CHAPITRE VIII

Au sujet de la virulence de l’Aspergillus fumigatus FRESENIUS

Au cours de nos recherches ayant pour but d'examiner l’action du radium sur l’Aspergillus fumigatus RRESENIUS nous avons dû reprendre les travaux de DIEULAFOY, CHANTEMESSE et WIDAI, d’une part, de RIBBERT et LICHTHEIM d’autre part sur l’anatomie pathologique de l’aspergillose.

Nous avons eu recours à des expériences sur des animaux et ainsi nous avons pu comparer nos résultats avec ceux de RENON. Les inoculations ont été pratiquées sur des pigeons et des cobayes au moyen d’émulsions de spores de deux souches différentes :

19 Spores provenant d’une vieille culture d’Aspergillus fumigatus FRESENIUS du laboratoire de Bactériologie de la Faculté rendue virulente par repiquages successifs de milieux pauvres sur des milieux riches et passages successifs d’animal à animal ; comme nous venons de le dire dans un chapitre précédent.

29 Spores provenant d’une culture de deuxième génération issue d’ascospores obtenues par l’action du radium sur l’Aspergillus fumigatus.

Nos inoculations ont toujours été faites au moyen d’émulsion de spores dans du sérum physiologique, détail très important, qui n'avait pas été mis en pratique par RENON; celui-ci injectait des émulsions de spores dans du bouillon de viande non isotonique. La numération des spores a toujours été effectuée par nous au moyen du compte-globules de MALASSEZ; ainsi nous avons opéré avec des concentrations constantes limitées entre 4.000.000 et 5.000.000 de spores par centimètre cube. Les pigeons ont été inoculés dans la veine axillaire avec 1 cc. d’émulsion, les cobayes dans le péritoine avec 2 cc. ou dans le cœur avec 0,2 cc. d’émulsion.

Symptômes cliniques. — Pigeons : De tous nos essais sur les pigeons résultera tout d’abord la constatation que l’action pathogène de l’Aspergillus fumigatus n’est de loin pas si foudroyante que les expériences de RENON pourraient le faire croire. Les pigeons injectés par celui-ci meurent dans les 4 premiers jours qui suivent l’inoculation: cette mort précoce paraît devoir être imputée à des phénomènes secondaires provenant de la non-isotonie des solutions injectées ou à des causes non contrôlables, car la marche de l’aspergillose chez nos pigeons a toujours été lente, même lorsqu'il s’est agi d’émulsions 2 à 4 fois plus concentrées que les précitées, fait en

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accord avec les résultats obtenus par RENON alors qu’il expérimentait la contamination par inhalation de spores dans la trachée. Les symptômes caractéristiques de la maladie, tremblements nerveux, prostration assez prononcée, manque d’appétit, élévation de la température apparaissent toujours le deuxième ou troisième jour après l’injection. Ils s’accentuent encore jusqu’au cinquième jour; à partir de ce moment l’appétit revient, l’animal devient plus vif, reprend du poids, cette pseudo-convalescence dure 2 à 3 jours; alors seulement débute la période aiguë de la maladie qui se termine par une issue fatale survenant après une période de 2 à 6 semaines. La durée de la maladie varie avec la virulence du champignon et l’inoculation pratiquée avec la souche n° 2 a toujours accusé une survie plus courte; ceci démontre que les générations provenant d’ascospores sont plus pathogènes que celles provenant de conidies.

Cobayes : des inoculations intrapéritonéales et intracardiaques au cobaye ont été faites afin d'examiner l’anatomie pathologique de l’aspergillose provenant de l’introduction de l’agent pathogène dans la grande et la petite circulation; les inoculations pratiquées dans la petite circulation, c’est-à-dire dans le ventricule droit du cœur avec des spores de la souche n° 2, et seulement avec celles-là, ont tué les animaux au bout de 5 à 6 jours; à l’autopsie nous avons constaté, la présence de foyers infectieux uniquement dans le poumon et dans les bronches; tous les autres organes même le foie et le rein sont restés sains. Les inoculations intrapéritonéales de spores de souche n° 2 ont donné des symptômes clinique, identiques à ceux que nous signalons plus haut à propos des pigeons. Les cobayes inoculés avec des spores de souche n° 1 sont toujours entrés en convalescence définitive le cinquième ou sixième jour après l’inoculation; après 15 à 20 jours ils ont repris leur poids initial. Nous ferons remarquer encore une fois ici l’augmentation de la virulence de l’espèce provenant de la germination des ascospores; ces expériences prouvent que l’Aspergillus fumigatus peut aussi devenir pathogène pour le cobaye à tel point qu’il occasionne la mort.

