HISTORIQUE

La littérature scientifique n'abonde pas de travaux sut la nature et les proportions des acides des végétaux. Seuls les fruits ont donné lieu à des recherches portant sur leur maturation et les évolutions biologiques qui en découlent; au cours de ces évolutions, l'apparition et la disparition des acides jouent un rôle important; létude des acides des feuilles, laboratoires où ils sont fabriqués, ne semble pas avoir intéressé les chercheurs, peut-être, comme nous le verrons, parce que les résultats trouvés par la méthode classique de recherche de quelques acides bien définis ne donnaient pas satisfaction; les bilans, dans ces Cas I, n'étaient pas équilibrés. Parmi les fruits, le raisin et la pomme, par leur importance dans les industries du vin et de la Cidrerie, ont vu leur composition soigneusement détaillée; les autres, tels les poires, les pêches, les prunes, ont donné lieu à quelques travaux; certains fruits ont été laissés de côté.

GERBER |3|, en 1897, s’est surtout intéressé à l’origine des acides des fruits d’une façon générale. II à montré qu'ils semblent être partiellement utilisés à la formation des hydrates de Carbone.

En 1901, TRUCHON et MARTIN CLAUDE |4] trouvent de l'acide tartrique dans les prunes.

Quelques années plus tard, en 1908, CHAUVIN, JouzLN et CANU

5], par contre, ne trouvent que de l'acide citrique et sont en contradiction avec les travaux précédents.

MUTTELET [6], en 1909, étudie l'acidité des jus de fruits. Il montre que les cerises contiennent uniquement de acide malique (1,61 g pour 100 g de jus de la variété de Montmorency). Par contre, ne contiennent que de Pacide citrique, les fraises (1,18 g pour 100 g de jus), les framboises (2,12 g pour 100 g de jus), les groseilles (2,08 g pour 100 g de jus), les cassis (3,50 g pour 100 g de jus). Ces derniers contiendraient également des traces non dosables d'acide tartrique. Cet auteur veut montrer par cette étude que lacidité totale n’est pas suffisante, mais qu'il faut établir la nature de cette acidité, par la détermination des acides qui la provoquent.

La même année, KuNz et ApaM [7] étudient les acides organiques des pêches. Ils trouvent que Pacide citrique constitue seul lPacidité.

En 1915, DEmoussy [8] montre que chez les végétaux les substances simples comme les acides sont localisées dans des cellules spéciales; les liquides d'écoulement par pression successive ont des acidités variables ; lPauteur exprime toutes ces acidités en acide malique.

En 1916, BARAGIOLA |9] fait des travaux sur l’acidité des poires et des pommes. Poursuivis en 1917, en collaboration avec KLÉBER [10], il note seulement la présence d'acide malique dans ces fruits. Dans ses travaux sur les cidres et les poirés suisses, il ne mentionne pas lPacide citrique et affirme qu’il l’a recherché en vain.

La même année BIGuELOW et DumBaR [12] recherchent les acides organiques des pêches et des prunes. Dans ces fruits ils mettent en évidence uniquement de Pacide malique.

MaGxEsS [11], en 1920, a observé que lacidité des poires était sujette à des variations importantes, sans définir la nature de cette acidité.

MurteLer |[6/}, dans de nombreux travaux, en 1922, étudie les acides des fruits à confitures. Dans ies prunes il montre la présence exclusive d’acide malique. Par

contre, les pêches contiendraient de l'acide malique et de l'acide citrique. Il y aurait une fois et demi plus d'acide citrique que d’acide malique.

MAGxEss et DIEHL, [13] poursuivant leur étude sur lPacidité des fruits, montrent qu’au cours de la maturation il y a chute de l'acidité. Ils confirment les travaux plus anciens de BIGUELOW, GORE et HowaRrD [14], BRowN {15}, FRÉMY [16] et COUVERCHEL [17].

