R — CH = O

C’est Harpy qui a noté le premier que les protéides en solution soumises à l’action d’un courant électrique se déplaçaient tantôt vers un pôle, tantôt vers l’autre suivant l'acidité ou la basicité de la solution.

MICHAELIS étudiant diverses albumines, en particulier la sérumalbumine et la sérumglobuline, nota que le changement était brusque à cH3 X 10-5 (pH 4,7) pour la sérumalbumine — à cH — 4 X 10-6 pour la globuline et à cH = 1,8 X 10-7 pour Hb O2.

VLÈS fait d’ailleurs remarquer « que la transformation des ampholytes d’anions en cations aux points iso-électriques ne se fait totalement que dans le cas usuel pour les protides ou les degrés de dissociation « de ces ampholytes sont pratiquement nuls à ces points. Mais si a n’est pas nul, il y a au delà des points iso-électriques une certaine marge (dont l'étendue dépend précisément de a) où des molécules présentent encore les propriétés nécessaires à une combinaison : on aura affaire à un équilibre statique où existeront des restes de molécules anions dans la zone des cations et réciproquement. Le point critique de la transformation totale sera en réalité donné par le moment où le degré de dissociation de la valence intéressante sera nul ou négligeable.

L'intérêt pratique de ces notions est que le point isoélectrique se présente en général comme un point critique des propriétés de l’ampholyte : Pour des protéides en particulier (LOEB) il correspond à un minimum de solubilité, un maximum d’instabilité en solution (floculation), une viscosité minima, une liaison minima avec les électrolytes périphériques (c’est-à-dire une faculté minima de combinaison), un maximum ou un minimum de propriétés optiques (pouvoir rotatoire, diffusion) (VLÈS et VELLINGER) ; et pour les gels, un gonflement minimum par l’eau ou, au contraire, une rigidité maxima (MicHAUD, etc.). On voit donc que ce qui importera le plus pour définir les propriétés d’un ampholyte tel qu’une substance protéique à un moment déterminé, sera la valeur de la réaction du milieu par rapport au point iso-électrique de l’ampholyte, c’est-à-dire la distance entre le pH et le pHi.

Une expérience fondamentale de LoEB montre qu’en réalité une protéine se comporte bien, tantôt comme un acide, tantôt comme une base, suivant le pH du milieu dans lequel elle se trouve.

Voici le résumé de cette expérience : « On prépare par addition d'acide ou de soude, des échantillons de gélatine en poudre à des pH divers échelonnés dans l’échelle des réactions; on met ces gélatines en contact, dans ces pH, avec du nitrate d’argent (à froid et à l’obscurité), puis on les lave pour enlever l’excès de nitrate d’argent, et enfin on les fond à 40° pour faire des solutions

homogènes. Les tubes étant mis à la lumière, on constate qu’un

certain nombre d’entre eux noircissent par action photo-chimique sur un sel d’argent; or le noircissement se produit pour tous les tubes dont le pH est supérieur à 4,6 et ne se produit pas au-dessous de cette valeur. Si la gélatine incolore de ces pH bas est à son tour alcalinisée pour la ramener dans les pH hauts, on constate

3,3 3,5 3,7 3,9 42 44 46 kB 51 54 Il

J GCelztines au NO*Ag

G/stnes au Fe(CNYK*

Fig. 1.

qu’elle est incapable de noircir. La gélatine n’a donc été eapable de retenir le cation argent et de faire un gélatinate d’argent qu’au dessus de pH 4,6. Elle ne se comporte comme un acide libre qu’au dessus de son point isoélectrique.

Inversement on peut montrer qu’au dessous de son point isoélectrique la gélatine se comporte comme un cation. On met cette fois les gélatines en poudre de pH divers en contact avec du ferrocyanure de potassium, puis on les lave. Or les gélatines de pH inférieurs à pH 4,6 bleuissent à la lumière (il y a formation d’un sel ferrique), alors que les tubes supérieurs à pH 4,6 restent incolores. Les gélatines n’ont donc retenu les ions ferrocyanhydriques, et ne se comportent comme un cation qu’au dessous du point isoélectrique (VLEs. Précis de Chimie-Physique, p. 297).

