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46 cc. de la solution n° :t r4 cc. de la » DR
et que, au colorimètre, il faut observer cet étalon artificiel sous 15,5 , si l’on veut avoir la même intensité de teinte que 10 , de solution de tyrosine étalon.
4° Influence du nitrite de soude.
Nous avons constaté que dans les conditions de réaction décrites par Zuwerkalow, c’est-à-dire en utilisant seulement une goutte de solution de nitrite de soude à o gr. 5 % la coloration ne s'établit pour ainsi dire pas, ou, qu’en tous cas elle reste jaune, et d’autant plus jaune que le tryptophane est plus abondant. Pour obtenir qu’une comparaison soit possible au colorimètre nous avons été amenés à porter à 2 le nombre de gouttes de cette solution. Dans ces conditions, la coloration cherchée s’établit de suite.
Cette quantité optima de nitrite de soude a été établie en effectuant la réaction sur une solution de tyrosine à o gr. 4 %. Nous avons pris comme étalon un mélange (tyrosine) ne contenant que 1 goutte de solution de nitrite de soude que nous avons observé sous 10". Nous lui avons comparé un mélange (tyrosine) contenant 2 gouttes et un troisième mélange (tyrosine) contenant 3 gouttes de solution de nitrite de soude.
Nous avons obtenu les résultats suivants :
1 goutte NO?Na | 2 gouttes NO?Na | 3 gouttes NONa
Hauteurs en An... 10 8,8 - 8,8 - 9,3 - 8,8[9,2 - 0,4 - 0,4 - 9,4
De même, avec une solution de caséine à 1 % nous avons constaté que cette quantité de nitrite de soude paraissait optima, et, qu’en tous cas un excès de ce sel ne nuisait pas à la réaction.
En effet, en comparant une solution étalon de tyrosine à Oo gr. 4 %, additionnée de II gouttes de solution de NONa et placée sous 10 ",, avec cette solution de caséine, nous obtenons les résultats suivants :
Etalon Tyrosine Caséine
RS
2 gouttes NO?Na | 1 goutte NO?Na | 2 gouttes NO?Na | 3 gouttés NOZNa
1° dosage (hauteurs
en mn) 10 7,8 - 8,2 - 8,0 - 8,215,4 - 5,8 - 59 - $,415,8 -15,6 - 5,8 - 5,8 2° dosage (hauteurs >
en "{n) 10 PORTES DNS ie Sd SUIS ie 58-187
5° Influence du tryptophane.
Nous avons ensuité tenu à nous rendre compté si le tryptophane ne gênait pas la réaction. Pour céla, nous avons effectué cette réaction sur des solutions dé câséiné à 1 % renfermant respectivement o gr. 4 % ; o gr: 3 % ; o gr. 2 % de tryptophane que nous avons comparées à une solution de tyrosine à o gr. 4 % additionnéé de II gouttes de solution de nitrite de soude et placée sous 10 1.
Nous avons obtenu les résultats suivants :
Titre Tyrosine Caséine + Tryptophane en Tryptophane | Hauteurs en "Ân Hauteurs en n 04 % 10 58 260 581-157 0,3 % 10 5,0 - 54 -15,7 - 5,6 0,2 % 10 57-250 5.3 5:28
Nous constatons donc que quelle que soit la quantité de tryptophane ajoutée, les chiffres obtenus sont les mêmes et identiques à ceux obtenus plus haut pour la caséine pure. Le tryptophane ne semble donc pas gêner la réaction.
6° Influence de la soude destinée à dissoudre la protéine. |
Au cours des divers essais que nous avons effectués, nous avons été conduits à dissoudre les matières proteéiques dans de la soude, parfois assez concentrée ; ce qui fut le cas, par exemple, pour la caséine, l’édestine et la fibrine. Pour la caséine et la fibrine même, nous avons dû chauffer pour obtenir une dissolution. Or, à la suite de l’emploi de cette soude, à plusieurs reprises, nous ne sommes pas parvenus à la coloration rose caractéristique du Millon, mais à des teintes jaunes peu comparables au
témoin et de plus nous avons obtenu des précipités abondants.
Nous avons d’ailleurs constaté que lorsque Zuwerkalow admettait que l’on dissolve les protéines dans la soude à 5 %, si la chose était nécessaire, il ne se rendait pas compte que cette soude entravait la réaction,
En effet, si nous effectuons la réaction sur un mélange de tyrosine effectué dans les conditions suivantes :
Solution de lessive de soude à 5 % ten volume. cc Solution acétique (1) de tyrosine à 25 mg. %. 2cc Ce: ACRHIQUE, DURS Le LR RE. IC Solutiqn-de No° Na: 4 Os 9%... ER I gtes.
