filtrées sur bougie Chamberland. Ces derniers filtrats offrent l’avantage de donner ultérieurement des liqueurs d’une

filtration beaucoup plus rapide du fait de l’élimination des corps microbiens. Le tanin et l’oxyde de plomb permettent d'obtenir la xanthoraphine à l’état cristallin. A cet effet, la culture filtrée est additionnée d’un excès d’une solution aqueuse de tanin. Après agitation, on abandonne quelque temps la liqueur au repos, puis, on centrifuge et on décante le liquide clair surnageant. Le précipité est remis en suspension dans l’eau et on centrifuge à nouveau. Ces opérations doivent être répétées plusieurs fois lorsqu'il s’agit de cultures filtrées sur papier afin d'éliminer le plus possible les corps microbiens.

Enfin, le précipité est essoré rapidement, remis en suspension dans l’eau et traité par l’oxyde de plomb. On porte le mélange quelques instants au B. M. à 400-500, puis, on abandonne à la température du laboratoire. Au bout de vingt-quatre heures, on décante le liquide surnageant, le résidu est épuisé par l’eau une ou deux fois. On réunit entre eux les liquides provenant de ces épuisements et, après filtration, on évapore à basse température et sous pression réduite à quelques centimètres cubes. La xanthoraphine cristallise par refroidissement. On la purifie par une deuxième cristallisation. Il n’est pas possible de pousser la purification aussi loin qu’on le voudrait à cause de l'instabilité de ce corps dont l'obtention très délicate exige de grandes précautions.

L’acide silicotungstique et l’ammoniaque (G. BERTRAND (1899). l'acide phosphomolyhdique et la baryte donnent de mauvais résultats; néanmoins, les rendements sont un peu améliorés par la substitution de l’oxyde de plomb à la barvte.

Propriétés. — La xanthoraphine récemment extraite se présente sous la forme d’une poudre jaune brun: elle cristallise en prismes ou en aiguilles. Chauffée, elle émet des vapeurs fcres qui, condensées, donnent des cristaux jaunes: puis, elle fond sans présenter de point de fusion net et se décompose.

Elle est très soluble dans l’eau qu’elle colore en jaune plus ou moins foneé suivant la concentration de la liqueur. Elle est très peu soluble dans l’acétone et presque entièrement

insoluble dans l'alcool éthylique; l’alcoo! amylique, par contre, et le chloroforme en dissolvent d'assez grandes quantités, beaucoup moins que l’eau cependant.

La xanthoraphine se dissout dans les acides. Sa solution aqueuse, réduite par Zn et HCI, offre une coloration verte, tandis que la réduction en milieu neutre par le zine, le fer et le sulfate d’ammoniaque permet l’obtention de cristaux verts. Ces cristaux dissous dans l’acétone donnent, par cristallisation, l’oxychlororaphine.

La xanthoraphine est une substance très instable et qui subit des modifications profondes lorsqu'elle est conservée à l'air à la température du laboratoire. Abandonnée plusieurs jours à 400, elle passe du jaune brun au jaune pâle. Sous cette forme, elle ne se dissout plus entièrement dans l’eau et, même à l’ébullition, il reste des aiguilles jaune serin qui refusent de se dissoudre. D'ailleurs, la réduction de la substance modifiée ne donne plus qu’une teinte verdâtre faible. A la température de 1009, la décomposition est beaucoup plus rapide et elle est encore accentuée par la présence de bases.

En résumé, la xanthoraphine est une substance jaune cristallisable sans point de fusion net. Elle est très soluble dans Peau et les acides. Réduite en milieu acide, elle donne une coloration verte, tandis que la réduction en milieu neutre précipite des cristaux verts qui par oxydation se transforment en oxychlororaphine. La xanthoraphine précipite par les réactifs des alealoïdes. Elle se décompose avec une grande rapidité au contact de

l'air.

B'EAUINTS SEEN DES COULEUR rS DE BACILLUS CHLORORAPHIS

Après avoir étudié le mécanisme de formation des cristaux verts, il nous reste à rechercher les causes du brunissement de certaines cultures.

En milieu synthétique type, on note parfois une légère fluorescence qui, bientôt, est remplacée par une teinte jaune brun ou brune. Le brunissement est beaucoup plus net en présencé

d'acide aspartique et d’ammoniaque; les cultures sur milieux renfermant ces corps offrent généralement au début une belle fluorescence à laquelle succède bientôt une teinte rose ou Jaune brun, puis brune.