Définition du point iso-électrique

Deux sortes de définitions peuvent être attribuées au point iso-électrique. Les premières sont des définitions directes, elles sont vérifiées le plus souvent par la cataphorèse. A ce type peut être rattachée la définition suivante

Sr 11 —

Le point iso-électrique est le pH où, dans le transport électrique, la substance change de sens de transport, étant cation du côté des pH bas et anion du côté des pH élevés. Ceci est réalisé dans deux conditions :

1° Au moment où la charge électrique d’une protéide est nulle, c’est-à-dire au moment où il y a égalités de valences dissociées du côté alcalin et du côté acide.

2° Lorsque les ions H+ libérés par la valence acide sont égaux aux ions OH- libérés par la valence alcaline.

Ces deux conditions ne sont, d’ailleurs, équivalentes que dans la mesure où la protéide est en solution privée de sel. En milieu salin en effet, la fixation ou la libération par les valences d’anions et de cations se fait par un partage entre les anions et les cations de sel, et les ions H+ et ions HO-.

Les secondes définitions peuvent être dites, définitions dérivées, par ce qu’elles s’appuient sur la constatation expérimentale de conséquences théoriques tirées de la notion de point iso-électrique.

Dans celles-ci rentreront les définitions qui font du point iso-électrique le moment où la protéine présente le minimum de solubilité.

Cette propriété par exemple, sera mise en évidence en ajoutant une quantité d’alcool constante dans des volumes égaux de solutions à divers pH et en observant dans quel pH le précipité est maximum (indice d’alcool). C’est une définition secondaire puisqu'elle est basée en fait sur l'hypothèse qu’à l’égalité de dissociation des valences acides et alcalines doit correspondre un minimum de dissociation et par conséquent un minimum de solubilité.

VLES et DE COULON ont montré qu’il n’y avait pas identité parfaite entre les deux types de définition.

Cette identité imparfaite ne serait-elle pas due à ce que les deux opérations expérimentales (cataphorèse et indice d’alcool) ne mettent pas en évidence le même type de processus. L'indice d’alcool ou la précipitation par l’acétone donnent le minimum de solubilité d’un complexe total dans un pH qui est celui initial de la solution (légèrement modifié par l'introduction des premières portions du liquide organique précipitant qui a une basse constante diélectrique). Par contre, la cataphorèse

effectue une véritable séparation analogue à ce que serait une électrolyse, en scindant des complexes dont nous retrouvons les éléments séparés. Ce sont les points iso-électriques de ces éléments que nous mettons le plus souvent en évidence. La cataphorèse pénètre donc en quelque sorte plus avant dans la structure moléculaire des complexes et peut mettre davantage en lumière les constituants que le constitué global (VLES).

La distinction des deux définitions possibles du point isoélectrique, sur laquelle nous avons insisté plus haut a conduit à la scission de la définition du point iso-électrique qui a été tentée récemment par SÔRENSEN, LINDERSTROM-LANG, LUND, lesquels distinguent des points iso-électriques et des points isoioniques. « La détermination de la capacité de combinaison avec les acides et les bases permet de déterminer pour un ampholyte l’ionisation

pH spécifique de son hydrogène : h — qui est le rapport de cA la concentration $fH des ions H + pris ou donnés par lui à la concentration CA° de l’ampholyte. La réaction iso-ionique de l’ampholyte est la valeur du pH (ou plus exactement du paH pour lequel l’ionisation spécifique de l’hydrogène est nulle, h = o : point où l’ampholyte est incapable de se combiner à un acide ou à une base. Par contre la valence moyenne de l’ampholyte qui met en jeu la faculté de combinaison avec n'importe quel électrolyte, les sels en particulier est :

— Ra TRUC 2 = Cr Tr Ca CA

(Bu Bs- Ban) quantités d’ions H + et d’ions provenant du sel BHS en suivant la notation actuelle de BRONSTED pour la définition des acides et des bases: cr est la concentration de la molécule r, valente et définit une notion qui n’est pas identique à la précédente; le pH (ou plus exactement le p à H), pour lequel la valence moyenne de l’ampholyte est nulle, r — o est le point isoélectrique proprement dit. Suivant lès conditions expérimentales l’un ou l’autre des points iso-ionique ou iso-électrique, peut être mis en évidence et leurs deux valeurs peuvent ne pas coïncider » (VLES d’après SORENSEN).

