ANALYSE DE LA LIPASE PURE « ACTIVÉE
Pour déterminer le carbone, nous avons eu recours à la méthode de Niccoux, modifiée par Borvin (3). L'Azote a été évalué par Micro-Kjeldhal, et le Phosphore au moyen de la méthode de Posrernak (41).
Nous avons trouvé la composition centésimale suivante :
Echantillon 1
CARBONE LARMES — 45,80 p. 100.
AZOTES NAME ME CR — 7,64 p. 100.
PHOSPHORE . ...... SRONE EAU
CARBONE EME — 48,20 p. 100.
AZOTE RUE AN EME AND ALOU PHOSPHORE . ...... —110;09#p) 100!
Ces résultats se rapprochent de ceux des auteurs allemands en ce qui concerne le carbone, mais s’en éloignent franchement pour les autres éléments.
Wizzsrarrer et Wazpscampr-Lerrz ont trouvé la composition suivante :
Analyse de la crème brute desséchée
CARBONE LRU —50;75:p.-100:
NAODE D A RU AEINER Aloe DM 00/ PHOSPHORE st D D D O0"
Analyse de la préparation purifiée
CARBONE AN. RES =\ 50,73 p. 100:
AZOTE SC RSR — 14,73 p. 100.
PHOSPHÔREN EEE las LépeslUO!
Ces résultats discordants ne doivent pas étonner, les produits analysés étant extrêmement différents.
Ar TES
Peut-on comparer la « crème-enzyme brute », qui renferme des corps gras et des débris de parois cellulaires, à la préparation purifiée ?
Pour purifier la lipase extraite de la « crème-enzyme », ces auteurs. ont eu recours à des mélanges alcalins ou acides. Ils sont parvenus à détacher du support colloïdal de l'enzyme quelques groupeménts protéiques, mais au préjudice de F’activité du ferment.
Ils reconnaissent d'ailleurs :«« qu'une purification « avancée, qui à pu dans un exemple, faire monter « la concentration enzymatique, peut être obtenue « par l’action des réactifs aqueux dissolvants des albu- « mines. Telles les solutions suivantes :
« Carbonate de soude à 0 gr. 7 p. 100 ; Potasse à « 0 gr. 50 p. 100; Acide chlorhydrique à 0 gr. 5 p. 100. »
On comprend aisément qu'une analyse portant sur un produit ainsi traité peut varier d’un échantillon à LCantré-
L'analyse élémentaire, qui fait penser à la composition centésimale de beaucoup d’albumines, n'éclaircit point la constitution du ferment.
Notre attention a toujours été attirée par le pouvoir émulsionnant très grand du ferment de la graine de Ricin. Cette remarque, faite d’ailleurs par d'autres auteurs, en particulier par J. LemarcHaNDs (30), nous a conduit à rechercher si le cytoplasme ne renfermerait pas un corps du groupe des Saponines. :
Pour vérifier cette hypothèse, nous avons porté à l'ébullition pendant une demi-heure, dans un appareil
er per
muni d’un réfrigérant à reflux, 1 gramme de cytoplasme mis en suspension dans 100 cm° d’acide chlorhydrique normal. |
50 cmÿ de ce liquide, centrifugés pour éliminer les parties non dissoutes, ont été neutralisés avec de à lessive de soude diluée au dixième.
Le liquide neutralisé était doué de pouvoir réducteur et un dosage pratiqué selon la méthode de Bertrand nous a révélé la présence d’un sucre réducteur, qui, exprimé en glucose, atteignait 7 p. 100 de la prise d'essai. |
Ce corps réducteur donnait après purification une osazone présentant les caractères de solubilité et le : point de fusion de la glucosazone.
Les points de fusion, pris au Bloc de Maquenne pour trois osazones provenant d'échantillons différents, ont été respectivement :
EcHanTILLON À : F — 228°.
— BP ="237 — CHF 212827
Outre le point de fusion, ces osazones s’identifiaient à la glucosazone par leur insolubilité dans l’eau, dans l'alcool méthylique et dans l’acétone étendue de son volume d’eau.
De cette expérience on peut conclure que l’hydrolyse acide détache du cytoplasme un sucre réducteur présentant les caractères analytiques du glucose.
Nous avons pris soin d'opérer sur un produit pur. Toutes les filtrations furent pratiquées sur filtre poreux d’Iéna, pour éliminer la cause d’erreur qu'entraînerait la présence de papier dans le produit.
Les 50 cm mis à part et provenant de l’hydrolyse acide ont été, après centrifugation, placés dans une ampoule à décantation et agités à plusieurs reprises avec de l’éther. Après décantation du liquide acide, l’éther a été lavé à l’eau distillée. Enfin, la solution éthérée a été mise à évaporer dans une capsule où elle a abandonné un résidu qui a été repris par l'alcool absolu.
Après évaporation de l’alcool, on a obtenu un résidu à peu près incolore donnant avec l’acide sulfurique une coloration rose virant au rouge violet. A chaud, la teinte finale était immédiatement atteinte.
Ce résidu a été dissous dans le chloroforme, auquel on à ajouté moitié de son volume d'acide sulfurique, après agitation avec la solution chloroformique l'acide s’est coloré en rouge.
La réaction de LIBERMANN pratiquée sur le résidu a été peu intense.
Le résidu dissous dans l’alcool n’a pas précipité au contact d’une solution alcoolique de digitonine.