Pour tenter l'explication de ce phénomène, il est bon de rappeler d’abord les travaux effectués dans cet ordre d'idées par GessarDp (1901-1902). Cet auteur a montré que certains germes pyocyaniques produisent un pigment rouge et noir à condition de se trouver en présence de tyrosine. Il a assimilé ce pigment au chromogène de même couleur que donne la tyrosine sous l'influence de sa diastase oxydante : la tyrosinase. J’ai donc recherché si la coloration brune de certaines cultures de B. chlororaphis était due à un phénomène analogue. A cet effet, j'ai approprié la technique de l’auteur aux exigences de B. chlororaphis. Des milieux synthétiques types, différant entre eux par la proportion des éléments constituants et des milieux divers sont additionnés de tyrosine à doses variables. La présence de ce composé phénolique dans ces différents bouillons n’a jamais influencé la production de la teinte brune. D'autre part, des cultures fluorescentes ou jaunes ont été additionnées de solution stérile de tyrosine sans que cette substance ait jamais provoqué le brunissement des cultures.

Enfin, je rappellerai que les cultures de B. chlororaphis sur pomme de terre, dahlia, lait, ne présentent jamais un brunissement ou un noircissement capable d'évoquer la présence dans ces cultures d’un agent oxydant de la tyrosine,

GEssaRD fait aussi remarquer que la production du pigment rouge ou noir dépend non seulement de la présence de la tyrosine, mais encore du rapport dans lequel se trouvent les éléments constituants du milieu et de l’ «aptitude fonctionnelle du microbe ».

J'admettrais donc que je n’ai su réaliser les conditions favorables à la production du pigment si d’autres faits ne me permettaient de donner une explication plus satisfaisante du brunissement.

Nous avons vu, lors de l'étude de la fonction fluorescigène, que l'addition de fer aux milieux favorables à la production

de la fluorescence masque cette dernière et fait apparaître une teinte jaune du milieu.

Nous savons aussi que les milieux synthétiques types dépourvus de fer donnent des cultures fluorescentes, mais ne brunissant jamais.

: I'semble donc que la coloration brune ne puisse se manifester que dans les milieux renfermant du fer.

La fluorescence qui se manifeste au début dans les milieux synthétiques types qui doivent brunir plus tard persiste quelques jours; or, nous savons qu’à mesure que la végétation se poursuit, du fer se redissout dans le milieu.

Ce n’est donc que lorsque la culture renferme une quantité suffisante de fer dissous que la fluorescence disparaît. D'ailleurs, l'examen des cultures en milieu aspartique conduit aux mêmes conclusions; alors que la partie supérieure est encore fluorescente, la partie inférieure, plus riche en fer, est déjà brune ou jaune brun, la partie moyenne présentant une coloration intermédiaire entre la fluorescence verte et la teinte brune.

On peut vérifier aisément que l’addition de fer à des cultures fluorescentes vertes détermine instantanément une coloration rose, rougeâtre, jaune brun ou brune suivant l'intensité de la fluorescence et la quantité de fer ajouté. Cette coloration peut même apparaître avec des quantités extrêmement faibles de fer. Ainsi, des cultures très fluorescentes additionnées à des solutions de sulfate de fer donnent encore une coloration avec des doses de 1/200.000 de Fe.

De plus, nous avons vu que si on précipite à l’aide de NH, ou de sulfhydrate d’ammoniaque le fer existant dans les liqueurs brunies, la fluorescence réapparaît.

Enfin, si par des opérations appropriées, on isole à un état de pureté relative le pigment fluorescent, l’addition de fer à la solution de ce chromogène en détermine le brunissement.

Tous ces faits tendent à montrer que la coloration brune de certaines cultures de B. chlororaphis ne semble pas être sous ia dépendance d’un phénomène analogue à celui signalé par GEs- SARD, mais paraît due à une combinaison du fer et du chromo-

gène fluorescent.

CHLORORAPHINE ET OXYCHLORORAPHINE

Formes eristallines dans les eultures. — La propriété caractéristique de 2. chlororaphis est de donner, dans les milieux de culture, des cristaux vert émeraude à côté desquels on peut en observer parfois d'autres vert bleu, plus rarement vert foncé presque noir; mais ces formes ne se rencontrent, en général, que dans les cultures jeunes seulement. À mesure que le pouvoir réducteur du milieu diminue avec l’âge, les cristaux verts Jaunissent, si bien que l'examen microscopique montre, à côté de eristaux verts, des formes eristallines jaunes et souvent des faisceaux d'aiguilles vertes à une extrémité et jaunes à l’autre. Dans quelques cas, les cristaux restent verts plusieurs mois lorsqu'ils sont soustraits à l’action oxydante de l'air. La coloration dépend, en effet, des circonstances qui favorisent l'oxydation ou la réduction: ainsi, une culture de six Jours à magnifiques cristaux verts est mise à l'étuve à 459: en quarante-huit heures tous les cristaux sont devenus jaunes, c'est que, dans ce cas, la température a aet : {° en arrêtant la végétation et en diminuant, de ce fait, le pouvoir réducteur; 29 en favorisant l'oxydation qui, ainsi que nous l'avons signalé, transforme la chlororaphine en oexychlororaphine jaune. Certaines cultures en bouillon, dans lesquelles la production des cristaux est en dégénérescence, présentent, à la surface du voile, des arborisations cristallines jaunes. On en observe parfois d'analogues à la surface de certaines plaques de gélose. En dissolvant dans l'acétone ces formes arborescentes constituées, le plus souvent, par des prismes ou de courtes aiguilles jaune pâle, on obtient, par cristallisation, des cristaux de forme et de coloration semblables à ceux de l’oxychlororaphine. Is fondent à 2360-2570 et leur solution devient verte sous l'action de Zn et HCI: il ne s'agit done pas d’une substance nouvelle, mais simplement d'un mode de cristallisation différent de l’oxychlororaphine.

