CHAPITRE VII

La formation des périthèces chez l’Aspergillus fumigatus FRESENIUS sous l'influence du Radium

Abandonnant alors notre dernier milieu qui ne nous donnait pas entièrement satisfaction, nous avons décidé de changer une fois de plus l’électrolyte. Toujours sous l'influence des travaux de SCHNEIDER et étant donné les heureux résultats que nous avions obtenus dans les milieux pauvres en matières nutritives, le chlorure de sodium a retenu notre attention vu son pouvoir élevé de dissociation sur le milieu et son inactivité sur l’organisme; nous avons donc préparé le milieu suivant :

Saccharose pure cristallisée Poulenc... 5 gr. Gétatine. isoélectrique de PH —.4,7 .:... 7,5 pr. ILMIOrEUTECAE SOI : . 24e names EST.

Eee (CATOÉTÉ Re à SAM. à» 100 cc.

Ce milieu a été stérilisé et ensemencé suivant nos techniques déjà exposées; des cultures témoin ont été aussi employées; les cultures sont placées à l’étuve à + 270; 24 heures après l’ensemencement le développement de la culture était très satisfaisant et 48 heures après, un tapis homogène d’un blanc brillant s’étalait sur le milieu, qui a pris une consistance semi-liquide favorisant l’action du radium sur l’organisme à travers le milieu. Les appareils reproducteurs ont fait leur apparition au courant de la troisième journée; les formes et les dimensions de l’Aspergillus fumigatus sont identiques à celles décrites dans le Chapitre Ier (culture sur pomme de terre). Cinq jours après l’ensemencement, les cultures sont exposées au radium en suivant toujours notre technique déjà décrite; la dose d'irradiation était de 10, 2 millicuries par centimètre carré à une distance de 2 à 3 mm. Dans le courant de la deuxième journée de cette irradiation nous voyons apparaître des points brun-noirâtres très rapprochés, entouré du thalle mycélien resté blanc brillant. Ces points se réunissent dans la suite en une colonie noire pour former une sorte de sclérote oblong, le plus souvent en forme de fuseau. Ce sclérote se formait toujours unique sur chaque culture en un point situé où au milieu de la calotte feutrée, couverte au moyen des tubes de radium, ou contre la paroi de verre; toujours il est solitaire dans le milieu, il paraît donc se manifester une concentration d’énergie séxuée. Cet organe se forme sur la partie immergée et opposée au mycélium conidiophore.

L'examen microscopique de la culture nous montre d’abord que la reproduction aséxuée a complètement disparu; aucun appareil reproducteur conidien de nouvelle formation ne peut être décelé; la vérification de ce fait a été obtenue au moyen de cultures en goutte pendante sur le même milieu; les filaments mycéliens se sont fortement épaissis et cloisonnés. Réensemencées sur un autre substratum, les vieilles conidies ont accusé un retard dans leur développement et leur germination. Ce retard est variable suivant la température de culture : placées à + 270 de 5 à 6 jours, à + 37° de 2 à 3 jours: Les nouveaux appareils reproducteurs formés sur ces milieux affectent une forme très frèle et permettent de constater les mêmes modifications vues dans nos recherches sur les milieux

ig. 13 — Coupe de sclérote

pauvres avec des doses de radium moins massives; pour nous rendre compte de l’hérédité des caractères acquis nous avons entrepris plusieurs repiquages et constaté qu'après la cinquième et sixième génération seulement, les caractères de souffrance du mvycélium et l’instabilité des appareils reproducteurs avaient disparu.

. Morphologie de l'appareil reproducteur sexué. — JI/’examen microscopique des sclérotes pratiqué au moyen de coupes au microtôme dans la paraîffine après fixation dans le liquide de Bouin et coloration par l’Hématoxyline ferrique-éosine nous a montré la structure suivante : le sclérote est formée par des filaments déformés à pigmentation brun-rougeâtre, à membrane très épaissie, fortement cloisonnée, à tel point que très souvent les différents articles d’un

filament sont sphériques. À un faible grossissement on voit çà et là ces filaments enchevêtrés en amas denses globuleux, opaques, constituant un feutrage épais. (Fig. 13).