Pour ARCHOLD [18], la teneur en acides libres croît progressivement dans la jeune pomme en cours de développement ; ceci est en accord avec les travaux de GIRARD el LiNDET [19], qui avaient montré que le même phénomène se produisait dans la baie de raisin.

Par la suite, NELSON [20] estime que lacidité totale correspond dans la fraise à de l'acide citrique (90 p. 100) et à de l'acide malique (10 p. 100), dans les framboises rouges à 97 p. 100 d’acide citrique et à 3 p. 100 d’acide malique, dans lananas aux mêmes acides dans les proportions de 87 contre 13. Par contre, dans la pêche, les acides malique et citrique seraient en quantité à peu près égales. Cet auteur a trouvé également de l'acide isocitrique dans la mûre de ronce.

À la même époque, FRANZIN et HELWERT [21] signalent dans un moût de pommes, à côté de l’acide malique, les acides citrique, lactique et succinique.

Un peu plus tard, en 1928, WaARCOLLIER [22] indique uniquement de l’acide malique dans les pommes à cidre françaises, de même que dans les poires.

NIETHAMMER |23] trouve dans les groseilles à maquereau non mûres, de l’acide succinique. Il indique également l'existence d'acide oxalique libre dans des fruits peu connus, balimbas et caramboles; cet acide serait (très fréquent sous forme d’oxalates, particulièrement d’oxalate de calcium, surtout dans les fruits jeunes. Il se raréfierait au cours de la maturation.

PEYNAUD [1], en 1946, publia des résultats très précis

sur l’acidité des jus de raisins, la nature des acides et leurs proportions respectives. Cet auteur mit au point les méthodes classiques de dosage des divers acides, en parüiculier les acides tartrique, citrique et malique. D’après lui, il n'existait pas de dosages précis, obtenus à l’aide de méthodes directes et spécifiques, présentés sous forme de bilans acidimétriques montrant que tous les acides ont été dosés, qui portent sur les différents acides aux divers stades de l’évolution. Il établit de tels bilans. Mais :l s'occupe uniquement de la maturation du fruit, et néglige la période de grossissement de la baie et de formation des acides organiques. Il indique ses résultats sous forme de bilans acidimétriques et de bilans physicochimiques, qui donnent le pourcentage des fonctions libres et neutralisées de chacun des acides organiques. L'écart des bilans ne dépassant pas 5 p. 100 et étant donné, d’après l’auteur, l'exactitude des techniques de dosage, on peut admettre que les acides tartrique, citrique et malique représentent la totalité des acides présents. D’ailleurs, la recherche directe ne lui a pas permis de caractériser les acides oxalique, succinique, glycolique cet glyoxylique. D’après l’auteur, certains pourraient contenir de petites quantités d’acide succinique.

Les acides viendraient de la feuille où ils sont élaborés et partiellement salifiés, migreraient vers le grain en solution diluée. Is subiraient une combustion par le ferment respiratoire des cellules du raisin. L’acide tartrique varie peu ; il diminue seulement en période de sécheresse et de grande chaleur. L’acide citrique, qui n’existe qu’à petites doses, varie peu ; il est particulièrement résistant aux ferments respiratoires ; c’est l’acide malique qui est essentiellement brûlé au cours de la maturation. Chez le Malbec, par exemple, il passe de 337 méq à la véraison, à 72,6 méq par litre de jus à maturité. Chez le Sémillon, la chute va de 218 méq à 16,9 méq par litre de jus. Dans les derniers Jours de la maturation, la variation est faible ; l'apport compense

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à ce moment-là la combustion. L’auteur constate cependant que les caractéristiques de composition sont déjà inscrites dans le fruit au moment de la véraison, et que c’est d’abord dans les feuilles, laboratoires d’élaboration des matériaux, qu’existe déjà la distinction entre Îles cépages, beaucoup plus peut-être que dans la baie de raisin où une partie seulement des matériaux est consommée.