Un problème supplémentaire se pose relativement au nombre de points iso-électriques que peuvent donner plusieurs substances. Les anciens auteurs ont décrit un point iso-électrique par

Lt.

substance, mais des méthodes plus fines comme l’étude des courbes de neutralisation ou même la cataphorèse ont mis en évidence plusieurs points iso-électriques pour la même substance.

Théoriquement les calculs montrent que les acides aminés et les ampholytes polyvalents, doivent avoir plusieurs points iso-électriques si leurs valences ont des dissociations échelonnées dans l’échelle des pH. Prenons le cas d’un ampholyte

polyvalent présentant par exemple une valence alcaline et deux valences acides : « Il peut y avoir pour les points isoélectriques plusieurs valeurs possibles qui ne sont pas nécessairement confondues. Par exemple dans le cas ci-dessous, l’une des valeurs est relative à la dissociation simultanée des deux valences acides a, et a, pour laquelle on a

T pHi, — — (pKa,+pKa,+pKb)

L’autre est relative à la dissociation d’une seule valence acide et est du type

pHi = Es (pKa,+pKb)

En somme on a d’une façon générale pour l’ampholyte polyvalent zpK pH

dans lequel n représente la totalité des valences acides ou alcalines, actuellement dissociées et = p K la somme de leurs

rire

constantes respectives. On voit donc qu’un ampholyte polyvalent, le long de l'échelle des pH où la totalité de ses valences ne sera pas toujours simultanément opérante, pourra présenter autant de points iso-électriques qu’il y aura (n — 1) valences.

Le problème devient plus compliqué en présence d’un mélange d’ampholytes mono ou poly-valents comme c’est le cas le plus habituel en biologie et en pathologie, puisque tous les liquides de l’organisme tels que le sang, les liquides d’épanchement, etc. sont des mélanges de plusieurs albumines. VLES a abordé cette question à un point de vue théorique et les lignes qui vont suivre ne sont qu’un résumé de son travail par Paul-H. ROSsIER dans un article d'ensemble paru aux Annales de Médecine (avril 1928).

Formation des complexes. Théorie de Vles

Formation des complexes, Théorie de VLES : « Imaginons une solution de deux albumines A et B représentée par les symboles HROH et HR’OH, et considérons-les comme des ampholytes monovalents, c’est-à-dire comme n’étant capables de ne libérer qu’une seule valence acide ou basique et appelons le point isoélectrique de A pHiA et celui de B pHiB. Pour fixer les idées, attribuons à pHiA la valeur 6 et à pHiB la valeur 10. Au-dessus de pH 10 la solution de ces ampholytes ne contiendra que des ions protéiques électro-négatifs : ROH et R’OH, tandis qu’en dessous de pH 6 les ions protéiques seront positifs. RH et R’H et se meuvront vers la cathode si la solution est placée dans un champ électrique. Maïs dans les solutions dont le pH est compris entre pH 6 et pH 10, il y aura mélange d’ions électro-positifs RH et d’ions électro-négatif R’OH. x

Ces ions seront capables de former un complexe HR - R’OH qui sera lui-même un ampholyte ayant à son tour un point isoélectrique que nous appelerons pHi C. Ce complexe n’existera que dans une zone Z très limitée de pH : plus on s'éloignera de cette zone, plus le complexe aura tendance à se dissocier en ses éléments constituants.