Lieux d'apparition de la chlororaphine. — Peu de temps après l'isolement, vers 1907, lorsqu'ils se produisaient en milieux

liquides, les cristaux verts se formaient presque exclusivement à la surface de la culture, en plein voile, et étaient soutenus par lui; ils tombaient au fond du vase lorsqu'ils avaient atteint un développement suffisant. Actuellement, ils apparaissent indifféremment contre les parois du vase ou en plein voite. Lorsque le degré de cohérence du voile lui permet de soutenir longtemps les cristaux, les petits points verts de la culture finissent parfois par devenir des rosaces ou des faisceaux franchement cristallins à l’œil nu. Ces formes s’observent plus fréquemment lorsque les

cristaux se déposent dès le début contre les parois du vase.

Examen microscopique des cristaux. — Les cristaux ont la forme d'aiguilles longues et flexueuses, plus rarement nettement prismatiques, souvent réunies en faisceaux ou disposées en ro-

saces; elles peuvent aussi former des mâcles, des houppes (fig. 3).

Fig. 3.— Culture sur bouillon synthétique type. Photogra phie d’un fragment du voile, x 400 environ. C, Ci, Ca C3 : cristaux de chlororaphine montrant des groupements cristallins variables A faisceau :

C>, houppe; C3, rosace) ; — m, cristaux minéraux ; b, corps bactériens du voile

Ces modes de cristallisation avaient conduit GurGNARD et SAU- VAGEAU à rapprocher la chlororaphine de la tyrosine.

Extraction de la chlororaphine. — C’est aux milieux liquides que l’on s’adressera pour l'isolement de la substance verte et de préférence aux milieux synthétiques. Les bouillons peptonés ne permettent, en effet, qu’une faible production de chlororaphine; ils deviennent, en outre, très visqueux en vieillissant, ce qui rend les filtrations extrêmement lentes et pénibles.

La culture dont on veut extraire les formes cristallines est essorée; puis, le précipité est remis en suspension dans l’eau; on centrifuge et on décante la partie liquide, toujours très opalescente par suite de la présence des corps bactériens. Le précipité est remis à nouveau en suspension dans l’eau et on profite de la légèreté de la chlororaphine pour la séparer, par décantation, des cristaux minéraux qui se forment toujours dans les cultures. On répète les centrifugations et décantations Jusqu'à ce que les eaux de lavage n’entrainent plus de cellules bactériennes. Enfin, le précipité est essoré une dernière fois.

La chlororaphine ainsi obtenue est toujours impure, elle ne saurait être utilisée pour des réactions précises et il est nécessaire de purifier les cristaux ainsi isolés. L’extrême facilité avec laquelle la chlororaphine s’oxyde, surtout à l’état de solution ou à la température de sa fusion, impose l’obligation d’effectuer sa purification en l’absence d'oxygène. Cette opération peut être faite par deux modes différents : la cristallisation et la sublimation.

Purification par cristallisation. — La cristallisation est effectuée à l’aide de l’appareil schématisé page 109. Le ballon À, refroidi à 00, sert de réservoir à l’acétone. En B le solvant est porté à l’ébullition. Un long tube S plonge dans le mercure, il sert de soupape de sûreté et de tube barométrique. La substance verte est mtroduite par la tubulure 7 dans le ballon C, où s’effectue l'épuisement de la chlororaphine. La solution est filtrée en D sur coton préalablement épuisé à l’acétone, En Æ les liqueurs

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d’épuisement après réunion sont concentrées, par évaporation dans le vide V,, jusqu’à saturation. Puis le contenu du ballon Æ est refroidi vers — 59 ou — 10° C. et agité jusqu’à précipitation complète des formes cristallines. Enfin, les cristaux sont essorés en # et les eaux mères recueillies en G. En compliquant un peu l’appareil, on peut utiliser ces eaux mères en les ramenant dans le ballon C. On isole F et les cristaux sont desséchés dans le vide V,. Le maniement de l'appareil est trop simple pour que j’entre dans de longs détails opératoires. Je ferai seulement remarquer que la pince P, étant fermée, on fait le vide simultanément ou successivement en V, et V,, de telle façon que l’acétone n’arrive au contact de la substance que lorsque tout l’air est expulsé de l’appareil et remplacé par une atmosphère d'hydrogène ou d'azote.