Parallèlement à ces importants travaux, M" GATET [24] a étudié, en utilisant les méthodes de PEYNAUD, l’évolution des acides organiques dans les baies de raisin d’autres provenances. En 1936, elle trouve dans les raisins de la région de Cognac, exclusivement les acides tartrique, malique et citrique. Au cours de la maturation des fruits, il y a diminution de l'acidité de titration et diminution de l'acide malique. L’acide tartrique est à peu près constant, sauf en période de sécheresse où il diminue. Cependant, M GATET note un déficit important dans le bilan des acides. L'auteur pense, sans le montrer, qu’on peut envisager la présence d’acide succinique. Le même déficit se retrouve lors de l’étude des acides organiques des raisins du Cher.

GENEVOIS et PEYNAUD [2], poursuivant leurs travaux sur la composition chimique des fruits, montrent dans les pêches la présence des acides malique, citrique et pectique. D’une façon générale, l’acide malique est plus abondant que l'acide citrique. C’est ainsi que des pêches May Flower renferment 53 méq d’acide malique et 43 méq d'acide citrique par litre de Jus. Cependant, la technique des bilans montre la présence de 53 méq d’acides indosés ; l'absence des acides lactique, acétique, succinique, oxalique, glvcolique, glyvoxylique, aurait été vérifiée par les auteurs. Ceci les amènent à penser qu'ils se trouvent en présence de corps tels que les acides aconitique, «à cétoglutarique, isocitrique et oxycitrique. Plus tard, ils appliquent leurs techniques à la détermination des acides des prunes ; la méthode

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des bilans leur permet de se rendre compte qu’il existe des acides qui n’ont pas été déterminés. Dans ces fruits, c’est l'acide malique qui prédomine avec un pourcentage de 90 à 95 p. 100 des acides totaux ; l'acide citrique est le plus souvent à un taux faible et inférieur à 10 p. 100. Les prunes Reine-Claude hâtives, cueillies le 22 juillet 1948, renferment 232 méq par litre de jus d'acide malique ; l’auteur aurait trouvé également 1,1 méq d'acide citrique, mais 66 méq par litre de jus sont indosés. Quantitativement, ces constituants peuvent varier entre des extrêmes fort éloignés.

TAVERNIER et JACQUIN |[25|, dans les mêmes années, ont utilisé les méthodes de dosage mises au point par PEY- NAUD pour étudier les acides organiques des pommes et des poires. Ils trouvent, dans les pommes, de lacide malique en grande quantité, accompagné de petites quanlités des acides citrique, lactique, succinique. Les pommes Me Intosh renferment 53 méq d’acide malique par litre de jus, 2,3 méq d’acide citrique, 1 méq d’acide lactique et moins de 0,5 méq d’acide succinique. Au cours de la maturation, l'acide malique diminue par combustion ; les autres acides sont constants. Les bilans acidimétriques montrent que tous les acides ont été dosés. Les poires renferment de lacide malique et de lPacide citrique, mais suivant la variété étudiée, la composition est sujette à de grandes fluctuations. C’est ainsi que les poires chenevrières contiennent 96,5 méq d’acide malique et 1,9 méq d'acide citrique par litre de jus, alors que Îles poires Muscadet renferment 49 méq d'acide malique contre 104 méq d’acide citrique par litre de jus. Là aussi les bilans donnent satisfaction aux auteurs.

Enfin, divers autres acides ont été trouvés d’une façon très sporadique. Nous devons signaler par exemple Pacide salicylique qui existerait en très petites quantités dans la fraise, d’après WiNTON |26 |, dans le jus de groseilles, dans le jus de prunes et de cerises, d’après LaAvoLrAY et PATRON [27]. Enfin, de l'acide glvoxylique existerait dans

le raisin vert, d’après SEMICHON et FLANZY [29] ; il permettrait de déterminer l'indice de maturité.

La diversité des travaux, la discordance des résultats trouvés et surtout le manque de précision et de spécificite des méthodes employées, sauf peut-être pour les travaux récents, nous ont conduit à reprendre cette question avec des techniques nouvelles, sûres et sensibles.