Par montagnisation de coupes fraîches nous trouvons dans l’intérieur de ces agglomérations un corps brun-jaunâtre: le périthèce. (Fig. 14). Presque impénétrable à la lumière, très difficile à éclaircir, de forme sphérique, limité par une membrane lisse, composée de plusieurs rangées de cellules. Celle-ci entoure un faux tissu, formé de courts filaments cellulaires, plus ou moins hyalins, entre lesquels se groupent sans choix ni ordre des asques ronds ou ovalaires, à parois très fines et frêles, se désagrégeant à maturité. Ils renferment chacun 8 ascospores elliptiques à membrane très

Fig. 14 — Le Périthèce

épaisse. Les deux extrémités sur le plus grand diamètre se caractérisent par un pôle noir, sorte de pore par lequel se fait la germination; à l’intérieur nous distinguons une zone réfringente s’effilant vers les pôles. La coloration par le colorant triple de GUEGUEN décèle dans les filaments périthéciens de fortes condensations protoplasmiques; nous notons ici l’absence complète de graisses; les dimensions des différents organes sont les suivantes : Périthèce : 70 à 110 y de diamètre; Asques : jeunes : 12 à 14 y Sur 7 à 10 W asques murs : 15 à 22,5 W; ascospores jeunes 2 à 3,75 & Sur 0,6 à 1 y; ascospores à maturité: 4 à 6,25 y de longueur ; filaments épaissis : 3 à 5,5 u, membrane des filaments : 0,8 y à 1,2p. (Fig.15).

Pour vérifier nos constatations et contrôler la pureté de notre culture, nous avons tout d’abord repiqué une parcelle de sclérote sur milieu de Sabouraud et pomme de terre. Nous avons

placé ces milieux à l’étuve à +370 et nous constations dès le lendemain le développement d’un mycélium. Ie troisième Jour apres l’ensemencement tout le milieu était couvert de filaments blancs et le quatrième jour nous avons trouvé à l’examen microscopique de magnifiques appareils reproducteurs normaux d’Aspergillus fumigatus FRESENIUS dont les dimensions étaient :

Hyphes fructifères : 6 à 7,5 y. prié

Ampoules conidiophores : 12 à 10 v. de diamètre .

Stérigmates insérés sur la moitié supérieur du renflement

terminal : 5 à 6 y de longueur.

Conidies rondes jaune-bronzé : 2 à 3 W.

Fig 0t5

Filaments épaissis et Ascosporces libérés par mcutagnisation

Des autres cultures ont été pratiquées en goutte pendante de la façon suivante : nous avons préparé des micropipettes suivant la méthode de K1rx, CHAMBERS et PETÉRFI au moyen de tubes de verre de 2 mm. de diamètre; ces tubes ont été étirés sur la flamme d’un bec Bunsen pour avoir une effilure de 3 à 3 1; l’autre extrémité a été reliée à une seringue de Pravaz, par laquelle nous aspirions sous le microscope une où deux ascospores. Celles-ci ont été ensemencées dans une goutte de liquide de Raulin sur la lamelle d’une cellule de VAN TIEGHEM; cette cellule a été placée à la température du laboratoire et examinée sous le microscope tous les jours; la germination commençait dès la dix-huitième heure après l’ensemencement; les filaments mycéliens se développaient les

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jours suivants normalement et le sixième jour nous avons constaté le premier stade de la formation conidienne; l’évolution des appareils reproducteurs aséxués continuait alors dans l’ordre normal, c’est-à-dire apparition de l’hyphe fructifère, puis renfleinent de celle-ci en goupillon, apparition des stérigmates, qui engendrent enfin des conidies; c’est donc une formation centrifuge déjà constatée par J. Ray. Le huitième. jour toute la surface de la cellule est envahie par des appareïls reproducteurs aséxués normaux.

Aucun doute n'étant plus possible, nous avons par l’influence du radium à plusieurs reprises reproduit la formation périthècienne sur l’Aspergillus fumigatus qui doit désormais porter le nom d’Eurotium.