Nous avons vu dans les cultures, à côté de cristaux verts, des formes cristallines jaunes et d’autres mi-partie verte, mi-partie jaune. La cristallisation étant effectuée à l’abri de l'air nous donne donc une substance verte à l’œil nu, mais dans laquelle le microscope montre sensiblement les mêmes nuances que dans la substance primitive isolée des cultures. Aussi, pour obtenir exclusivement des cristaux verts, j’ai dû utiliser deux procédés très délicats. L'un est basé sur la propriété qu’a la chlororaphine d’être plus soluble dans lacétone que l’oxychlororaphine, et de se précipiter la dernière lors de la cristallisation d’un mélange de ces deux substances. On peut, par des cristallisations fractionnées, arriver à éliminer de plus en plus les cristaux jaunes du mélange imitial, mais cette méthode, longue et pénible, donne de mauvais rendements.

Le second procédé est préférable; il consiste à traiter rapidement par le chloroforme la substance isolée des cultures. L’oxychlororaphine est dissoute tandis que la chlororaphine est sensiblement respectée; il est, toutelois, nécessaire d'opérer à l'abri de l'air. Après avoir été rapidement essorée, la substance qui a résisté à l’action du chloroforme est introduite dans le ballon C et on continue l’opération comme à l'ordinaire. Quels que soient le procédé utilisé et les précautions prises, on n’est jamais abso-

lument certain d’obtenir des cristaux verts rigoureusement exempts d’oxychlororaphine.

Purification par sublimation. — Ce procédé, que j'ai peu utilisé, ne donne pas de meilleurs résultats que le premier et, s’il est réalisé, avec un appareil plus simple, il n’en exige pas moins de grandes précautions, afin d'éviter toute décomposition de la chlororaphine. La sublimation est exécutée dans une atmosphère d’azote ou d'hydrogène et en l’absence rigoureuse d'oxygène, car, à cette température élevée, loxydation de la chlororaphine est instantanée.

Avec les cristaux tels qu’ils ont été retirés des cultures, le produit de sublimation est un mélange de substances verte et jaune. Il est par conséquent nécessaire de les traiter préalablement par le chloroforme, ainsi que je lai expliqué, pour les débarrasser de l’oxychlororaphine.

Il résulte donc de ce qui précède que l'obtention de chlororaphine exempte de forme oxydée est extrêmement délicate.

Obtention de l’oxychlororaphine. —- [1 n’en est pas de même pour ce qui concerne l’oxychlororaphine, que lon peut obtenir avec une très grande facilité. A cet effet, les cristaux isolés des cultures sont dissous à chaud dans l’acétone.

La solution saturée et filtrée est refroidie à —109; par agitation, il se précipite de petits cristaux jaunes qui sont essorés et lavés avec quelques centimètres cubes d’acétone. On répète ces cristallisations jusqu’à obtention d’un corps à point de fusion constant.

Propriétés physiques de la chlororaphine. — Chauffée en labsence d'oxygène, la chlororaphine se sublime vers 2100 et donne des cristaux verts par condensation des vapeurs émises; tandis que, sublimée à l’air, elle donne des cristaux jaunes. Il est très difficile de déterminer exactement son point de fusion et cela pour plusieurs raisons dont la plus importante est son oxydation. En effet, lorsqu'on projette de petites parcelles de substance,

soit sur le mercure, soit sur le bloc de Maquenne chauflés vers 2300, on observe un éclair verdâtre. Une partie de la substance s’est sublimée, l’autre partie fondue est jaune, elle s’est oxydée durant la fusion. On peut espérer tourner la difficulté en prenant le point de fusion dans une atmosphère d’azote ou d'hydrogène avec le bain sulfurique. Mais en opérant ainsi, on voit, vers 1909, la substance devenir vert foncé, puis, la coloration fonce de plus en plus à mesure que la température s'élève pour arriver finalement au vert noir. Enfin, la substance fond vers 2259, le point de fusion n’est pas net et le noircissement des cristaux peut faire craindre une décomposition partielle. Il faudrait done, à l’aide d’un dispositif spécial, pouvoir projeter la substance sur le mercure ou sur le bloc de Maquenne chauffés dans une atmosphère rigoureusement exempte d'oxygène. On arriverait par tâtonnement à déterminer la température pour laquelle la fusion de la substance est instantanée et, dans ce cas, on n’aurait pas à redouter un commencement de décomposition dû à un chauffage trop prolongé. Je n’ai pas pu réaliser un dispositif répondant à ces desiderata. Nous considérerons donc 2250 comme voisim du point de fusion de la substance verte.

La chlororaphine est pratiquement insoluble dans l’eau, même à l’ébullition, ainsi que dans le sulfure de carbone, le chloroforme, l’éther de pétrole, le toluène, le xylène, le benzène et les alealis; elle est faiblement soluble dans les alcools méthylique, éthylique. L’acétone, le phénol, l’aniline, les acides chlorhydrique, perchlorique, sulfurique, azotique, É phosphorique, acétique, lactique, la dissolvent aisément. Son coefficient de solubilité dans l’acétone est plus grand que celui de l’oxychlororaphine: cette propriété a été utilisée dans la purification des formes cristallines isolées des cultures.