Examen des lésions aspergiliennes. — Macroscopiquement : à l’autopsie des pigeons ou des cobayes ayant succombé à l’aspergillose, il nous a été donné de constater des anomalies ou des lésions dans les organes suivants: point d’inoculation : abcès purulent avec adhérences. Cœur arrêté en diastole. Poumons présentant des cavernes purulentes et des nodules tuberculeux. Foie très hypertrophié, montrant à la surface de nombreuses petites pustules remplies d’un pus granuleux. Vésicule biliaire toujours très gon- Îlée. Rate volumineuse, mais sans lésions visibles. Rein très gros et parsemé de tubercules miliaires. Vessie toujours pleine d’urine avec une muqueuse ulcérée. Estomac et intestin normaux. Pancréas normal. Glandes surrénales et ganglions mésenthériques très volumineux.

Microscopiquement: les examens microscopiques pratiqués sur des coupes de différents organes et colorées par l’hématoxyline ferrique-6osine nous ont permis de vérifier les constatations de

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DIEULAFOY, CHANTEMESSE et Wipar, et de RIBBERT au point de vue de le constitution et de l’évolution des nodules tuberculeux et de la présence de corps rayonnants surtout dans les poumons et dans les reins. Nous avons en outre pu constater que 1’ Aspergillus Jumigatus se présente dans les alvéoles des poumons et dans les reins sous l'aspect normal : filaments mycéliens avec hyphes fructifères terminées par des ampoules conidiophores, tandis que dans le foie et la vessie il évolue vers les formes Cifromyces et Penicillium, évolution que nous avons aussi pu suivre sur des cultures en milieu pauvre soumises à l’action du radium. De ces observations il ressort, que les tissus serrés contrarient la croissance de l’agent pathogène beaucoup plus énergiquement que les tissus lâches. Des prélèvements effectués dans les différents organes lésés, afin de vérifier l'identité de l’organisme ayant occasionné la mort des animaux en expérience, ensemencés sur pomme de terre, ont tous donné des cultures luxuriantes d’Aspergillus fumigatus FRESENIUS.

Essai de vaccination. — Nos essais entrepris pour constater s’il était possible de rendre réfractaire à une nouvelle dose de spores d’Aspergillus, un animal déjà inoculé antérieurement avec une dose plus faible ou un type moins virulent, ont confirmé entièrement les assertions de RENON et de LUCET.

Pour les recherches qui ont été effectuées antérieurement au sujet de la vaccination et de l’immunisation contre l’Aspergillose nous renvoyons au travail de I, GAUTIER qui donne l’historique complète de la question; comme nous l’avons déjà dit au début de ce travail, nos recherches ne sont pas encore avancées à tel point, que nous puissions dès maintenant formuler des conclusions. Nous tenons cependant pour complèter l’exposé de nos recherches à mentionner ici les quelques faits, que nous avons pu observer au cours de nos expériences.

Treizième Expérience :

Nous avons ensemencé sur milieu pauvre en matières nutritives une souche d’Aspergillus fumigatus très pathogène comme nous l’avions constaté avant d’entreprendre l’expérience. Cette culture a été exposée après au radium, suivant la technique habituelle, à des doses massives de 7 à 10 millicuries par centimètre carré de surface.

Après l’irradiation la culture a été placée à l’étuve à +372 et après 3 jours de repos nous avons entrepris l’inoculation; celleci a été pratiquée dans le péritoine d’un cobaye au moyen d’une émulsion de conidies à une dose et une concentration ordinaire. L'animal manifesta une indisposition pendant la première et la deuxième journée, puis redevint normal; le poids n’a guère varié. Huit jours plus tard nous lui avons injecté une seconde dose à une concentration deux fois plus forte de la même souche. I/animal, bien nourri restait encore au repos pendant 8 jours et ne montrait aucune gêne. Après cette période l’expérience suivante a été mise en œuvre :

L'animal ayant reçu les deux injections de spores atténuées par le radium et par culture sur milieu pauvre est inoculé avec une

dose habituelle d’émulsion de conidies provenant d’une souche de deuxième génération issue d’ascospores; l’inoculation a ete pratiquée dans le péritoine; le poids initial de l’animal était de 410 grammes; la courbe suivante indique les variations du poids du cobaye. (Fig. 17).

grammes:

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jours: 4 235 # 5 6 Y 8 9 ro «1 1213 14 1546 Xi: Courpe de poids du cobaye Mi 13€ 19. vacciné.

