CHAPITRE IX

a. Dissolution de l’albumine, de la fibrine, du gluten et liquéfaction de la gélatine.

b. Transformation du lait et dissolution de la caséine.

Dans un mémoire précédent, nous avons noté que beaucoup de micro-organismes dont nous avions étudié l’action sur un certain nombre de substances alimentaires, et parmi ceux-ci se trouvait le bacille mesentericus vulqatus, ne-se développaient pas, si on les ensemençait dans des ballons ne contenant que de l’eau et ces matières, aussi avions-nous dû remplacer l’eau par du bouillon étendu. A cette époque nous ne savions pas qu'il était nécessaire, pour que ce bacille se développât, qu'il eût à sa disposition une matière protéique soluble.

Dans les recherches, que je vais exposer dans ce chapitre, j'ai fait usage pour les mêmes raisons du bouillon étendu (bouillon de veau préparé avec la moitié de son poids de viande hachée, additionné de 1 pour 100 de peptone et étendu de trois volumes d’eau), j'ajoutais à ce bouillon assez de chlorure de sodium pour que sa teneur s'élevat à 0,50 pour 100 et assez de phosphate tribasique de potasse pour qu’il en contint 0,25 pour 100.

Pour étudier la dissolution de la fibrine du gluten et de l’albumine, j’ajoutais à chaque 100 grammes de bouillon faible 10 grammes d’albumine cuite (blanc d'œuf), ou 10 grammes de fibrine humide, ou 10 grammes de gluten pur ayant séjourné vingt-quatre heures dans l’eau froide.

Si on augmente la quantité de ces substances sans augmenter proportionnellement celle du bouillon, leur disso# lution ne se fait pas ou bien est considérablement ralentie.

Ces substances étaient introduites dans un ballon d’une capacité au moins double du volume du mélange, puis le tout était stérilisé à l’autoclave à 120°.

Albumine. — Dès le lendemain de l’ensemencement si la culture a été mise à l’étuve à 36°, on constate généralement à la surface du bouillon, une légère pellicule formée par les micro-organismes. L’albumine qui occupe le fond du ballon conserve sa couleur blanche. Le second jour, la membrane ou pellicule formée par les micro-organismes est plus épaisse, le bouillon, s’il était encore trouble la veille, est redevenu clair, l’albumine paraît être toujours intacte.

Il n’en est pas de même le troisième jour, la membrane à la surface est plus épaisse, souvent légèrement plissée et les cubes d'albumine sont transparents, généralement ils ne le sont pas en entier, mais seulement en partie, à leur centre se trouve un noyau d’albumine blanche, ils sont en mème temps légèrement gonflés, mais ce gonflement n’est que très peu marqué. Le bouillon est toujours clair.

Le quatrième jour, les cubes d’albumine sont gonflés et désagrégés en petits fragments qui occupent le fond du vase, ces fragments ont des angles mousses, il est fort difficile de dire si l’albumine est dissoute en partie, mais cela me paraît probable, en tout cas les jours suivants on la voit disparaître de plus en plus et le neuvième jour on n’en aperçoit plus la moindre trace.

En même temps le voile de la surface s’est brisé et les micro-organismes tombent dans le fond du vase où ils forment un dépôt assez abondant.

Le liquide lui-même a pris une teinte plus foncée, du reste comme le bouillon simple dans lequel le microorganisme aurait été cultivé.

Les phénomènes que je viens de décrire se sont passés dans un ballon, qui était resté au repos ; par conséquent, le micro-organisme n'avait d'oxygène qu’à la surface; de plus les micro-organismes étaient presque tous réunis à la surface du ballon, c’est-à-dire à environ 4 à 6 centimètres au dessus de l’albumine.

Je me suis demandé si les phénomènes se passeraient de la même façon si on facilitait l’accès de l’air dans la profondeur du liquide, et en mème temps si on rapprochait les micro-organismes de l’albumine. J'ai donc fait l'expérience suivante :

Le 29 février. Mis à l’étuve à 36°, deux ballons exactement

VicNaAL. — Bactériacées. 6

semblables contenant chacun 500 grammes de bouillon faible et 50 grammes d’albumine divisé en cubes.