Si l’on soumet à la cataphorèse le mélange des amphelytes A

et B, on pourra théoriquement mettre en évidence 3 points isoélectriques, pHi À, pHi B, pHi C, en outre on constatera la présence de deux points dits, neutres de seconde espèce ou le transport sera-égal dans les deux sens, mais où le système sera négatif du côté des faibles pH et positif du côté des forts pH, alors que lPinverse a lieu au point iso-électrique. Si nous recherchons quel sera théoriquement le sens du transport des ions protéiques sous l'influence d’un champ électrique dans la zone de pH comprise entre le point iso-électrique de la substance A et celui du complexe HR - R’OH issu de l’union des ions de signe contraire de A et B, nous pouvons schématiquement diviser cette zone en trois fractions.

1° Une zone de pH située dans le voisinage du point iso-électrique du complexe HR - R’OH (pHi C), où il y aura prédominance des ions négatifs R - R’OH issus de ce complexe, on trouvera donc un transport vers l’anode.

Fic. 3.

2° Une zone de pH située aux environs du point iso-électrique de la substance A (pHi A), où le complexe RH - R’OH s’étant dissocié en majeure partie en ses constituants, il ÿy aura prédominance numérique des ions HR sur les ions R - R’OH du complexe et transport vers le pôle négatif.

3° Une zone de pH située entre les deux zones précédentes où les charges des composants HR et R - R’OH seront égales. Il y aura donc transport de même valeur aux deux pôles, ce sera le point neutre de seconde espèce.

Le même raisonnement est applicable à la zone de pH comprise entre pHi C et pHi B. C’est ainsi que le mélange de deux ampholytes donnera naissance à trois points iso-électriques et deux points neutres de seconde espèce.

On peut schématiquement représenter ce phénomène de la manière suivante :

Si nous compliquons le problème afin de nous rapprocher davantage des conditions qui se rencontrent en biologie et si nous considérons non plus le mélange de deux, mais de plusieurs ampholytes, mais devons admettre qu’ils formeront des complexes deux à deux, en fin de cause, aboutir à la formation d’un complexe total à point iso-électrique situé vers la moyenne des divers points isoélectriques des constituants. On peut schématiser ce processus à l’aide d’une figure empruntée au travail déjà cité de VLes.

Il est infiniment probable que les éléments protéiques isolés et reconnus par les chimistes, globulines, englobulines, paraglobulines, albumines, etc. sont des entitès chimiques isolables in vitro mais qu’in vivo, où elles coexistent en présence, ne sont pas toujours dans certaines conditions de pH, indépendantes les

1% P: P, Pe Ps P6 @

Fic. 4.

unes des autres. Ces colloïdes forment vraisemblablement des complexes les uns avec les autres, les charges des uns neutralisant partiellement les charges des autres, les éléments se collant et se protégeant mutuellement au hasard des rencontres électrolytiques en un certain nombre de complexes plus ou moins fragiles et plus ou moins complets, que le chimiste décortique en quelque sorte pour en extraire, voire par la simple précipitation, telle ou telle albumine, telle ou telle globuline.

Il est important de remarquer que de tels complexes ne doivent avoir qu’un domaine de stabilité ou si l’on préfère un territoire d'existence assez restreint dans l’échelle des pH, puisque dès que l’on dépasse dans celle-ci le point iso-électrique d’un des constituants du compiexe, il est susceptible de se retirer de l’association : le complexe s’égrène en parcourant la gamme des pH » (VLESs, archives de physique biologique, août 1925).

PARAGRAPHE III

Le point iso-électrique en biologie et en pathologie humaine

Les premières expériences de cataphorèse effectuées par VLÈS et DE COULON ont été faites avec des purées de muscle de souris. Les souris mâles montrèrent un point iso-élecirique À se plaçant régulièrement dans une zone comprise entre pH 5, 8, et pH 7 avec une indépendance certaine de l’âge du sujet. Un point C se retrouvait souvent entre pH 9 et pH 10.