Le tableau suivant indique les colorations de diverses solutions de chlororaphine.

FABLeaU.

SOLUTIONS DE CHLORORAPHINE

NATURE DU SOLVANT ‘ Le

Coloration :

Dès Coloration anrès coriai " «

| au début Coloration après un certain temps

Acide f CUT RARE Vert jaunâtre Jaune chlorhydrique | concentré . . . Vert foncé run verdätre : 4 és Jaune Jaune Acide azotique ) ; | | concentré . | Jaune Jaune Acide FRITES Vert brunâtre |Jaune brunâtre après quelques minutes. | sulfurique | concentré . . .| Brun verdâtre » Fe f dilué. . . , . . Jaune verdätre Jaune après quelques minutes Acide acétique ; | concentré . . . Jaune Jaune PHEROP I EU TON Er dene | Jaune Jaune # | . « À j enprésence d’O. Jaune verdätre Jaune päle Acétone 7. 3 2 l en absence d'O. Jaune verdâtre Jaune verdätre AE Ve ton ee cts ae ee ME Jaune Jaune

Enfin, la solution chlorhydrique faite à l’abri de l'oxygène est verte.

Propriétés chimiques de la chlororaphine. — La chlororaphine, dans une atmosphère limitée d'oxygène pur, jaunit en absorbant ce gaz. Les essais effectués ayant porté sur une trop faible quantité de substance pure (0,050), je ne puis donner de chiffres indiquant la quantité d'oxygène absorbé pendant cette oxydation.

Dans l'air sec et à la température de la chambre, les cristaux exigent plusieurs semaines pour s’oxyder complètement. En présence de l’humidité et de la lumière, la réaction, beaucoup plus rapide, peut être complète en une semaine. Avec l'élévation de la température la rapidité de la réaction croît. Ainsi, à 409, en présence d’eau, toute la substance n’est oxydée qu'en deux ou trois jours, tandis qu’elle l’est en quelques minutes vers 1500- 1800 et en quelques secondes à 2200.

A l’état de solution, l'oxydation est très rapide. La difficulté considérable que l’on éprouve à préserver la chlororaphine de l'oxydation fait que j'ai délaissé son étude pour celle de son dérivé, loxychlororaphine, qui est beaucoup plus stable et s'obtient plus facilement.

Propriétés physiques de loxychlororaphine. — La forme des cristaux est variable avec la nature du solvant et le mode de cris-

BACILLUS CHLORORAPHIS 8

tallisation; ils n’atteignent pas de dimensions suffisantes pour être déterminables cristallographiquement; généralement, ils offrent l’aspect d’aiguilles plus ou moins allongées, parfois de prismes ou de longs filaments flexueux.

Par évaporation lente d’une solution cétonique, on obtient de fines aiguilles pouvant atteindre et dépasser { centimètre de longueur et groupées en houppes ou en rosaces. Par contre, la cristallisation troublée donne de petits cristaux qui se feutrent à l’essorage et, de ce fait, rendent assez pénible la manipulation de la substance.

L'oxychlororaphine chauffée à l’air émet des vapeurs âcres qui, par condensation, donnent des formes cristallines jaune-pâle, la sublimation dans une atmosphère de gaz inerte donne de magnifiques cristaux jaunes fondant à 2419, alors que la substance pure, obtenue par cristallisation, fond brusquement à 2360,8 (F. c.).

La différence constatée entre le point de fusion de la substance primitive et celui du produit sublimé peut être expliquée par les deux hypothèses suivantes :

1° L’oxychlororaphine est un mélange, et, parmi les composants, l’un se sublime plus facilement que les autres:

20 La sublimation est accompagnée d’un commencement de décomposition.

Malheureusement, la faible quantité de substance dont j'ai pu disposer dans ce but, ne m’a pas permis de les vérifier.

La solubihté de l’oxychlororaphine dans l’eau croît avec la température; 100 grammes d’eau dissolvent 0*",010 de substance à 159 et 0*°,120 à 1000. L’oxychlororaphine est insoluble dans la benzine, l'éther de pétrole, faiblement soluble dans les alcools éthylique et méthylique et l’éther, assez soluble dans le chloroforme et l’aniline, soluble dans l’acétone qui en dissout 0150 % à 150 et 0,740 % à l’ébullition.

Les acides minéraux (solutions commerciales) concentrés ou étendus au tiers ou au quart, dissolvent aisément les eristaux

jaunes. Dans les.acides très étendus, les solutions normales

N + Fa où tp le coefficient de solubilité de la substance est sensible-

ment le même que dans l’eau. Les acides acétique, lactique, succinique, sont d'assez bons solvants de l’oxychlororaphine. Par contre, les alcalis concentrés ne peuvent la dissoudre.

. N Les solutions alcalines normales ou 10 comportent sensible-

ment comme l’eau en tant que dissolvant.