Le 1% mars. Il existe un voile non plissé mais très net sur les deux, le liquide est presque clair.

L'un A est laissé au repos.

L'autre B est vivement agité pendant quelques minutes, de façon à briser la membrane, à la mêler au liquide et à aérer fortement celui-ci.

Le 2 mars. Le voile qui s'étend sur le liquide du ballon À a augmenté d'épaisseur, il est légèrement plissé. Le liquide est clair. L’albumine est transparente, sauf un noyau au centre de chaque cube.

Sur le liquide du ballon B s'étend un voile, celui-ci est mince, lisse. Le liquide est un peu trouble; l’albumine est transparente, sauf un noyau au centre généralement assez petit. On agite vivement le liquide comme la veille, et on constate que toute la partie transparente des cubes est désagrégée après l'agitation.

Le 3 mars. Le voile qui s'étend sur le liquide du ballon A commence à se dissocicer. Le liquide fonce sa couleur tout en restant clair. L’albumine est entièrement transparente, plusieurs cubes sont désagrégés.

Il n’y a pas de voile sur le ballon B, mais le liquide, dont la couleur est également plus foncée, est trouble ; dans le fond du ballon, on n’aperçoit que quelques rares fragments d’albumine transparente, et un dépôt blanchâtre dû aux micro-organismes.

Le 4 mars. Le voile qui s'étendait à la surface du liquide du ballon A est tombé dissocié dans le fond. L’albumine est divisée en petits fragments, elle paraît être dissoute dans ce liquide.

Dans le ballon B toute l’albumine est dissoute, on n’aperçoit dans le fond qu’un dépôt blanchâtre dû au microorganisme ; la couleur du liquide est aussi plus foncée que celle du ballon A.

Le 6 mars. L’albumine du ballon A est entièrement dissoute.

Cette expérience semble démontrer que l’accès de l’oxygène et le contact des micro-organismes paraissent activer la dissolution de l'albumine. Je me suis demandé si l'attaque

de l’albumine était due aux micro-organismes eux-mêmes ou à une diastase qu'ils sécrétaient. La seconde hypothèse me paraissait la plus probable, car nous avons vu (page 46) qu'ils ne veulent pas vivre sur l’albumine de l'œuf.

Sans parler desexpériences que j'ai faites sur les diastases que ce micro-organisme sécrète, sans que l’action vitale de Ja plante fût mise en jeu, je rapporterai ici quelques expériences, qui pourront nous aider à résoudre cette question.

Nous avons vu que lorsqu'on cultive ce micro-organisme . dans un vase haut de forme et avec une assez grande épaisseur de bouillon, les bacilles sont presque tous cantonnés à la surface du liquide, qu'il s’en trouve, au bout de vingt-quatre heures, très peu dans les couches inférieures. J'ai donc fait l'expérience suivante : j'ai pris deux éprouvettes ayant 35 centimètres de hauteur; dans l’une j'ai introduit assez de bouillon pour qu’il eüt une hauteur de 30 centimètres, dans l’autre une seulement de 10 et dans les deux j'ai mis trois cubes d’albumine aussi semblables que possible. J'ai ensemencé et mis à l’étuve les deux éprouvettes en même temps et j'ai observé que l’albumine devenait transparente, puis se dissolvait aussi rapidement dans l’un que dans l’autre; ce qui tend à démontrer que la dissolution de l’albumine est due à un produit sécrété par le bacille.

