CHAPITRE II

Méthode et Technique employées

au cours de ce travail.

Nous avons suivi la technique de SARTORY pour

la recherche des Oospora dans les crachats.

Âspect général des crachats. — D'une façon générale, les crachats sont blancs avec des parties de rouge orangé, presque rouillés, mais différents cependant des crachats provenant de pneumonie.

Souvent aussi, l'expectoration exhale une odeur fétide.

C'est dans les parties sanguinolentes du crachat

que nous avons trouvé le plus souvent l'Oospora catarrhalis.

Technique. — On promène (avec un fil de platine disposé en spatule) sur une lame de verre flambée, une petite portion des crachats. Il faut éviter une dessiccation trop énergique en procédant à l’étalement. On sèche à 37° et on fixe par la chaleur.

Coloration. — Faire agir le violet de gentiane pendant deux minutes sur la préparation, puis la solu-

tion de Gram, deux minutes également. On décolore

SI

à fond avec l’alcool-acétone. Les colorations sont très belles et mettent en relief uniquement les organismes prenant la méthode Gram. On a l'impression d'une culture en goutte pendante (SARTORY et LASSEUR).

Nous avons constamment utilisé pour nos recherches la méthode des cultures pures: en: milieux stérilisés. Ces cultures étaient effectuées dans des matras spéciaux d’une capacité de 60 cmc. et remplis. seulement jusqu'à moitié de leur hauteur. Le tampon d'ouate fermant le ballon était lui-même recouvert d’une capsule d'étain.

Nous avons fait usage, pour suivre la germination des appareils reproducteurs et le développement de ces végétaux, des cultures en cellules de Van Tieghem. Les bagues de ces cellules étaient scellées sur le porteobjet au moyen d'un vernis spécial ou, plus simplement, à l’aide d’un peu de vaseline.

Les différentes parties de l'appareil étaient flambées: avant les semis et a lame appliquée solidement sur la bague au moyen d'un peu de paraffine.

Au début, lorsque nos cultures étaient impures, nous isolions l'espèce qui nous intéressait, soit par la Méthode des stries, soit par la Méthode des plaques (en boîte de Petri). |

Nos semis étaient effectués sur les milieux suivants :

1° Milieux liquides. — Bouillon de viande maltosé à 2 0/0.

2° Milieux. solides. — Bouillon de viande maltosé

à 5 0/0, solidifié par addition de gélatine ou de gélose.

Pour- l'étude biologique complète: de notre. parasite, nous nous servions des milieux usuels. employés en mycologie et. bactériologie (carottes, pommes de terre, topinambours, gélatine, gélose, bouillon ordinaire, liquide de Raulin).

Les carottes et les pommes de terre étaient mises à macérer pendant quatre heures dans une solution de maltose à 5 0/0.

Nous avons employé des milieux maltosés parce que ce milieu est favorable à la culture des Oospora.

Examen des Cultures. — Nous avons examiné les cultures dans toutes leurs parties, tant dans leur aspect macroscopique qu'au point de vue histologique, en signalant au passage tous les faits intéressants.

Les agents de fixation dont nous avons fait usage sont : la chaleur, l'alcool, le liquide de Flemming, l'acide picrique à saturation, le picroformol, le sublimé acétique.

Méthode de Coupe. — Pour les fragments d'organes: prélevés chez le cobaye, dans les parties les plus lésées, nous avons eu recours à l'inclusion en paraffine en suivant la technique indiquée par LAUNOY (1).

Méthode. de Coloration. — Méthode Fontès modifiée par SARTORY et LASSEUR.

(1) LAUNOY. — Précis de technique histologique et cytologique, p. 183, Baillière éditeur, 1908

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1° Fixer à la chaleur par le‘passage dans la flamme, cinq à sept fois ;

2° Colorer par le Ziehl, trois à quatre minutes, à chaud ;

30 Laver à l’eau :

4 Colorer par le cristal violet phéniqué, quatre à cinq minutes ;

5° Faire agir la solution de Lugol ;

6° Décolorer à froid par l’alcool-acétone ;

7° Laver à l’eau ;

8° Colorer au bleu de méthylène pendant une minute ;

90 Laver à l'eau.

Les granulations sont colorées en violet noir et les corps de l'Oospora en rose.

En résumé, nous avons suivi pour l'étude complète (morphologique, biologique et expérimentale) le protocole d'expérience suivant

& 197, — Examen microscopique.

À. Sans coloration. De préférence en goutte pendante. On note :

a) La mobilité, ou b) la forme des mouvements et leur rapidité.

B. Avec coloration.

1° Par la thionine phéniquée, on note :

a) La forme, b) La dimension,

le

c) La disposition d’arrangement, d) La présence ou l'absence de spores, e) La présence ou l'absence de capsules.

2° Pratiquer la méthode de Gram ; 3° Pratiquer également la coloration spéciale du bacille tuberculeux (Oospora acido-résistant) ;

4 Coloration spéciale des cils vibratiles.

$ 2. — Culture.

À. Déterminer si le parasite est aérobie ou anaérobie. B. Culture en bouillon.

On note :

19 La température optima de la culture ; 20 Le temps que le bouillon maltosé met àsetroubler; 3° L'aspect du trouble (uniforme, granuleux, en ondes soyeuses) :

4° La formation d'un voile (irisé, épais, sec, plissé, etc...) ; 59° La réaction du milieu ; 6° L'odeur de la culture :

7° La présence de pigments .