Comme nous venons de l’exposer, nous avons pu constater les premiers indices de la formation périthècienne au cours de la deuxième journée de l’irradiation, qui pour atteindre la dose de 10,2 MC a duré 3 jours ; nous nous sommes donc demandés quelle était la dose minima exacte nécessaire pour déterminer la production du phénomène. Pour cela nous avons effectué plusieurs essais, d’une part en diminuant la quantité de Radium et en prolongeant le temps de l’irradiation, d’autre part en employant les doses initiales de radium et en diminuant le temps d’exposition. Nous avons toujours constaté l’apparition de sclérotes périthèciens à la fin de la deuxième journée; en soustrayant les cultures à l’influence du radium dès l’apparition des premiers indices le phénomène a pris une évolution moins accentuée; les sclérotes ont gardé des dimensions réduites. À ce moment l’irradiation était de 6 à 7 millicuries par centimètre carré de surface. En employant de faibles quantités de radium et en augmentant le temps de l’exposition, le succès était plus incertain; l’apparition de la formation périthècienne était alors fonction d’une dose plus considérable que 10,2 MC en même temps que peu constante et aléatoire.

Toutefois l’irradiation à elle seule ne semble pas suffir à expliquer la production de ce phénomène, car le milieu de culture lui aussi paraît exercer une influence qui ne doit pas être négligée. Pour éclaircir cette question nous nous sommes adressés à des autres milieux dissociés ou non, comme milieu de Sabouraud, milieux végétaux habituels, liquide de Raulin, sur lesquels avec les mêmes doses et des doses plus fortes nous n’avons jamais pu assister à de semblables productions. Nous avons alors pensé, pour étudier la question complètement, essayer un milieu identique dans lequel on avait substitué la gélose à la gélatine; dans ce cas également nos recherches ne furent pas couronnées du succès.

L'hérédité des caractères acquis. — Afin de contrôler l’hérédité des caractères acquis nous avons procédé à des repiquages successifs sur nouveau milieu (Sabouraud, pomme de terre, jus de carotte gélatiné); mentionnons d’abord que sur milieu irradié même où la formation des sclérotes s’est effectuée, les ascospores sont toujours restées à l’état de vie ralentie; c’est ainsi que nous avons pu conserver une culture à sclérote dans le milieu d’irradiation sans que celui-ci ait jamais évolué, conservant ses dimen-

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sions et son aspect. Un autre sclérote enlevé de la culture et du milieu nutritif et ensemencé sur bloc de plâtre, imbibé d’eau stérilisée, est resté à l’état de vie ralentie; ensemencé après 8 mois sur milieu de Sabouraud et placé à l’étuve à +379, nous avons obtenu une culture luxuriante d’un blanc brillant au bout de 4 jours.

Sur nouveau milieu, tel que pomme de terre, Sabouraud, etc. les ascospores ont toujours germé pour donner naissance à des filaments mycéliens qui tout de suite ont repris la reproduction asexuée. Ces souches ont toujours donné naissance à des cultures très luxuriantes, possédant une rapidité de croissance très prononcée et ont gardé pendant très longtemps leurs caractères de jeunesse, se manifestant par la conservation de la teinte blanc brillant pendant 2 à 4 semaines pour passer seulement ensuite à l’aspect verdâtre et gris fuligineux caractéristique de l’Aspergillus fumigatus.

Nous avons alors ensemencé des ascospores sur milieu jus de carotte gélatiné de pH — 4,7, dissocié par le chlorure de sodium, donc milieu favorisant la formation périthécienne. Ces milieux étaient placés à l’étuve à +270; le développement s’est montré très satisfaisant, mais l’examen microscopique journalier nous a bientôt révélé un phénomène curieux : tandis que certaines cultures produisaient dès le troisième jour des appareils conidiophores, certaines autres présentaient un retard dans l’apparition des appareils aséxués malgré le développement luxuriant du mycélium. A partir du septième jour jusqu’au dixième jour nous avons toujours vu apparaître sur ces milieux, à la face inférieure du stroma, baigné dans le milieu, les points brun-noirâtre, si caractéristiques, qui nous annonçaient l’apparition de la reproduction séxuée. Nous avons ainsi obtenu deux souches, deux mutantes comme les appelle NADSON dans ses recherches sur les levures en comparant ces races obtenues par l’influence des rayons ionisants aux mutantes des Bactéries ( BEIJERINCK). Ces faits nous montrent que la reproduction séxuée et la reproduction aséxuée se balancent : lorsqu’une s’affaiblit, l’autre entre dans la place. La première génération cultivée sur milieu jus de carotte gélatiné dissocié par le chlorure de sodium engendre des mutantes, c’est-à-dire que les caractères acquis par l’irradiation peuvent être conservés; mais par contre les propriétés héréditaires de la race peuvent aussi dominer les qualités nouvellement acquises et alors l’organisme reprendra sa vie normale; donc il existe peu de persistance et de stabilité chez les races de première génération issues d’ascospores.