Pour être encore plus certain que c'était à un produit soluble, à une diastase que l’albumine devait sa transparence — je ne pouvais par ce procédé chercher sa dissolution, — j'ai enlevé le troisième jour un cube d’albumine du liquide de culture. Ce cube qui mesurait 1 centimètre de côté était transparent presque en entier, je l’ai placé dans de l'alcool à 60°, puis dans de l'alcool plus fort, jusqu’à l’alcool absolu; son durcissement ne me paraissant pas suffisant, je lai fait chauffer pendant deux ou trois heures, j'ai alors pratiqué sur lui des coupes de 1/200° de millimètre d'épaisseur et je les ai colorées par la méthode de Gram. L'examen microscopique de ces coupes qui fut fait avec le plus grand soin ne me décela aucun micro-organisme à leur intérieur; sur une ou deux je vis quelques rares bacilles à la surface, mais ce fut tout.

Il semble donc bien résulter de ces expériences que ce

bacille dissout l’albumine par l’action d’un produit soluble qu'il sécrète.

Lorsqu'on évapore le liquide dans lequel l'albumine a été dissoute par ce bacille, on perçoit au début une odeur ammoniacale très marquée; de plus le liquide rougit fortement le papier de tournesol, une baguette de verre trempée dans de l'acide chorhydrique et exposée au-dessus de la capsule émet des vapeurs blanchâtres. Il est donc probable que ce micro-organisme a transformé une partie de l’albumine en ammoniaque ou en une amine volatile; cela me paraît d'autant plus probable que des recherches récentes de M. Perdrix (1) ont récemment démontré que la matière azotée du bouillon, du sérum, de la caséine en présence de l'oxygène de l'air se transforme en ammoniaque dans les cultures de la bactéridie charbonneuse.

Je ne puis venir apporter comme M. Perdrix une preuve absolue à cette supposition, car pour le faire il faut des recherches de chimie délicates, et je n'ose les entreprendre.

Lorsque l'odeur d’ammoniaque a disparu et que le liquide commence à se concentrer, on perçoit une très forte odeur de colle forte. Le liquide évaporé jusqu'à sec laisse comme résidu une substance brune, se ramollissant par la chaleur, ayant une odeur de colle forte.

L'odeur ammoniacale est plus marquée, si au lieu de retirer le ballon de l’étuve aussitôt que l’albumine est dissoute, on l’y laisse encore pendant cinq ou six jours; en même temps le liquide, qui était d’un blond clair, se fonce de plus en plus jusqu à devenir d’un brun d'acajou clair.

Dissolution de la fibrine. — Ce que je viens de dire relativement à la dissolution de l'albumine s'applique exactement à la dissolution de la fibrine par ce micro-organisme, sauf que généralement la dissolution de la fibrine est un peu plus rapide, elle est dissoute au bout de cinq à six jours, au lieu de l'être en huit ou neuf. Ce qui tient sans doute à sa forme filamenteuse, qui offre de plus grandes surfaces que l’albumine divisée en cubes. Car si au lieu de mettre dans le bouillon des cubes d’albumine, on

(1) Perdrix, Sur la transformation des matières azotées dans les cultures de bactéridie charbonneuse, Annales de l’instilut Pasteur, n° 1, 1888, p.353.

la bat avec de l’eau, puis qu’on fasse tomber la solution d’albumine dans de l’eau bouillante de facon à l'obtenir coagulée en très petits morceaux, elle se dissout aussi rapidement que la fibrine.

Lorsque la dissolution de la fibrine est achevée, le liquide est généralement plus brun que le HAQISE a la dissolution de l’albumine.

Chauffé, ce liquide répand d’abord une odeur ammoniacale très franche, puis, lorsque celle-ci a disparu, une odeur se rapprochant de celle de la colle forte, mais en différant cependant.

Dissolution du gluten. — Nous avons vu plus haut que si on ensemençait sur du gluten le bacille mesentericus vulgatus, on n’obtenait que de pauvres et faibles cultures. Mais lorsqu'on le place dans un bouillon faible comme nous avons fait pour la fibrine et l’albumine, on obtient au contraire de très riches cultures et une dissolution rapide des fragments de gluten. Le gluten dont nous nous sommes servi était du gluten chimiquement pur, sous forme de fragments plats ; nous le ramollissions dans de l’eau froide pendant quelques heures, avant de l’introduire dans les bouillons en le divisant à l’aide de ciseaux en petits morceaux ayant environ À centimètre de côté.