Nous constatons que, par comparaison avec une solution étalon de tyrosine à o gr. 4 %, sur o mg. 50 de tyrosine mis en réaction, nous ne retrouvons que o mg. 43 — o mg. 41 de tyrosine, soit une perte de 14 à 18 pour 100.
Il est donc bien évident que la soude apporte un trouble dans cette réaction. Celui-ci est-il dû au fait que, lorsque nous chauffons les protéiques avec de la soude pour obtenir leur dissolution, il y a destruction partielle de la molécule ? Nous ne le croyons pas, car ce trouble se produit aussi bien lorsque l’on ne chauffe pas, comme dans l'exemple cité à propos de la tyrosine. D’autre part, nous verrons que bien des auteurs ont conseillé des hydrolyses de protéiques dans de la soude bien plus concentrée, à la température de l’ébullition et pendant des temps supérieur$ à 15 heures sans que l’on éprouve aucune difficulté pour mener à bien cette réaction de Millon.
Nous croyons que la cause de ce trouble réside en la présence d’un système tampon gênant acétate de soudeacide acétique.
Pour nous en convaincre, nous avons opéré les essais
suivants.
(1) Nous employons ici une solution acétique de tyrosine, de façon à conserver intégralement le volume de 3 cc..d’acide acétique indiqué par Zuwerkalow, |
Nous avons effectué une première réaction sur le mélange suivant :
Lessive de soude (D—1,332) diluée au 1/10°
en'volume 0) TE EEE ARS CC.
Solution acétique de tyrosine à 25 mg %... 2cc. Acide acétique DU 022 UM PARA NE de Tec.
SO‘ Hg (solution de Hopkins) ............ ACC: Solution de NO? Nat 0,5 ou EE EEE IT gtes.
Puis une 2° réaction sur le mélange suivant :
Eau distillée ....... de CRE 4e a ren I CC.
Solution acétique de tyrosine à 25 mg %... 2cc. Acide acétique nur A ere I CC.
SO Hg (solution de Hopkins) ............ Ace NO Naen sotiQn ao: OLA EUR I] gtes.
Nous avons comparé chaque mélange à notre étalon artificiel au cobalt, voici les résultats que nous avons obtenus :
Etalon artificiel 1" réaction 2° réaction Hauteurs en "na | Hauteurs en "a | Hauteurs en "à
15,5 10,3 8,0 ER... LR
La hauteur théorique pour o mg 5 de tyrosine introduite étant de 8 %,, on voit que la coloration obtenue en présence de NaOH mène à une teneur beaucoup trop faible (erreur de 20 % environ), on voit donc que le mélange tampon acétate de soude-acide acétique gêne la réaction,
Nous avons pensé que le remède, qu’il convenait d’apporter, pourrait consister en la neutralisation pure et simple de la soude par un acide fort avant l'addition d’acide acétique. Pour cela nous avons neutralisé la soude par de l’acide sulfurique de façon à faire un mélange sulfate de soude-acide acétique, lequel n'étant pas tampon ne devait pas gêner la réaction.
Nous avons fait un essai avec de la fibrine, nous avons dissout à chaud 5 milligrammes de ce corps dans un cc. d’une solution de soude à la concentration suivante : 20 cc. de lessive de soude (D -- 1,332) dans 50 cc. d’eau.
À ce moment, nous devions tenir compte :
1° De ce que le volume total de notre prise d’essai ne devait pas être modifié, à cause de notre témoin artificiel ;
2° De ce que, par conséquent, l’acide sulfurique devait être ajouté au dépens de l’acide acétique ;
3° De ce que, enfin, ce dernier devait toutefois exister en quantité suffisante pour empêcher la précipitation de la fibrine par le sulfate mercurique.
Comme nous avons constaté que le volume minimum d'acide acétique devait être de 2 cc., si lon veut éviter tout précipité, nous avons donc utilisé de l’acide sulfurique suffisamment concentré pour que la quantité nécessaire à la neutralisation ne dépasse pas 1 cc.
Nous avons suivi dans la préparation de notre réaction le processus suivant :
Er ns REA A TOUR RER CNT A 5 mg.
Solution de soude (concentration ci-dessus). x cc.
Faire dissoudre, ajouter pour neutraliser :
SO RENTE 20 AT NUE o cc. 7 ACHICIACELIQUE NP ERA. ATEN 21009 SO‘Hg (solution de Hopkins),.......... 2 CC.