Nous voyons que le poids tombe le premier jour, qu'il augmente légèrement le deuxième pour rester constant pendant 3 jours; le cinquième jour après l’inoculation, l’animal reprend du poids et le dixième jour il a même dépassé son poids initial.

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A A EI ON EE ZE EI RE ni an 2 LL DS FT nu mue: Be

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29 Un deuxième cobaye, d’âge et de poids à peu près égal, est inoculé le même jour avec une émulsion de spores de doses et de provenance identique.

E Je eortbe suivante indique les résultats des pesées journalières: 1g. 18). |

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Le seizième jour l’amimal qui n'avait pas été-traité par des spores atténuées a succombé à l’aspergillose et il présente à lPautopsie les lésions rénales et hépatiques ordinaires. La courbe indique d’ailleurs très nettement nos constatations énoncées plus haut au point de vue évolution et durée de la maladie.

Afin de vérifier ces résultats nous avons entrepris la même expérience une seconde fois avec le même succès. Ces essais démontrent la prévoyance de RENON, qui n’ayant obtenu que des ébauches de résultats heureux, encouragea les recherches dans la voie des injections progressives croissantes de‘spores virulentes, destinées à amener une immunisation chez les animaux de laboratoire.

Nos recherches qui sont encore à leur début ne nous permettent pas de généraliser à présent nos conclusions, car il conviendrait d’entreprendre un grand nombre d’expériences sur des animaux variés tels que pigeon et lapin: Mais elles nous donnent la certitude qu’il existe à côté de la toxine, probablement de nature chimique et dépendant d’une assimilation intense de l’Aspergillus cultivé sur milieux appropriés et spécifiques, un autre poison de la nature des toxalbumines proprement dites. En effet la nature de la maladie examinée par nous dans tous ses détails, le prouve. La présence du parasite dans les tissus malades, à elle seule ne peut suffir à expliquer l'affection, les crises violentes si caractéristiques et l’issue fatale dans un délai relativement très court. En outre les quelques résultats heureux d’immunisation par le virus même parlent nettement en faveur d’une sécrétion de toxines vraies, car comme le fait observer I,. GAUTIER : «on ne vaccine bien qu'avec des substances complexes, comme les toxines bactériennes ».

Pour projeter plus de clarté dans ces problèmes assez délicats nous avons alors cru bien faire d'effectuer des essais dans un autre sens : 10 Nous avons vacciné des cobayes par des spores atténuées suivant la technique personnelle citée plus haut; nous leur avons ensuite inoculé différentes doses de liquide de culture spécifiques (formule de I,. GAUTIER : eau 100 ce., glucose 3 gr., peptone 1 gr.) ne contenant plus que les produits solubles secrétés par le champignon pathogène.

29 D'autre part nous avons cultivé l’Aspergillus pathogène sur milieu glucosé peptoné; ces eultures ont été irradiées avec des doses de 5 à 7 MC par centimètre carré de surface. Après 15 joufsle substratum était filtré et inoculé au cobaye, en même temps un pigeon était inoculé au moyen des conidies de ce milieu, afin d’examiner leur virulence; ces expériences sont décrites ci-après.

Quinzième expérience :

Un cobaye de 460 grammes reçoit par voie intrapéritonéale une injection d’une émulsion renfermant 2.000.000 de spores irradiées. Huit jours plüs tard l’animal-est traité par une seconde inoculation avec une émulsion fenfermant 4.000.000 environ de conidies irradiées. I/animal ne présente rien d’anormal; huit jours après le cobaye est inoculé dans le péritoine avec 10 cc. de liquide de culture: le substratum avait été préparé suivant les méthodes de L. GAUTTER et la culture était âgée de 16 jours: Le cobaye a succom-

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bé dans la dix-septième heure après l’inoculation, en passant les stades de tremblements, de mouvements convulsifs; de paralysie et de coma décrits par l’auteur. Cette expérience prouve que les spores atténuées n’ont pas d’action immunisante contre la toxine chimique et spécifique d’un milieu de culture.