Au bout de vingt-quatre heures, la surface du bouillon de culture est couverte d’un voile assez mince, et nullement plissé, le liquide est clair; vers les quarante-huit heures le voile est beaucoup plus épais, le bouillon n’est plus aussi clair qu'avant ; le troisième jour il est trouble, en même temps le voile est beaucoup plus épais et très plissé; il est probable qu’une partie de gluten est dissoute, mais il est difficile de l’affirmer. Si on examine un morceau de gluten, on voit que ses bords et sa surface sont d’un blanc erisâtre et qu'il s’en détache avec la plus grande facilité une légère couche.

Le quatrième jour le voile a encore augmenté d’épaisseur, il est plus ridé, il est incontestable qu’une partie du gluten est dissoute; le liquide est très trouble.

Les jours suivants, le voile se disloque et tombe au fond du ballon, le liquide reste trouble, et la dissolution du gluten est complète vers le huitième ou neuvième jour. Dans

le fond du ballon, il existe ur abondant dépôt pulvérulent formé en partie par les micro-organismes {spores et bâtonnets), et une matière sans forme définie. La couleur du liquide filtré est jaune acajou très marquée. Chauffé, il dégage une odeur d’ammoniaqne, puis, lorsque celle-ci à disparu, une odeur de pain frais.

Si on conserve le ballon à l’étuve, après que le gluten a disparu, la couleur du liquide se fonce de plus en plus, et en même temps, comme pour l’albumine et la fibrine, la quantité d'ammoniaque (?) paraît augmenter.

Liquéfaction de la gélatine. — Lorsque nous avons donné les caractères des cultures de ce micro-organisme, dans les milieux de cultures les plus usuels, nous avons vu qu'il liquéfiait la gélatine à la température de la chambre, et que cette liquéfaction était très rapide.

Si on place, je suppose, un ballon contenant 100 grammes de gélatine nutritive à l’étuve à 36°, et qu'on l'ait simplement ensemencé par piqüre, le lendemain, la surface de la gélatine est couverte d'un voile assez épais et commençant à se plisser; elle est légèrement trouble. Au bout de quarante heures, le voile est très épais, présente de nombreux plis, et est d'un blanc mat légèrement jaunâtre. Si on retire le ballon de l’étuve on constate que la gélatine, qui est complètement limpide, ne se solidifie qu'imparfaitement. Le troisième jour, le voile est encore plus épais, plus plissé, et légèrement plus jaune; la gélatine a perdu entièrement le pouvoir de se solidifier, elle est toujours limpide. Le quatrième jour, le voile commence à se dissocier, la gélatine est toujours claire ; le cinquième jour, le voile est tombé au fond du vase, et y forme un dépôt blanchatre; vers le sixième, pour aller en augmentant chaque jour, la gélatine se fonce en couleur, pour être, vers le dixième jour, très brune.

b. Transformation du lait.

Dans un mémoire précédent, j'ai déjà dit que le bacille mesentericus vulgatus sécrélait dans le lait plusieurs diastases agissant sur la caséine; l’une, une présure, coagule la caséine, et l’autre, une caséase, dissout la caséine.

Mais les expériences sur lesquelles je m’appuyais ayant été faites simplement pour connaître quels étaient les mi-

crobes de la bouche qui étaient capables de dissoudre les substances alimentaires, n'avaient pas été poussées aussi loin que je l’aurais voulu ; ici je vais exposer celles que j'ai faites depuis.

