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osmique, mélange recommandé par BoLLES LEE (74), et un liquide formol-picrique-acétique dont P. Bouin (29) et nous-mêmes (26) avons déjà antérieurement préconisé l'emploi (*).

Les meilleurs résultats pour l'étude que nous poursuivons ont été constatés après usage du liquide de FLEMMING en solution forte et du formol picro-acétique. Tous deux, quoique agissant quelque peu différemment pour tuer la matière vivante, ont parfaitement gardé les structures protoplasmiques sur lesquelles notre attention était spécialement attirée. Ils ont de plus l'avantage de permettre l'emploi subséquent de colorations propres à bien mettre en relief les formations ergastoplasmiques de la cellule.

Les fragments ainsi fixés ont été ensuite enrobés dans la paraffine, après passage dans le chloroforme ou

l'huile de cèdre purs, puis mélangés à la paraffine. Ils sont alors débités, à l'aide du mierotome construit par DUMAIGE, en coupes correspondant à deux ou trois divisions de la roue dentée.

Après collage sur lames à l'eau albumineuse très diluée selon les préceptes de P. MAYER, les coupes sont alors prêtes à être soumises aux différents procédés de coloration. |

L'emploi des réactifs colorants a nécessairement varié avec le mode de fixation des pièces. Nous en avons essayé un grand nombre, tant parmi les teintures acides

(1) Nous rappelons la formule de ce liquide ; il se compose de : Acide picrique, sol. aq. sat. . . . . . 430 parties. Formol (à 40 p. 109 d’aldéhyde). . . . 10, — Nonacétiquesiactai NT ALES y An

RAT RE que parmi les teintures basiques ; cependant nous ne signalerons que celles qui nous ont donné le plus de satisfaction au point de vue particulier où nous noüs placions.

Après usage du liquide osmio-chromo-acétique, nous avons surtout employé la triple coloration de FLEMMING (safranine, violet de gentiane et orange G) en évitant de trop enlever la teititure violette au moment de la décoloration finale. Nous avons également essayé la mé-

thode de BENDA à la safranine et au vert lumière, en

raccourcissant autant que possible le séjour des coupes dans le bain de safranine (cinq à dix minutes à chaud).

Le procédé à l’hématoxyline ferrique de MARTIN HEIDENHAIN, si favorable aux études cytologiques en général, à surtout été appliqué après action du liquide de BouIN au formol piero-acétique. Ce mélange favorise en effet d’une façon remarquable la coloration à l’aide des différentes hématoxylines et surtout de la laque ferrique de HEIDENHAIN. On obtient, de la sorte, une imprégnation des tissus en noir au moins aussi foncé que pour les pièces traitées par le sublimé salé, ce qui permet une différenciation assez lente, et partant plus précise, des divers organes de la cellule.

Comme colorants plasmatiques, nous avons usé de préférence de solutions aqueuses d’érythrosine, de méthyléosine où de vert lamière.

Enfin, il est un colorant que M. le Professeur PRE- NANT nous avait fortement engagé à utiliser, nous voulons parler du bleu de méthylène, où mieux encore, du bleu de toluidine. Ces couleurs employées avec succès dans ces dernières années par Niss’L, VAN GEHUCHTEN

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(75), A. Mann (76) et leurs élèves, pour démontrer la présence de particules chromatiques au milieu du cytoplasme de la cellule nerveuse, semblaient parfaitement convenir à notre genre de recherches, puisque nous avions aussi l'intention de mettre en évidence des éléments plus ou moins basophiles, au sein du protoplasme de la cellule glandulaire.

Le bleu de toluidine seul ou combiné avec un fond à l’éosine ou ses dérivés, méthyléosine où érythrosine, a complètement répondu à notre attente. Employé en solution aqueuse concentrée, 1l donne aux tissus fixés par le liquide de Bouix une coloration qui se porte avec une électivité remarquable sur le cytoplasme et plus particulièrement sur la partie du corps cellulaire que nous considérons comme de nature ergastoplasmique.

Le seul inconvénient de cette teinture consiste dans son peu de résistance lors du passage aux alcools.