Seizième et dix-septième expériences :

Un cobaye de 610 grammes reçoit dans le péritoine 2 cc. de liquide de culture irradiée et filtrée par une méthode que nous décrivons dans le chapitre suivant. L'animal reste normal. Huit jours plus tard il reçoit encore 4 ce. de même liquide. Huit jours après l’animal est inoculé avec 3 cc. de liquide provenant d’une culture d’Aspergillus pathogène sur milieu jus de carotte salé. II ne présente aucun symptôme anormal et le lendemain de l’inoculation il montre un très bon appétit, et garde son poids initial.

Nous avons alors fait la même expérience, mais en injectant finalement 10 cc. de liquide provenant d’une culture d’Aspergillus pathogène sur milieu jus de carotte salé. Le résultat fut identique, l’animal ne présenta aucune crise.

Le même cobaye a été inoculé huit jours plus tard avec une émulsion de spores pathogènes de dose et de concentration ordinaires. L'animal a présenté le premier et le second jour quelque indisposition, maïs il revint bientôt à son état normal et vit encore aujourd’hui (3 mois après l’expérience).

Dix-huitième et dix-neuvième expériences :

Un pigeon de 317 grammes a été inoculé par voie intraveineuse avec une émulsion de spores provenant d’une culture sur milieu glucosé peptoné. Cette culture avait été irradiée au paravant avec 5 MC par centimètre carré de surface à 3 mm. de distance et au moment de l’emploi elle était âgée de 15 jours. La dose et la concentration de l’émulsion injectée ont été celles que nous avons généralement employées. L'animal présentait dans les premiers jours des symptômes moins prononcés qu’ordinairement. Aussi le dénouement de la maladie présentait-il un peu de retard, mais au cours de la cinquième semaine, l’oiseau succombe à l’aspergillose généralisée, constatée par l’autopsie et par la culture de prélèvement effectuée au niveau des lésions. LAspergillus fumigatus cultivé sur ce milieu très nutritif reste donc virulent pour le pigeon après une irradition au moyen de la dose indiquée.

D’autre part un cobaye de 448 grammes a reçu une inoculation intrapéritonéale de liquide provenant d’une culture d’Aspergillus pathogène sur milieu spécifique glucosé peptoné âgée de 15 jours et irradiée à partir du quatrième jour après l’ensemencement avec 5 MC par centimètre carré de surface. Pendant les deux heures, qui ont suivi l’injection, l’animal montre seulement un tremblement nerveux, une sorte de paralysie de l’arrière-train fait son apparition. Pendant une demi-heure à peu près l’animal se traîne sur ses pattes antérieures; il y a émission d’urine et de matières fécales, mais au bout de 2 heures l’animal se remet et le lendemain le cobaye est revenu à son état normal.

Ces expériences nous permettent d'émettre les conclusions provisoires suivantes : elles ne doivent pas être définitives étant donné que nos recherches sont incomplètes et embryonnaires :

19 Contre le virus de l’aspergillose même l’immunisation est positive en employant des spores provenant d’une culture irradiée sur milieu pauvre en matières nutritives.

29 Contre la toxine isolée par L. GAUTIER (poison ne rentrant pas dans Îe groupe des toxines proprement dites) l’immunisation au moyen de spores provenant d’une culture irradiée sur milieu pauvre en matières nutritives est négative.

3° Le pouvoir de la toxine élaborée par l’Aspergillus fumigatus sur milieu spécifique glucosé peptoné est diminué par l’action du radium, la puissance de cette toxine est donc fonction de la vigueur de l’organisme et de son assimilation.

4° L/immunisation au moyen de liquide provenant d’une culture d’Aspergillus fumigatus irradiée sur milieu pauvre en matières nutritives et injecté à des doses croissantes est positive :

a) soit pour la toxine qui pourrait exister dans le substratum.

b) soit pour le virus de l’Aspergillus même injecté à des doses ordinairement mortelles.

C’est précisément les résultats obtenus ici qui nous guiderons dans nos travaux ultérieurs; si nous arrivions à vacciner au moyen d’un liquide de culture contre le virus de l’Aspergillose, (ce qui nous prouvera l'existence certaine d’une toxalbumine) il nous faudra encore prouver la toxicité de ce milieu même sur les animaux de laboratoire et arriver à caractériser et éventuellement à isoler le poison.

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