Le lait qui nous a servi pour les expériences que nous allons décrire était préparé de la façon suivante : pour lui enlever toute trace d’acidité, pour le neutraliser, ne voulant pas employer le carbonate de soude, qui le décolore un peu en agissant sur la caséine, je l’agitais fortement, pendant quelques instants, dans un flacon avec de la craie légivée, puis je le chauffais doucement, pendant une demiheure environ, en l’agitant fréquemment ; après l'avoir filtré à travers une flanelle et l'avoir enfermé dans un ballon flambé, je le stérilisais à 115° pendant vingt minutes. Le lendemain, presque tout le beurre avait gagné la surface, où il formait une couche plus ou moins épaisse ; je décantais alors la partie inférieure du lait, pour l'avoir sans beurre. Ce lait était de nouveau placé dans des ballons flambés, et stérilisé de nouveau à 115° pendant dix minutes.

Au bout de vingt-quatre heures, si on a placé le lait ainsi préparé à l’étuve à 36°, après l’avoir ensemencé, on constate que la surface du lait est recouverte par une membrane lisse d’un blanc mat très pur, formée par le microorganisme et que le lait est coagulé.

Le coagulum, si par exemple le lait avait dans le ballon une hauteur de 4 à 5 centimètres, en occupe plus des trois quarts ; si la hauteur du lait est plus grande, il occupe proportionnellement une moins grande hauteur ; au-dessus du coagulum s’étend une couche de liquide jaune clair.

Le lendemain, c’est-à-dire au bout de quarante-huit heures, le coagulum est beaucoup réduit de volume, en même temps il est plus ferme. Il occupe environ seulement la moitié de la hauteur primitive du lait, le liquide qui le recouvre est toujours d’un jaune clair; la membrane que le bacille mesentericus vulgatus forme à la surface du lait par l’enchevètrement des bâtonnets commence à se plisser légèrement.

Le troisième jour, le coagulum de caséime est très réduit, c’est à peine s’il occupe le quart de la hauteur du liquide,

ilest évident qu’il a été dissous en partie, ce qui en reste est mou, peu dense, se désagrège facilement au moindre choc.

La membrane formée par le micro-organisme est très plissée, mais ne présente-cependant jamais l'aspect qu'elle a dans le bouillon nutritif. Elle a un aspect tout à fait particulier, elle est d’un blanc mat, épaisse, et ressemble tout à fait à de la peau de gant blanc.

Le quatrième jour, toute ou presque toute la caséine est dissoute, il est rare qu’il en reste un peu, si on a donné au lait une hauteur non supérieure à 5 centimètres; le liquide est toujours d’un jaune clair; à sa surface il n'existe plus de membrane, mais une couche floconneuse, visqueuse, qui, examinée au microscope, se montre formée de bacilles et d’une substance visqueuse, gommeuse (voir page 14) et de quelques globules gras.

Les jours suivants, le liquide ne change que peu d’aspect, mais généralement, vers le dixième jour, le liquide commence à brunir légèrement, la couche floconneuse formée par le micro-organisme et flottant à sa surface perd sa couleur blanc mat et se brunit aussi légèrement; enfin, vers le vinglième ou vingt-cinquième jour, le lait est transformé en un liquide brun à la surface duquel se trouve encore une couche floconneuse assez épaisse.

Ce liquide porté à l’ébullition ne se trouble pas et donne les réactions des peptones ; il est évident que le bacille mesentericus vulgatus, cultivé dans le lait, a sécrété au moins trois diastases : l’une, une présure, a coagulé la caséine, la seconde est une caséase qui a dissous la caséine coagulée, enfin la troisième, que nous connaissons déjà, a dissous l'albumine du lait.

Si, lorsque la caséine du lait est entièrement dissoute, on filtre le liquide pour le séparer des micro-organismes et qu'on évapore le liquide clair ainsi obtenu à une température non supérieure à 60° et que, lorsqu'il aura pris une consistance d'extrait, on achève d'enlever toute l’eau en présence de l’acide sulfurique et dans le vide, on obtient une poudre brune orangée d’un goût de caramel.

Le corps renferme beaucoup de sucre de lait, environ plus de la moitié de son poids.