Nous avons pensé tourner cette difficulté de la façon suivante : |

Les coupes fixées au formol picro-acétique sont d’abord soumises à l’action de lhématoxyline Delafield jusqu’à légère teinte violette. On enlève ensuite le plus gros de cette teinture à l'alcool additionné de quelques gouttes d'acide chlorhydrique, puis on lave plusieurs minutes à l’eau courante les coupes qui avaient quelque peu viré au rouge, jusqu'à ce qu'elles aient de nouveau bleui. On mordance légèrement à la teinture diode diluée, pendant quatre à cinq minutes, on lave à l’eau, et on fait alors agir la solution de bleu de toluidine jusqu’à ce que l’on arrive à une teinte violet foncé

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presque noirâtre des coupes. Cette surcoloration permet alors la différenciation régressive à l’alcool absolu ou à l’essence de girofles (cela dépend du degré de surcoloration, le bleu partant plus rapidement à essence). On arrive à la teinte voulue en surveillant la préparation de temps en temps au microscope; avec une certaine habitude, on juge même à l'œil nu, par l'aspect général de la coupe, du moment où l’on doit arrêter la décoloration en plongeant le porte-objet dans le xylol ou Île toluol.

Des tissus glandulaires traités de la sorte se présentent de la façon suivante : le noyau est bleu foncé, un peu violacé, les nucléoles étant le plus fortement colorés. Les travées du cytoplasme sont plus ou moins bleues, avec renforcement de la coloration au niveau de la portion basale. Les filaments basaux, les corps paranueléaires, toutes les formations que nous considérons comme représentant de l’ergastoplasme, ont pris plus vigoureusement la couleur, tandis que les grains de zymogène, lorsque la cellule en renferme, sont peu ou pas colorés. Le bleu de toluidine a de plus l’avantage bien connu de se fixer électivement et métachromatiquement sur les parties muqueuses de la sécrétion.

Les préparations colorées comme il précède s'opposent harmonieusement à celles traitées par la laque ferrique, surtout lorsque la décoloration de ces dernières a été poussée assez loin. Pour des cellules à grains par exemple, on peut arriver à ne garder en noir, dans le corps cellulaire, que le noyau dans son ensemble et les grains de zymogène, tandis que, après teinture au

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bleu de toluidine, en plus du noyau qui apparait nettement, on trouve que toute la charpente cytoplasmique a pris la couleur, à l'exclusion des grains arrivés à l'état de zymogène, c'est-à-dire prêts à ôtre excrétés.

On peut ainsi se procurer deux espèces de préparations, dont l’une est en quelque sorte le négatif de l'autre, et qui, par suite, sont éminemment démonstratives.

Il était tout naturel, après ces constatations, d’essayer de superposer les deux clichés, en combinant l’hématoxyline ferrique à la teinture au bleu de toluidine. C’est, en effet, ce que nous avons cherché à réaliser.

Dans ce but, sur des pièces traitées à l’hématoxyline ferrique, on pousse la décoloration assez loin pour que le cytoplasme apparaisse complètement pâle, teinté à peine au niveau des portions basales qui étaient imprégnées plus énergiquement. On se sert alors de la solution de bleu de toluidine pour faire apparaître le fond, avec où sans mordançage préalable à Piode. On extrait l'excès de couleur à l'alcool et on monte au baume comme à l'ordinaire.

Cette combinaison a l’avantage de réunir l’ensemble des détails de structure de la cellule en une mème image, en précisant d’une facon plus vigoureuse les parties les plus chromatophiles du contenu cellulaire, par suite de la superposition, à leur niveau des deux sortes de colorants employés. Les formations paranucléaires, les filaments basaux se détachent en bleu violacé plus ou moins foncé sur un champ d'un bleu pur

Lun semé cà et là de figures d’un noir d'encre qui représentent le zymogène et la chromatine nucléaire.

L'hématoxyline ferrique employée seule, et décolorée jusqu'à une limite suffisante pour faire apparaître les mèmes éléments avec une vigueur de teinte égale, est loin de fournir un aspect aussi précis, car, pour en arriver au même résultat, il faut se garder de faire agir trop longtemps la liqueur ferrique au moment de la différenciation, et le fond conserve une teinte d'un gris noirâtre qui nuit beaucoup à l'observation.

Dans le courant de ce travail, nos descriptions viseront donc surtout des glandes traitées par la méthode de FLEMMING, l’hématoxyline ferrique, et par le bleu de toluidine. |