TECHNIQUE ET MÉTHODES

Origine de la souche d’Aspergillus fumigatus FRESENIUS Vérification des caractères microscopiques et culturaux — Examen du pouvoir pathogène

Dans nos premières expériences ayant pour but de déterminer l’action du Radium sur les champignons inférieurs, notre cher maître nous donna l’idée de faire appel tout d’abord à l’Aspergillus fumigatus FRESENIUS dont les caractères et les propriétés sont connus et fixés, organisme pathogène, présentant fort peu de pléomorphisme.

Nous avons employé une souche de notre laboratoire cultivée sur pomme de terre dont nous avons vérifié la pureté par l’examen microscopique direct avec ou sans coloration et par ensemencement sur les divers milieux de culture; l’examen direct nous a donné les caractères suivants. «Mycelium à feutrage serré formé par des filaments très iongs, enchevêtrés, ramifiés, rarement cloisonnés, tantôt épais (de 2,5 y à 3,25 w) tantôt grèles (1 y à 1,5 x) Hyphes fructifères longues et à parois délicates; elles mesurent 3 à à 5 y de largeur; chacune des hyphes fertiles est terminée par une ampoule conidiophore affectant la forme d’un goupillon mesurant dans sa plus grande largeur de 7,5 w à 16 w; du sommet à la première cloison de l’hyphe 30 à 90 y. Les sterigmates sont insérés sur la moitié supérieure du renflement terminal; ils sont elliptiques, bronzés, leur longueur atteint 4,5 à à 6,5 y; leur largeur se trouve comprise entre 2 x et 3 y. Les conidies sont rondes (1 # à 3,5 4) bronzées, elles restent rarement attachées au sterigmate. Le protoplasme remplit exactement tous les articles et les membranes des filaments mycéliens sont peu épaisses.

Afin d’observer l’aspect et les caractères culturaux de l’espèce en essai sur les différents milieux, nous avons fait usage des procédés employés par RENON. Des cultures ont été effectuées sur bouillon neutre, solution de peptone, gélose et gélatine, puis sur liquide de Raulin acide, pomme de terre, pomme de terre glycérinée solide, milieu de Sabouraud. Sur tous ces milieux il nous

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a été donné de vérifier les observations de RENON. Nous n’insisterons pas ici sur la forme et l’aspect de chaque culture; mentionnons seulement que les cultures les plus luxuriantes se développent sur milieu de Raulin glycériné, pomme de terre glycérinée et milieu de Sabouraud. Klles forment d’abord un tapis blanc, brillant qui verdit peu à peu pour devenir gris fuligineux et brun noirâtre au bout de 5 à 6 jours. Cette teinte est due à la grande abondance des appareils conidiens; plus le milieu est favorable, plus longtemps dure l’évolution du blanc brillant au brun noirâtre. Le stroma est en général assez compact et d’une couleur jaune foncé; la coloration des spores varie avec les milieux employés : d’un blanc brillant sur milieu acide, elle devient verdâtre souvent seulement après 15 à 18 jours sur milieu liquide acide, tandis que sur milieu solide acide ce changement s’effectue déjà entre le quatrième et le septième jour. Sur les milieux alcalins la coloration brun noirâtre apparaît très vite; sur milieu neutre la culture prend la coloration gris fuligineux, aspect fumée si caractéristique pour l’Aspergrllus fumigatus.