Outre les trois diastases que nous venons de trouver dans une culture du bacille mesentericus vulgatus dans le lait, ce microbe forme encore de l'acide lactique dont la présence” est facile à constater, si on a pris soin d'ajouter de la craie au lait. L'acide lactique formé ne s'élève jamais à un chiffre bien haut, car 1 litre de lait, laissé dix jours en cullure et exposant à l'air une surface de 250 centimètres carrés, condition très favorable pour le développement du micro-organisme, n’a donné que 55,15 de lactate de zinc, c'est-à-dire 25,72 d’acide lactique.

Nous venons de voir que le bacille mesentericus vulgatus, avant de dissoudre la caséine, la coagule; il m'a paru intéressant de rechercher si la caséine coagulée, non par la présure, mais par l’acide lactique avant qu’on ensemence le lait, serait dissoute plus vite que celle ‘qui doit être coagulée au préalable.

Dans ce but j'ai, en le chauffant, fait coaguler du lait en lui ajoutant 2 p. 1000 d’acide lactique; mais avant de le stériliser et de l’ensemencer, je l’ai fait chauffer avec de la craie pour neutraliser l'acide lactique, et de plus, pour bien assurer la neutralisation, j'ai ajouté environ 1 p. 1,000 de carbonate de soude.

Un ballon de lait ainsi préparé fut mis à l’étuve à côté d’un autre ballon contenant la même quantité du même lait non coagulé. Le ballon du lait non çoagulé avait sa caséine entièrement dissoute le cinquième jour, tandis que la caséine du lait coagulé spontanément ne fut dissoute que le dixième jour.

Dans une autre expérience, je n’ai pas neutralisé le lait qui contenait un peu moins de 2 p. 1,000 d'acide lactique, la dissolution de la caséine ne fut jamais complète, même après plus d’un mois.

Dissolution de la caséine. — Pour faire attaquer la caséine par le bacille #esentericus vulgatus, il n’est point nécessaire de l’introduire dans du bouillon faible; en effet la caséine est soluble en partie dans les solutions de sels alcalins; or nous avons vu que le phosphate de potasse favorise énormément le développement de ce micro-organisme, il suffit donc d’en ajouter un peu à l’eau dans laquelle on place la caséine pour dissoudre un peu de

celle-ci et fournir au micro-organisme un terrain favorable à son développement.

La caséine qui m'a servi pour mes expériences avait été préparée par coagulation spontanée du lait à froid pour éviter qu'elle ne contint de l’albumine. Après avoir été soumise à la presse pour chasser autant que possible le petit-lait, elle avait été lavée à plusieurs reprises dans l’eau, pour la débarrasser des sels et du sucre, puis soumise de nouveau à la presse, puis séchée à l'air après division en toutes petites masses et, traitée par l’éther pour la débarrasser du beurre, jusqu’à ce qu’une goutte d’éther projetée sur l’eau ne fit plus une tache irisée ; la caséine était alors séchée à l’étuve à 60° jusqu’à ce que toute trace d’éther eût disparu.

La caséine ainsi préparée fut mise à la dose de 35,5 pour 100 dans de l’eau contenant 0,50 pour 100 de phosphate tribasique de potasse. Comme ce mélange donne beaucoup de mousse qui imbibe de liquide les tampons de ouate, si on le stérilise à l’autoclave, je l'ai stérilisé en le portant trois jours de suite à l’ébullition.

Dès le lendemain de son ensemencement le liquide est couvert d’une couche épaisse de micro-organismes, mais la zooglée qu'ils forment à la surface du liquide ne présente que quelques rares plis.

Vers la quarante-huitième heure les plis augmentent et vers le quatrième ou cinquième jour la caséine non dissoute qui se trouve au fond du ballon commence à montrer des signes manifestes de dissolution. Vers le septième ou huitième jour, elle est généralement entièrement dissoute; et la liqueur prend une teinte ambrée claire.

Si on arrête alors la culture et qu'on évapore, on ne perçoit qu'une faible odeur ammoniacale, si même elle existe, mais si on laisse le ballon à l’étuve, le liquide se fonce de plus en plus, et à mesure qu'il vieillit l'odeur ammoniacale augmente, sans jamais cependant être très forte.