L’oxychlororaphine, en solution cétonique, acétique (0°',291 de substance dans 20 centimètres cubes d’acide), est inactive sur la lumière polarisée.

Composition. — Recherche des éléments minéraux. — Étant donnée l’origine de l’oxychlororaphine, on pouvait espérer y déceler des éléments minéraux. Le tableau ci-dessous indique les résultats des recherches effectuées dans cet ordre d'idées.

POIDS DE SUBSTANCE 2er Les Da. A ” Fe ETUIS ns examinée ELEMENTS CHERCHES METHODES EMPLOYEES ELEMENTS TROUVES

grammes 0,1524 Soufre Carius 0,1304 Phosphore Carius 0,1204 Halogènes Carius 0,0891 Halogènes A la chaux

D'autre part, la calcination ménagée de 0",1514 de substance ne donne pas de cendres.

Les cristaux, ne renfermant pas d’éléments minéraux, ne peuvent donc être composés que de C, H, O, N, c’est sur quoi l’analyse va nous renseigner.

Dosage du carbone et de l'hydrogène

I. 0£71389 de substance ont donné 02,3566 de CO, et 08r,0543 de H: O II. 0871327 — — 05,8409 de CO: et 08r,0500 de H; ©

Soit pour cent :

Dosage d'azote

I. 08r,1497 de substance ont donné 24cm3,2 d'N mesuré humide à 6° : l sous 754mm,5

II. 0#,1139 de substance ont donné 19cm5 d’N mesuré humide à 149,5 sous 729mm

Soit pour cent :

I IL NA CE 19,54 19,44 Le corps répond donc à la formule brute suivante : C14,59 H10,42 N3,45 O Cryoscopie

La substance est dissoute dans l’acide acétique

POIDS DE SUBSTANCE DISSOUTE ABAISSEMENT en PTE dans 100 qr. d'acide acétique du point de congélation

Poids"moléculaire à l’origine : 222 Poids moléculaire calculé pour :

C4 Ho N3 O = 236 Cis Hu N; O = 263

J'ai calculé le poids moléculaire pour (1) et (2), car les données analytiques nous ont conduit au schéma suivant :

dans lequel exposant de chaque élément comprend une fraction très voisine d’une demi-unité. La première idée qui venait à l'esprit était de considérer cette forme comme étant exacte à un exposant près, la remenant ainsi au schéma général (CG, 59 Ho,49 N345 O}n; or, la cryoscopie montre que (7) ne peut être supérieur à l’unité. Si de tels résultats ne sont pas imputables à des erreurs expérimentales (quatre dosages de carbone et d’hydrogène ayant donné des chiffres concordants), on ne peut guère

songer à les interpréter, à moins que la substance analysée ne renferme plus d’une espèce chimique.

Il résulte de ce que je viens d’exposer que nous n’avons plus le choix qu'entre les schémas (1) et (2).

Chloroplatinate. — C’est au chloroplatinate que mous nous adresserons pour décider entre les formules (1) et (2). À cet effet, on prépare une solution d’oxychlororaphine dans l’acétone acidulée par HCI à laquelle on ajoute une solution cétonique de chlorure de platine. On obtient instantanément un précipité jaune cristallin. On essore, on lave les cristaux à l’acétone, et on purifie par deux nouvelles cristallisations dans l’alcool. On obtient une poudre rouge brun cristallisée sous forme de prismes. Le chloroplatinate ainsi obtenu ne présente pas de point de fusion net. Projeté dans l’eau, il se décompose; sa composition semble varier quelque peu avec les conditions de cristallisation et, malgré toutes les précautions habituelles, les résultats d'analyses restent peu satisfaisants.

Dosage du platine :

08r1580 de substance ont donné 08r,0369 de Pt. Dosage du chlore :

08r,2518 de substance ont donné 08,246 de AgCI (1).

Calculé pour : Calculé pour :

CO AR OBOD PL O Le (CA NS LOC PP CL RoUve Pt, pour cent. 20,81 22,09 PEN CL pour cent. 22008 24,12 24,15

Le peu de concordance entre le poids de platine trouvé et celui calculé d’après le schéma (C,, H,, N; O HCI), Pt CI, rend difficile le choix de la formule ; néanmoins, il semble bien que c’est au schéma C,, H,, N3 O qu'il faut accorder la préférence, puisqu'il fournit les chiffres D plus SUR de ceux donnés par l'expérience.

(1) Ce dosage est un peu incertain. En effet, le chlore est dosé par la méthode à la chaux et, comme la substance est assez riche en N, il a pu se former un peu de cyanure d’argent.

Propriétés chimiques. — Il semble résulter des propriétés examinées que l’oxychlororaphine possède une fonction basique; cependant, je n’ai pas pu obtenir de sulfate, ni de chlorhydrate d’oxychlororaphine; d’autre part, en essayant de déterminer la quantité d’acide nécessaire pour saturer un poids connu de substance, j'ai obtenu les résultats suivants :

08r,2954 de substance dissous dans 300cm3 d’acétone additionnés de 40cm3

HCI NJ5 exigent 40cm3,3 de Na OH correspondante à l’acide, pour être

neutralisés.