Les femelles présentèrent des aberrations qui paraissaient liées à leur état génital, Les souris vierges se sont comportées comme les mâles adultes, avec un point À dans la zone normale de ceux-ci. Chez les souris gravides, le point À s’éleva vers les forts pH (entre pH 7 et pH 8) puis descendit au-dessous de la normale au moment du terme. Cette élévation vers les forts pH s’est également retrouvée avec l'invasion et la période d'état de certaines infections bactériennes à virulence précoce, avec l’abcès aseptique à la térébenthine, avec l'existence de tumeurs. L’abaissement vers les faibles pH s’est vu avec un staphyloccoque doré.

L’étude des variations corrélatives du point iso-électrique et de l’évolution des tumeurs cancéreuses a, en particulier, été poussée très loin. Elle a nécessité des milliers de souris blanches. Nous en reparlerons à la fin de ce premier chapitre.

. Ces points iso-électriques, trouvés au cours des cataphorèses de muscles de souris furent ensuite recherchés dans le sérum humain.

A. — LES POINTS iSO-ELECTRIQUES DU SERUM HUMAIN

u) Sérums normaux

VLÈS et DE COULON, pour déterminer les points iso-électriques de l'individu normal, ont prélevé du sang, soit sur des

DEBROISE 2

adultes sains qui s'étaient prêtés bénévolement à la prise de sang, soit chez des sujets arrivant à l’hôpital pour des lésions traumatiques toutes récentes, telles que des fractures qui ne paraissent pas mettre en jeu de mécanisme humoral immédiat, ou encore des appendicites devant être opérées à froid.

Les résultats ont été extrêmement constants.

CHEZ L'HOMME, furent déterminés Un point « situé au voisinage de pH 5,5 et paraissant très stable comme position, il ne dépasse jamais ni 5 ni 6.

Un point y beaucoup plus élevé placé entre 11 et 12 mais, moins stable que le précédent, il est sujet à descendre jusqu’à pH 9.

Un point B déterminé pas extrapolation comme inférieur à 5.

Un point 5 soupçonné quelquefois par extrapolation au delà de pH 12. |

CHEZ LA FEMME NORMALE, plusieurs causes de perturbations furent mises en évidence. Premièrement le cycle génital joue un rôle très important qui n’a pas encore été complètement étudié. De plus, on obtient des chiffres différents suivant que l’on s’adresse à des femmes ou à des filles vierges. Comme le font remarquer VLÈS et DE COULON, il est souvent particulièrement difficile et délicat de choisir et de délimiter les sujets rentrant dans cette catégorie et il y aura lieu dans la suite des expériences de tenter de définir à quoi correspond la virginité génitale au point de vue humoral. Il est infiniment peu probable qu’il s'agisse là d’une virginité anatomique, mais bien d’une virginité physiologique, laquelle n’est pas forcément liée à la précédente. On pourrait supposer que c’est l’éveil à la vie génitale qui s’accompagne de perturbations métaboliques, sécrétions internes, etc...

LEwicKki n’a-t-il d’ailleurs pas signalé des modifications des propriétés du sérum chez la femme comme conséquence du coit.

Quoi qu'il en soit, les résultats obtenus dans le sexe féminin normal ont été les suivants :

FILLES VIERGES. — Les sujets étudiées étant échelonnées entre 12 à 40 ans, on a déterminé :

Un point iso-électrique aux environs de pH 5,5, extrêmement stable et correspondant au point « du sérum des hommes.

Un point $ soupçonné dans un certain nombre de cas audessous des limites de pH utilisées.

Aucun point (à l’exception de deux cas) ne s’est montré,

d’une façon constante, comme correspondant au point .

FEMMES. — Pas de point iso-électrique à pH 5,5, mais un point assez stable à 6,5. Pas de point y dans la majorité des cas.

Seul chez une femme âgée de 54 ans on trouve un point à pH 5,5. Ce sérum présente d’ailleurs également un point singulier vers 11 qui est peut-être un rappel du point y. Les modifications chez la femme enceinte sont étudiées à la fin de cette étude.