Les particules du cytoplasme non attaquées et qui ont été éliminées par centrifugation donnaient encore au contact de l’acide sulfurique concentré une coloration rose virant au rouge violacé.
L'’hydrolyse acide a donc libéré un sucre et un stérol.
En présence de ces résultats nous nous sommes demandé si le stérol que l’on obtenait n’était point le stérol inclus dans le cytoplasme et aisément labile.
Pour vérifier ce point, nous avons épuisé, pendant huit heures au Kumagawa, par l’alcooi absolu, une
prise d'’essai de cytoplasme voisine de 1 gramme. L'alcool évaporé à abandonné un faible résidu, noircissant au contact de l'acide sulfurique. Ce résidu était constitué par des acides gras. En revanche, le cytoplasme soumis à ce traitement donnait encore une ‘coloration rouge en présence de l’acide sulfurique concentré.
Ces essais nous permettent de conclure à la présence d’un corps du groupe des saponines, très solidement lié au cytoplasme.
Lu IT
Nous avons ensuite tenté de séparer ce corps de son support protéique. Nous avons opéré de la façon suivante :
1 gr. de cytoplasme était dissous dans 90 cm° de soude normale froide. Après centrifugation pour éliminer les parcelles insolubles, la solution ainsi obtenue était acidulée par l'acide acétique dilué au dixième. On laissait au repos 24 heures. On avait, d’une part une liqueur légèrement acide, d'autre part un précipité protéique.
La liqueur acide, neutralisée, puis acidifiée par l'acide chlorhydrique, a été soumise à une hydrolyse d'une demi-heure. Nous avons décelé dans le liquide d’hydrolyse des traces de stérol.
Le précipité de nucléoprotéides soumis également à l’hydrolyse acide à fourni un liquide contenant un stérol et un sucre identifiable au glucose.
Cette expérience prouve combien le composé de nature glucosidique adhère au substratum protéique.
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Nr
D'après ces expériences, on peut supposer que le cytoplasme retient très énergiquement un composé de nature glucosidique s’apparentant par ses réactions aux corps du groupe des saponines.
La présence d'une saponine dans le ferment du Ricin n'implique pas que le même corps existe chez les autres Phytoestérases ; en effet, le pouvoir émulsionnant de la lipase de la graine de Ricin ne se rencontre qu'à un degré bien moindre chez les autres lipases.
Nous avons observé, en accord avec M. LEmaAR- CHANDS. que la lipase de la graine de Soleil (Helianthus annuus) est douée d’un pouvoir émulsionnant bien moindre, ce qui a d’ailleurs pour corollaire une action saponifiante plus faible. Tous les auteurs sont unanimes à accorder à la lipase de la graine de Ricin un pouvoir émulsionnant et saponifiant bien supérieur à celle des autres graines. Il semble logique d’attribuer cette différence à la présence de cette saponine.
Dans l’action hydrolysante du ferment de Ricin, doit-on considérer cette saponine comme l'agent causal ou bien comme un adjuvant ? Il semble difficile de se prononcer tant est grande l’adhérence de ce composé aux éléments protéiques qui l’accompagnent.
A Hs À
Conciusions
Continuant les recherches antérieures de Maurice Niccoux, et de Albert Morez et Léon VELLUz, sur l'extraction et la détermination de la nature du ferment saponifiant-synthétisant de la graine de Ricin, nous avons pu établir les points suivants :
I. — Il est possible, en employant pour la séparation par différence de densité du cytoplasme d’avec les autres constituants de la graine décortiquée l’acétate d’éthyle, d'obtenir un cytoplasme rigoureusement exempt de grains d’aleurone.
IL. — Le cytoplasme ainsi obtenu par centrifugation au sein de ce liquide, activé par contact avec l’acide acétique décinormal pendant vingt minutes à 37°, possède une haute activité fermentaire réversible (saponification-synthèse).
III. —— Le ferment ainsi activé soumis à la microanalyse organique volumétrique renferme :
en Carbone, de .... 43,2 à 45,8 p. 100 en Azote, de ...... 7,14 à 7,64 p. 100
en Phosphore, de .. 0,55 à 0,78 p. 100
suivant les échantillons et leur état de dessiccation, et donne les réactions générales des protides.
IV. —— Après dissolution dans la soude normale froide, filtration sur filtre en verre poreux, de façon à ce que soient éliminées toutes parcelles de cellulose, il donne par précipitation à l'acide’ acétique un coagulum, qui semble contenir une proportion importante de sucre réducteur (probablement, d’après l’étude faite, de la phénylosazone), du glucose ; un stérol caractérisé seulement par la coloration rouge donnée par l'acide sulfurique et une protide.
Si ces constatations se confirmaient sur de nombreuses préparations de ferment saponifiant-synthétisant de la graine de Ricin, que nous n'avons pas encore eu le temps d'obtenir, et si elles se compiétaient par celle d’un pouvoir hémolysant, elles permettraient de concevoir cet agent comme résultant de la conjugaison d’une saponine et d’une protide rendant la première insoluble par fixation sur la seconde.
Vu : LE PRÉSIDENT DE LA THÈSE, Le Doyen, MOREL.
JEAN LEPINE.
Vu et permis d'imprimer Lyon, le {8 Janvier 1932.
Le RecrEUR, PRÉSIDENT pu CoxsEIL DE L'UNIVERSITÉ, A. LIRONDELLE
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