Témoin : 300cm3 d’acétone additionnés de 40cm3 HCI N}5 exigent 40cm3,2 de Na OH correspondante pour être neutralisés.

Il ne paraît donc pas certain que l’oxychlororaphine possède une fonction basique.

Action du chlore et du brome (1). — Lorsqu'on fait passer un courant de chlore dans des solutions aqueuses ou chlorhydriques d’oxychlororaphine, on obtient un précipité blanc cristallin, soluble en jaune dans l’ammoniaque. De même, le brome précipite l’oxychlororaphine de ses solutions aqueuses sous forme de belles aiguilles jaunes.

Action de la potasse. — La potasse ajoutée en excès aux solutions d’oxychlororaphine précipite de grandes aiguilles jauneverdâtre ou de longs filaments flexueux.

Lorsqu’au contraire on superpose une solution cétonique d’oxychlororaphine et une dissolution aqueuse saturée de potasse, on observe après un certain temps, partant du plan de contact des deux liquides, la formation d’un corps coloré qui diffuse bientôt dans toute la masse cétonique, celle-ci se colore successivement en bleu clair, bleu foncé, violet, orange, et enfin en-jaune.

Chauffée en présence de potasse et d’eau, l’oxychlororaphine dégage de l’ammoniaque. L’azote dégagé peut atteindre 13,91 %, alors que la matière en renferme 19,4%.

(1) Comme, pour effectuer toutes les réactions qui vont suivre, je ne disposais que d’une faible quantité de substance, je ne pouvais songer à vouloir déterminer la nature des produits obtenus avec tel ou tel agent; les réactifs qui déterminent, dans la substance, un changement visible à l'œil, seront donc seuls étudiés.

Oxydation. — Les solutions acides d’oxychlororaphine abandonnées à l’air ne tardent pas à être le siège de phénomènes nouveaux. C’est ainsi qu’une solution chlorhydrique, abandonnée en vase ouvert à la température du laboratoire, présente, au bout de cinq jours, une teinte rouge et un précipité rouge-brun constitué par de petites sphères brunes. Chaque sphère est ellemême formée d’une infinité d’aiguilles. Dans le même temps et dans les mêmes conditions d’aération et de température, une solution azotique (additionnée de quelques gouttes d’HCI) donne un dépôt cristallin rouge brique et de petits cristaux jaunes flottant dans la solution. Le premier précipité est constitué par des sphères brunes et le second par des cristaux cunéiformes extrêmement réguliers.

Suivant les conditions d’oxydation, on obtient soit une teinte rouge clair des solutions et un précipité cristallin, soit seulement la coloration rouge foncé des liqueurs. Dans ce dernier cas, le traitement de la solution par le chloroforme montre que l’on peut séparer une liqueur chloroformique jaune, souvent fluorescente, dont la coloration augmente avec le temps et une liqueur acide rouge vineux qui devient de plus en plus violacée.

L’eau oxygénée, le perborate de soude, l'acide nitreux, le bichromate de soude, le permanganate de potasse, la mousse de platine, ne déterminent aucune coloration nouvelle de la substance Jaune.

Réduction. — Lorsqu'on traite une solution aqueuse d'oxychlororaphine par Zn et HCI, on observe le verdissement de la liqueur. Mais, si la réduction se prolonge, la solution devient successivement verte, jaune verdâtre, jaune d’or et incolore. De la teinte jaune verdâtre, on peut revenir au vert par H, O», mais à partir de la nuance jaune d’or, les oxydants ne le permettent plus.

Avec les solutions cétoniques, on observe une succession de teintes analogues. Le fer et HCI, le fer et l'acide acétique, donnent les mêmes résultats que Zn et HCI.

La poudre de zinc en présence d’eau et à 1009 durant quelques. secondes, le fer et le zine en présence de sulfate d’ammoniaque

et d’eau, déterminent la précipitation de cristaux verts qui paraissent semblables à ceux de chlororaphine.

Lorsque l’on fait passer un courant d'hydrogène dans des solutions d’oxychlororaphine, on n’observe aucun verdissement de la liqueur. 11 n’en est plus de même lorsqu'on chauffe la substance jusqu’à sa température de fusion dans une atmosphère d'hydrogène, on obtient alors par sublimation de beaux cristaux verts.

L'acide sulfhydrique produit à chaud, dans les solutions aqueuses, un précipité cristallin vert; dans les solutions cétoniques, il colore seulement la liqueur en jaune d’or, mais l'évaporation, à l'abri de l'air, de la dissolution donne de beaux cristaux verts. Le sulfhydrate d’ammoniaque se comporte comme l'acide sulfhydrique.

Réactifs généraux précipitants des alcaloïdes. — J'ai consigné dans le tableau ci-dessous quelques-uns des résultats obtenus avec les réactifs des alcaloïdes.