Ayant ainsi déterminé avec certitude l'identité de notre souche d’Aspergillus provenant de la mycothèque du Laboratoire de Cryptogamie de la Faculté, nous nous sommes proposés de rendre cet échantillon de nouveau pathogène, car la virulence et la toxicité étaient fortement diminuées par les repiquages et les cultures successives sur les milieux usuels de conservation. A cet effet nous avons ensemencé cette espèce au fur et à mesure sur des milieux de plus en plus favorables en partant du milieu de pomme de terre et en continuant par les milieux de pomme de terre glycérinée, Raulin neutre et solide, Raulin acide liquide, Raulin glycériné acide et enfin milieu de Sabouraud. Sur chaque substrat le champignon se développait pendant six jours à 370. Nous avons ainsi obtenu un échantillon très vigoureux d’un aspect blanc brillant très luxuriant. Cette race jeune a été rendue alors virulente par passages successifs d’animal à animal. Pour cela nous avons eu recours à la contamination par inoculation souscutanée ou intrapéritonéale et par respiration et ingestion de nourriture couverte de spores d’Aspergillus. Nos inoculations ont toujours été faites au moyen d’émulsions de spores dans du sérum physiologique. T,a numération des spores a été effectuée par nous au moyen du compte-globules de Malassez. Ainsi nous avons toujours opéré avec des concentrations constantes, limitées entre 4.000.000 et 5.000.000 de spores par centimètre cube. Les pigeons ont été inoculés dans la veine axillaire avec 1 centimetre cube d’émulsion; les cobayes soit sous la peau dans Ja région poststomacale avec 5 cc. soit dans le péritoine avec 2 ce. ou dans le cœur avec 0,2 cc. d’émulsion.

Première expérience :

Un cobaye est inoculé sous la peau avec une émulsion de spores d’Aspergillus fumigatus de concentration donnée provenant de la culture vigoureuse du milieu de Sabouraud. Le troisième

jour après l’inoculation il s’est formé au niveau de la piqûre un petit abcès purulent dur au toucher. I/animal ne présenta à part cela aucun des symptômes caractéristiques de l’infection aspergilienne. Nous avons done jugé propice d’inciser cet abcès avec toutes les précautions habituelles d’asepsie; nous avons prélevé à l’aide de l’ensemenceur une trace de pus que nous avons ensemencé sur Raulin glycériné acide. Après deux jours de séjour à létuve à + 37° nous obtenons déjà des cultures luxuriantes et l'examen des caractères morphologiques et culturaux nous certifia la pureté et l'identité de l’Aspergillus fumigatus FRESENIUS.

Deuxième expérience :

Nous avons ensuite pratiqué avec des émulsions de cette souche une inoculation intraveineuse à un pigeon. I/animal a manifesté pendant les premières heures quelques battements d’ailes, un peu de tristesse, pendant deux jours il manque d’appétit et boit beaucoup, mais aucun autre symptôme d'infection ne se présente. Le cinquième jour après l’inoculation nous avons alors fait ingérer au pigeon des graines contaminées au préalable par des spores de notre souche vigoureuse. Pendant 8 jours l’animal suit ce régime; il devient alors paresseux, se blottit dans un coin de la cage et présente des tremblements nerveux. La marche de la maladie s’accentue alors journellement et dix jours plus tard le pigeon meurt. À l’autopsie les poumons présentent des cavernes purulentes et des nodules caractéristiques de la pseudotuberculose aspergilienne. Les autres organes sont indemnes. Des fragments de poumons malades ensemencés sur Raulin glycériné acide font naître l’Aspergillus fumigatus pur au bout de trois jours.

Troisième expérience :

Partant alors des souches virulentes ainsi obtenues, nous avons inoculé un cobaye sous la peau suivant la technique indi-

Courbe de poids du cobaye de la 3€ expérience, du 1e au 10€ jour

quée. I/animal est nourri au moyen d’herbes fraîches, de foin, de carottes et de lait. La pesée est effectuée journellement; nous donnons ci-dessus la courbe de poids. (Fig. 1).

Le dixième jour après l’inoculation, lanimal ne montrant pas de symptômes caractéristiques de l'infection aspergilienne, nous avons encore eu recours à la contamination par voie respiratoire. Le cobaye est nourri pendant quatre Jours successifs au moyen de pommes de terre coupées en morceaux cylindriques de 6 cm. de longueur sur 1 cm. de diamètre couvertes de spores virulentes pour le pigeon. Ces pommes de terre sont délayées dans du lait. I’animal présente à partir du quatrième jour de ce régime les symptômes suivants : il est paresseux, fatigué, très nerveux, il présente des mouvements impulsifs et peu d’appétit; le poids commence à baisser. À partir de ce moment, l’ingestion de spores est interrompue et le cobaye est mis à un régime très nourrissant. Ci-dessous la courbe de poids à partir du douzième jour de l’inoculation, donc le premier jour de l’ingestion de spores : (Fig. 2).

poids en grammes

Fig. 2

Courbe de poids du cobaye de la 3° expérience du 12e au 25€ jour.