Dans ces techniques, nous distinguerons deux stades. Pour les besoins de lexposition, nous étudierons tout d’abord le deuxième stade de la méthode qui est la chromatographie de solutions pures d'acides organiques.

Nous verrons ensuite le premier stade, qui consiste à transformer les organes végétaux, feuilles et fruits, milieux biologiques très complexes, en solutions propres à la chromatographie des acides organiques.

TECHNIQUE CHROMATOGRAPHIQUE DE CARACTÉRISATION ET DE DOSAGE DES ACIDES ORGANIQUES EN SOLUTIONS PURES

Le dosage des acides organiques par les méthodes chimiques classiques a longtemps été imparfait. Ces méthodes ont l’inconvénient d’être longues et de ne s’appliquer, dans une solution donnée, qu’à un acide bien défini. PEYNAUD [1] reconnaît que les anciennes méthodes au bitartrate pour le dosage de l'acide tartrique ne sont ni exactes ni spécifiques et doivent être abandonnées. Il les a étudiées, modifiées, améliorées. Elles n’en restent pas moins très longues et très délicates. De plus, si elles permettent de doser dans une solution un acide que l’on soupçonne, elles ne permettent pas d’y découvrir un acide ignoré. Il en résulte que pour s’assurer que tous les constituants acides ont été dosés, il faut recourir au procédé des bilans acidimétriques. Ces bilans, ou balance des anions et des cations, consistent à déterminer d’une part la somme des anions de la solution et, d’autre part, la somme des cations. Si tous les acides ont été dosés, la somme des anions doit être égale à celle des cations. Ce procédé indirect ne permet pas de se faire une idée sur la nature des acides inconnus dans le cas où les sommes des anions et des cations sont différentes. De plus, les dosages des acides organiques sont sujets à certaines causes d'erreurs, de même que la détermination de l’alcalinité des cendres qui intervient dans la détermination

Eos

de la somme des cations. Il en résulte qu’on peut trouver une différence appréciable entre ces deux sommes, sans que pour cela il y ait un acide indosé, où au contraire les deux sommes peuvent paraître identiques alors qu’il existe un acide indosé en petite quantité.

Nous avons voulu revenir à un procédé rapide et simple de dosage des substances acides. Ce procédé doit nous permettre de déterminer directement, et d’un seul coup, l'existence de telle ou telle substance acide, et éventuellement d’en préciser la nature et la proportion. Si, comme nous le verrons, ce procédé ne possède pas une très grande sensibilité, les erreurs commises sont du moins inhérentes à chaque substance et sans répercussion les unes sur les autres.

ISHERWOOD |30]|, le premier, pensa à utiliser la chromatographie pour la séparation des acides organiques des fruits. Sa méthode consiste en une séparation par chromatographie sur gel de silice.-Les acides isolés sont ensuite dosés séparément, par des techniques simples. Cette technique fut appliquée à la pomme.

Récemment, BULEN, WAMER et BURREL [31] ont remis en honneur cette séparation sur gel de silice et Pont appliquée à l’étude des acides des fruits et des fleurs de Bryophillum.

Les travaux de Luc et OVERELL

32], suivis de ceux de CHEFTEL, MUNIER et MACHEBŒUF |33|, sur la caractérisation des acides organiques par chromatographie de partage sur papier nous ont permis de reprendre cette question sur un plan tout à fait nouveau.

SOLVANTS

De CHEFTEL, MUNIER ct MACHEBŒUF [33] nous avons utilisé les deux solvants suivants que nous avons dénommés Solvant 1 et Solvant 2.

Butanolprimairers/r##, 9 volumes Solvant 1 Benzoate de méthyle ...... 1 — Acide lOFHTIQUE at Le 45 —

PIC DANONE. een 1 volume Solvant 2 AUCALYDIOLR RTS. ENT. 1 | ACID FOPDTIQUES. Ar Me. 2/5 —