APR

Ce dernier chiffre concordant mieux que le premier avec le résultat biologique. Si cette première expérience est discutable, la suivante l’est moins :

Après l'enlèvement complet des phénols de l’urine, les auteurs ajoutent 200 y d'œstrone et pratiquent un dosage chimique, il leur est impossible de Les retrouver; découragés, ils concluent : « même en dépit de cette modification, la technique de dosage des œstrogènes ne donne pas satisfaction ».

Nous eussions été étonné du contraire : les 200 y d’œstrones ont été éparpillés au cours des cinquante-quatre extractions. À moins qu'ils n’aient disparu d’un seul coup, au cours d’une de ces redoutables maladresses qui surviennent bien au moins une fois sur cinquante-quatre manipulations.

Nous espérons qu’on ne pourra pas aller beaucoup plus loin que TALBoT et coll. dans cette recherche de la pureté par la technique des coefficients de partage, et nous conclurons que cette méthode ne peut, à elle seule, aboutir à des produits purs sans entraîner des pertes inacceptables. Elle ne peut donc constituer qu’un temps préliminaire et insuffisant, comportant un minimum de manipulation.

2° MÉTHODE CHROMATOGRAPHIQUE

La méthode chromatographique étant très sensible et hautement quantitative, elle paraissait toute désignée pour la purification des extraits urinaires. Cependant, l'extrait mis en jeu doit subir préalablement une première purification, car la méthode chromatographique ne peut convenir que dans la séparation d’un nombre relativement petit de corps très voisins.

Or, il semble bien que les impuretés qui suivent si étroitement la folliculine tout au long de sa purification soient aussi de nature phénolique.

DucxiNsKky et LEDÉRER avaient déjà utilisé l’adsorbtion sur alumine pour séparer, en vue de sa préparation industrielle, l’œstrone tirée des urines de la Jument gravide de

En

l’équilénine qui l’accompagne; ils avaient signalé que les pigments bruns étaient facilement adsorbés au sommet de la colonne.

En 1944, SriMMEL publia ses résultats dans l’étude de l’adsorbtion et de l’élution séparée des trois œstrogènes naturels à l’état pur.

Recherches personnelles

Nous avons essayé de l'utiliser pour la purification d’un extrait urinaire obtenu après extraction à l’éther, lavage au bicarbonate de sodium, extraction à la soude 2 N, acidification, extraction au chloroforme et lavage à l’eau.

La colonne, faite d’un tube de 5 mm. de diamètre intérieur, contient 500 mg. d’alumine pour chromatographie Rhône-Poulenc. Une trompe à eau active le passage des solvants.

On verse d’abord quelques cm*° de chloroforme pur, puis 5 cm: de l’extrait chloroformique urinaire légèrement teinté en brun.

Les cinq premiers cm*, après leur passage à travers la colonne, sortent parfaitement incolores et ne donnent, par évaporation, aucune réaction colorée. Le haut de la colonne d’alumine présente un anneau brun, puis une bande claire de 1 à 2 mm. enfin, un anneau de couleur jaune claire. Au-dessous, la colonne reste incolore.

Si l’on fait passer encore du chloroforme, soit pur, soit contenant un extrait urinaire, il y a élution de lanneau jaune. L’éluant, incolore à l’œil, fait apparaître par évaporation des petits cristaux bien visibles au microscope polarisant, très légèrement teintés en jaune, et qui donnent la plupart du temps une coloration extrêmement nette et pure avec le réactif au méthyl-glyoxal ou le réactif de ZIMMERMAN.

15 cm*° d’éluant lavent complètement la colonne; les 15 suivants restent vides de toute substance. Le haut de la colonne reste toujours coloré en brun.

Si l’on fait ensuite passer, comme l'indique STIMMEL, du benzène contenant de l’alcool méthylique (3/1), une nouvelle fraction se trouve entraînée encore plus rapidement par les dix premiers em°; cette fraction cristallise rapidement, donne la réaction de BACHMAN, la réaction au méthylglyoxal, la réaction de Davin; celle de ZIMMERMAN, au contraire, est négative. Il semble donc que la première fraction contienne l’œstrone et la seconde l’œstriol.

Nous avons vérifié sur des Rates castrées l’activité biologique de ces éluats, par le test d'ALLEN et Doisy.

La qualité des réactions colorées obtenues par cette méthode est remarquable, sans comparaison avec celle que donne les méthodes précédentes.

Notons que le tétrachlorure de carbone, le benzène, le toluène, le xylène ont été essayés à la place du chloroforme. Après traversée de la colonne, ils sont vides de substances et se montrent incapables, quelles que soient les quantités utilisées, d’éluer une fraction quelconque.

Au contraire, l’éther, l’acétone entraînent tout et ne permettent pas l'établissement d’un chromatogramme.

L’éther et le carbonate de sodium éluent les pigments bruns restés en haut de la colonne; ils donnent très vivement la réaction de Foi et DENIS.

La moindre trace d’eau dans le chloroforme entraîne une modification de son pH et de son pouvoir éluant.

Avec l’œstrone pure, le rendement de lélution est de Pordre de 96 à 99 p. 100.

Les urines de Femmes enceintes ne se comportent pas toujours de la même façon : une fois sur trois environ, des souillures passent en petites quantités avec la fraction phénolique faible; les urines de la même Femme sont ellesmêmes variables d’un jour à l’autre.

Il nous a été possible, grâce à cette méthode, de mettre en évidence de l’œstrone pure dans les urines d’Homme, et de montrer qué la fraction phénolique forte est la

plus abondante dans du sérum de Jument gravide, après destruction des protéines par l'alcool bouillant.

HEINTZBERGER, en 1943, avait remarqué ces mêmes propriétés du benzène et de l’éther; il était aussi parvenu, par addition d’alcool, à séparer les fractions fortes et faibles, mais ces éluats étaient constamment souillés d’une façon inacceptable, probablement à cause de l’éther.

STIMMEL, en, 1947, publia les résultats de l'application de sa technique de chromatographie à un extrait urinaire. En accord avec lui, nous conclurons que la chromatographie permet, avec un rendement excellent, une purification très intéressante, mais pas toujours parfaite.

Il'est cependant de toute évidence que nous n’avons pas épuisé toutes les possibilités; il existe de nombreux adsorbants, autant d’éluants et les combinaisons possibles sont en nombre presque infini.