Quinze jours après le commencement de ce régime le cobaye a diminué de 180 grammes. Nous avons jugé propice de le sacrifier. L’autopsie révèle la présence de lésions ulcérées au début de l’intestin grèle avec purulence, d’autres au niveau du caecum et dans le foie. Ces lésions ont environ 5 millimètres de diamètre, elles sont jaune verdâtre. Nous constatons en outre quelques adhérences de la plèvre, le foie est congestionné, le cœur est hypertrophié, le péricarde et l’estomac très gonflés. Celui-ci renferme des débris alimentaires non digérés, provenant d’un repas absorbé 7 à 8 heures auparavant, une des ulcérations de l’intestin correspond à une zone auréolée purulente de la peau, concentrique précisément au point de l’inoculation sous-cutanée. Nous avons procédé à 12 culture de pus provenant d’ulcérations intestinales, hépatiques et de contenu stomacal sur milieu de Sabouraud. Après 15 jours

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de séjour à l’étuve à + 370 nous avions des cultures luxuriantes et pures d’Aspergillus fumigatus sur les milieux ensemencés avec le pus intestinal et hépatique. Lee troisième nous donna de minces filaments avec une riche flore bactérienne et cryptogamique, dont l’oïdium lactis forme la plus grande partie.

Quatrième expérience :

Au moyen de ces cultures pures nous avons inoculé un pigeon dans la veine axillaire avec une émulsion de concentration indiquée. Le pigeon offre tous les caractères de l'infection aspergilienne avec issue fatale le quinzième jour. À l’autopsie nous avons mis en évidence les lésions typiques d’une pseudotuberculose généralisée. Les ensemencements pratiqués avec le pus provenant de ces lésions sur les divers milieux ont toujours produit des cultures qui microscopiquement et macroscopiquement répondaient aux conditions définies par RENON pour l’Aspergillus fumigatus FRESENIUS.

Cinquième et sixième expériences :

Des inoculations intrapéritonéales et intracardiaques au cobaye ont été enfin faites afin d’examiner l’anatomie pathologique de l’aspergillose provenant de l'introduction de l’agent pathogène dans la grande et la petite circulation. Ces expériences nous ont prouvé d’un côté l’exactitude des faits constatés par RENON, c’est-à-dire que le cobaye est un animal très peu réceptif pour l’aspergillose. Les symptômes de l’infection ont toujours apparu du deuxième au cinquième jour après l’inoculation. I/animal entre alors en voie de convalescence et au bout du quinzième au vingtième jour tout symptôme d’infection a disparu et les cobayes reviennent à leur poids initial. Nous allons néanmoins reparler de ces expériences dans un chapitre ultérieur pour montrer la différence entre la souche pathogène non irradiée et la souche irradiée et nous aurons alors l’occasion de revenir sur la dissemblance entre nos résultats et ceux de RENON.

Sephième expérience :

Un lapin de 2 kg. 580 grammes était inoculé par voie intrapéritonéale avec 5 cc. d’émulsion de concentration connue et issue de la souche pathogène pour le pigeon. Le lapin offrait pendant la période du deuxième au cinquième jour des symptômes caractéristiques de la mycose aspergilienne. Le cinquième jour il avait maïigri de 250 grammes; le huitième jour il avait perdu 530 grammes et l’issue fatale survient au bout du douzième jour. L'autopsie montre une pseudotuberculose généralisée dans tous les viscères, mais surtout dans les reins. Un fragment de rein fut ensemencé sur le milieu de Sabouraud; trois jours après nous constations la présence de l’Aspergillus fumigatus FRESENIUS.

Après les résultats que nous venons d’exposer qui viennent terminer notre expérimentation au point de vue du pouvoir pathogène de l’organisme étudié, nous pouvons conclure que notre espèce est devenue d’une extrême virulence. Avec elle nous allons poursuivre maintenant nos recherches sur l’action du radium.

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