Ces mutantes de nouveau exposées à des irradiations répétées ont continuellement gardé leur mode de reproduction devenu semble-t-il définitif et héréditaire.

Les propriétés de la souche de deuxième génération issue d’ascospores ont ensuite été l’objet de nos recherches. Pour cela nous avons ensemencé des ascospores sur milieu de pomme de terre (Première génération) et ensuite nous avons repiqué ces cultures sur milieu jus de carotte gélatiné dissocié par le chlorure de sodium. Nos résultats sont les suivants : une seule culture sur 10 a conservé

l’agamie; les 9 autres ont repris la reproduction par voie sexuée. Les premières formations du sclérote se montraient entre le sixième et le dixième jour de culture. Le sclérote se développait alors d’autant plus que le milieu s’appauvrissait en matières nutritives et nous avons ainsi obtenu des organes sclérifiés de 10 mm. de longueur sur 1 à 2 mm. de largeur (Fig. 16); mais nous n’avons jamais pu observer plusieurs sclérotes sur un milieu de culture; ces organes restaient uniques, à l’état de vie ralentie sur leur milieu initial. Aussi avons nous pu toujours constater que la deuxième génération possédait l’énergie vitale la plus prononcée au point de vue richesse de culture, luxuriance dans la végétation, avance dans le développement et conservation des caractères de la jeunesse. En outre, en

Fig. 16 Sclérote de II! génération à gauche. Thalle présentant

des néoformations occasionnées par le Radium à droite.

exposant une culture de deuxième génération à l’irradiation deux jours après l’ensemencement, la production des appareils séxués apparaissait déjà avec une dose de 3 MC par centimètre carré de surface et celle-ci est restée constante.

En continuant alors les réensemencements pour contrôler la rétrogradation des caractères acquis, nous avons alors constaté que chezla troisième génération les propriétés fondamentales héréditaires de la race prennent presque toujours la prépondérance sur les qualités nouvellement acquises; en effet, sur 5 cultures de troisième génération, issue d’ascospores, 4 montraient toujours une absence totale de sexualité et comme compensation une reproduction asexuée plus intense que la culture normale.

Pouvoir pathogène de la souche sexuée. -—— Une question restait encore à résoudre : la virulence de l’Aspergillus issu d’ascospores s’est-elle accrue ou non? Pour répondre à ce problème nous avons entrepris des expériences in vivo sur le cobaye avec des cultures de deuxième génération :

Dixième et onnème expériences :

Une inoculation intrapéritonéale à un cobaye pratiquée avec une émulsion contenant 8.000.000 de spores issues de deuxième génération a tué celui-ci en 11 jours. Pendant toute l’évolution de la maladie, l’animal a présenté les symptômes caractéristiques de l’aspergillose, que nous avions constaté dans nos expériences antérieures chez le pigeon. L/autopsie a révélé des phénomènes d'infection généralisée que nous décrirons dans le chapitre suivant.

Un cobaye témoin, de poids et d’âge à peu près identiques, a été inoculé avec la même quantité de spores d’Aspergillus fumigatus FRESENIUS de notre souche initiale provenant de reproduction par conidies. IL’animal a montré des symptômes de crise pendant les 4 premiers jours, pour entrer en convalescence réelle; après 16 jours il a repris son poids initial.

Ces expériences démontrent que le pouvoir pathogène, chez les souches issues d’ascopores s’est fortement accru; nous avons répété ces expériences une deuxième fois avec les mêmes résultats.

Remarquons ici que la virulence de l’organisme s’est augmentée à tel point que l’Aspergillus fumigatus FRESENTUS est devenu nettement pathogène pour le cobaye, résultat que nous n’avons pas pu obtenir avec des souches provenant de conidies.