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tion des liquides de culture ; un troisième s’arrêtant à mi-hauteur, et de gros calibre, sert à l’ensemencement ; le quatrième enfin est relié à une poire destinée à établir une suppression pour évacuer le liquide de la fiole,
Un tel dispositif, ingénieux et commode, pour des recherches qualitatives que lui demandait LUTZ, se prête difficilement à des recherches quantitatives et en série pour lesquelles je voulais l’utiliser : chaque fiole exige pour sa manipulation un support spécial ; l'introduction d’un volume exact de milieu d'étude, et surtout sa récupération totale sont assez compliquées.
Bien plus tard, d’autres auteurs : KOSTYCHEW et TSWETKOvA (1921). BERNHAUER (1928), TamyaA (1928), ont également utilisé cette méthode, mais avec des conditions expérimentales mal précisées ou trop compliquées.
Bien qu’elle exige encore un certain nombre de précautions, PBacH a le mérite de l’avoir rendue d’un emploi plus facile que ses prédécesseurs. J'ai, toutefois, apporté quelques légères modifications à la technique détaillée par cet auteur.
CONDUITE DES OPÉRATIONS a) Obtention du mycélium.
Je me suis servi comme vases à expériences de fioles d’Erlenmeyer en verre de Bohême, de 250 cc. de capacité : matériel moins encombrant pour le travail en série que les fioles à tubulure latérale décrites par l’auteur.
Le liquide de culture initial était réparti dans chaque fiole à la dose de 50 cc. Sa composition a varié avec chaque champignon. Mais d’une façon générale, il est nécessaire pour obtenir des voiles non gaufrés, d'employer des milieux plus dilués que les milieux usuels.
Après la stérilisation à l’autoclave dans les conditions indiquées on procède à l’ensemencement. Pour éviter les nombreux cas de culture négative, j’ai augmenté la quantité de spores et mélangé avec soin par agitation légère les spores avec le milieu de culture.
b) Soutirage du liquide de culture, et lavage du mycélium.
Le soutirage a été effectué à l’aide de l’appareil décrit par BacH et représenté fig. 1.
vers la trompe
Vase de Culture
FIGURE 1. — Appareil pour la décantation aseptique des liquides de culture
Il est constitué par une fiole de KITASATO en relation avec la trompe à eau ; elle porte un bouchon percé de deux trous : l’un reçoit un tube de verre (a) que l’on peut obturer par un tube en caoutchouc muni d’une pince ; dans l’autre passe un tube (b) en verre Pyrex courbé à angle aigu, et dont la pointe efhlée est légèrement recourbée.
Le tube (a) étant ouvert, on introduit, après l’avoir flambé, le tube (b) au fond de la fiole à expérience maintenue inclinée et dont le goulot a été également passé au feu ; on replace sur la fiole son bouchon de coton et on ferme le tube (a). Le liquide est ainsi retiré par aspiration. Après quelques minutes de repos on recommence l'opération.
On introduit alors sous le mycélium 50 ce. environ d’eau distillée stérile à l’aide de l’appareil suivant (fig. 2).
Un ballon (a), muni à sa partie inférieure d’une tubulure, constitue la réserve d’eau distillée. Sur la tubulure on adapte un tube de caoutchouc de 10 cm. environ, terminé par un tube en Pyrex, étiré à son extrémité et légèrement recourbé (b). Le tube en caoutchouc peut être obturé par une pince. Une clochette en verre (c) protège le col
de la fiole.
Vase de Culture
FIGURE 2. — Appareil distributeur d'eau distillée stérile
On fait quatre lavages identiques dans les 24 heures. Bacx a montré que dans ces conditions tout le glucose du milieu initial a disparu, et que les autres constituants du milieu ne restent plus qu’à l’état de traces.
c) Mise en place du milieu final.
Après un dernier égouttage, on remplace l’eau de lavage par le milieu sur lequel on veut faire réagir le champignon. L'appareil employé par BACH convient bien lorsqu’on n'utilise qu’un seul milieu ; mais il devenait peu commode pour mes expériences qui comportaient le plus souvent plusieurs milieux différents. Je l’ai remplacé par des pipettes stériles.
Toutes ces opérations longues à décrire, se font en réalité très facilement, et, avec un peu d’habitude, on arrive à ne pas submerger les voiles, ce qui les rendrait inutilisables.
Cr
HI. — Recherches sur la récolte et le milieu de culture A) Récolte du mycélium et du milieu après culture. 1) MÉTHODE DE CULTURE DIRECTE.
J'ai suivi en cela la technique de la plupart des expérimentateurs.
Après avoir prélevé lec. du milieu destiné à la détermination du pH. le liquide de culture, retiré par décantation est jeté sur deux filtres sans cendres équilibrés, disposés sur un entonnoir de JOULIE. Le mycélium est lavé par décantation d’abord dans la fiole puis sur le filtre jusqu’à un volume final de 100 cc.
Le mycélium restant sur le filtre est mis à dessécher à l’étuve à 100° pendant 24 heures et pesé à la balance de précision avec les précautions habituelles.