OXYCHLORORAPHINE EN SOLUTION

DÉSIGNATION DU REACTIF

aqueuse | cétonique

Acide phosphomolybdique Pp. (1) jaune serin amorphe Acide métatungstique Pp. jaune serin amorphe Tanin Pp. jaune serin amorphe lodure double de bismuth} et de potassium \ Acide picrique | Rien | Pp. jaune cristallin Bichlorure de mercure & pis ST oers Eee aiguilles groupées en rosaces ) Bromure de potassium bromé!| Pp. blanc cristallin, aiguilles | » (PP. orangé, grandes aiguilles Chlorure d’or { jaune brun (précipitation s'ef-! Précipitation instantanée

Pp. rouge brique amorphe ; »

| fectue après quelques minutes).

Pp. cristallin instantané {Y. chloroplatinate)

Chlorure de platine Rien

@) Pp. signifie précipité.

S'il est impossible d'obtenir le chloroplatinate en utilisant les solutions aqueuses, on obtiendra néanmoins ce sel en partant de Ja solution chlorhydrique de la substance. Ces liqueurs sont, en effet, plus concentrées que les dissolutions aqueuses.

Enfin, les réactifs colorants des alcaloïdes donnent, avec l’oxychlororaphine, des colorations variant du jaune au rouge grenadine.

Spectre. — Les solutions cétoniques ou acides d’oxychlororaphine, les solutions réduites et vertes, ne présentent pas de bandes d'absorption caractéristiques. On constate seulement l'extinction du spectre dans la région la plus réfrangible.

Action physiologique. — L’oxychlororaphine, soit par ingestion, soit par introduction dans la cavité abdominale à la dose de 1 à 12 milligrammes, ne paraît pas déterminer de troubles appréciables chez le Cobaye et la Souris. Sa faible solubilité dans l’eau rend difficile l’introduction dans l’organisme de doses suffisantes pour mettre en parallèle son action avec celle de certains pigments d’origine animale, la bilirubine par exemple, qui tue aux doses de 0,05 à 0,1 par kilog. d'animal. Les résultats signalés plus haut sont comparables à ceux qui ont été obtenus avec la pyocyanine. GEssarp (1882) a, en effet, injecté sans succès une faible quantité de pyocyanine à un oiseau, et LEGros (1900), opérant avec des doses de 5 milligrammes, n’a pu déterminer aucun trouble sensible chez le Cobaye.

RÉSUMÉ

Chlororaphine. — La chlororaphine cristallise dans les milieux de culture sous forme d’aiguilles vertes groupées en rosaces, en faisceaux. Elle se sublime vers 2109 et donne des cristaux verts dans une atmosphère de gaz inerte, et des cristaux d’oxychlororaphine en présence d'oxygène. Elle fond vers 2259, sans point de fusion net. Elle est insoluble dans l’eau et la plupart des solvants neutres. Elle se dissout dans l’acétone, l’aniline et les acides. Par contre, elle est insoluble dans les alcalis concentrés. Abandonnée à l’air, elle absorbe l’oxygène et se transforme en oxychlororaphine. L’oxydation est activée par la chaleur; ses solutions sont très oxydables, d’où la nécessité d'effectuer la purification des cristaux verts à l'abri de l’air.

Dissoute à chaud dans l’acétone, elle laisse déposer, par refroidissement, des cristaux jaunes d’oxychlororaphine que l’on purifie par des cristallisations successives.

Oxychlororaphine. — L’oxychlororaphine se sublime facilement et fond à 2360,8 (F. c.). Elle est faiblement soluble ou insoluble dans les solvants neutres, très soluble dans les acides concentrés, mais les alcalis concentrés ne peuvent la dissoudre. Les cristaux jaunes répondent vraisemblablement à la formule suivante :

Ci: ° Ho N3 =0

L’oxychlororaphine forme des sels doubles avec le chlorure de platine (C,, H;9 N; O HCÏD), Pt CI, et le chlorure d’or; mais il n’a pas été possible d'obtenir de chlorhydrate ou de sulfate. La potasse à froid et dans des conditions spéciales détermine l'apparition d’un chromogène passant du bleu à l'orange à mesure que la réaction se continue. L’oxychlororaphine, chauffée en présence de potasse et d’eau, dégage de l’ammoniaque. Fondue avec l’oxyde de potassium, elle donne naissance à un produit cristallin brun, soluble dans l’eau. L’oxydation par l’air des solutions de substance jaune permet d'isoler de nouveaux chromogènes (violet, jaune fluorescent, jaune, rouge brun). La réduction en liqueur acide de l’oxychlororaphine donne de belles solutions vertes; en milieu neutre ou légèrément alcalin, il y a précipitation de cristaux verts. Les solutions de substance jaune précipitent par tous les réactifs des alcaloïdes. Le spectre des diverses solutions d’oxychlororaphine ne présente pas de bandes d'absorption caractéristiques. Enfin, cette substance paraît dénuée de propriétés toxiques.