Solution de NO? Na à o,5 %........... IT gtes.
En opérant aïnsi l’on obtient une bonne coloration rose, sans précipité. De plus, dans cet exemple sur la fibrine, le pourcentage de tyrosine contenu dans cette fibrine fourni par ce procédé a été supérieur à celui obtenu avant la modification proposée ci-dessus. Ceci semble confirmer qu’il y a nécessité à neutraliser la soude nécessaire à la dissolution de la matière protéique.
7° Technique proposée :
On peut décrire la méthode ainsi définitivement modifiée de la façon suivante :
a) Cas d’une solution aqueuse non sodique de l’albuminoiïde.
Opérer le mélange suivant :
Solution de l’albuminoïde à 1 %...... CC:
Acide: ‘acélique 1; rer RReent 3 GC; SO‘Hg (solution de Hopkins) ... .... 2 CC:
Solution de nitrite de soude à 0,5 %... Ilgtes.
Porter 1 minute au bain-marie bouillant et laisser reposer 15 minutes. Comparer au colorimètre de Dubosq avec une solution étalon de tyrosine à o gr. 40 % observée
sous 10 1. Le pourcentage en tyrosine de l’albuminoïde considéré est donné par la formule suivante :
mm ZE es
x étant le pourcentage calculé.
a’ étant la hauteur sous laquelle on observe l’étalon.
a étant la hauteur sous laquelle on observe la solution étudiée.
b) Cas d’une solution aqueuse sodique de l’albuminoïde.
Opérer le mélange suivant :
Solution sodique de l’albuminoïde à 1 %.... cc. SOfH® 5N, quantité suffisante pour neutraliser (< 1 cc.) Acide acétique, quantité suffisante pour 3 çc. (2 2 cc.) SO‘ Hg (solution de Hopkins) ............. 2CC: Solution de nitrite de soude à 0,5 % ...... IT gtes.
Porter 1 minute au bain-marie bouillant et laisser reposer 15 minutes. Comparer au colorimèêtre de Duboscq avec une solution étalon de tyrosine à o gr. 40 pour 100 cbservée sous 10 %, comme dans le paragraphe précédent.
Remarque :
On peut remplacer la solution étalon de tyrosine par une solution étalon artificielle au cobalt, comme nous l'avons vu dans un paragraphe antérieur (page 34).
8° Vérification de la méthode :
a) Nous avons appliqué la méthode de Zuwerkalow à des solutions de tyrosine afin de vérifier qu’il y avait bien proportionnalité entre les colorations développées et les quantités de tyrosine mises en jeu.
Nous avons opéré deux solutions aqueuses de tyrosine, l’une à o gr. 26 %, l’autre à o gr. 53 % que nous avons comparées après réaction à notre étalon artificiel au cobalt. Nous savons qu’une hauteur de 15,5 %% de cette solution correspond à 10 ", d’une solution de tyrosine à o gr. 40 %. Dans nos calculs nous avons remplacé ce chiffre de 15 par 10 4.
Voici les résultats que nous avons obtenus :
Etalon coloré Solution de Tyrosine Hauteurs en "{n Hauteurs en 1°" dosage (0,26 %)..... 15,5 | 14,2-13,6-13,8-14,5 moy. 14,0 2° dosage (0,53 %)..... 15,5 74- 8,0- 7,6- 7,6 moy. 7,6 Calculs :
x de) 1” dosage : ———— —
x — 0 gr. 28 % au lieu de o gr. 26 % mis en œuvre.
e 10 2° dosage : ——— — ——— 0,4 7,6
x — O gr. 52 % au lieu de o gr. 53 % mis en œuvre,
Il semble donc que les colorations développées sont bien proportionnelles aux quantités de tyrosine mises en œuvre.
b) Nous avons ensuite ajouté de la tyrosine à de la caséine et nous avons effectué la réaction sur le mélange des deux afin de vérifier si nous retrouvions bien cette tyrosine ajoutée.
Mais d’abord nous avons fait un essai sur une solution de caséine à 1 %.
Voici les résultats que nous avons obtenus :
| Etalon coloré Solution de caséine
Hauteurs en "4 Hauteurs en I Hdosage. 15,5 | 5,6 - 5,8 - 5,9 - 5,8 moyenne 5,7 2° Mosage ee A 15,5 | 5,6 - 6,1 - 5,8 - 6,0 moyenne 5,8 | 3H A0SALES 15,5 | 5,4 - 5,4 - 5,9 - 5,6 moyenne 5,5
Moyenne générale 5,6 qui correspond à une teneur de o mg. 47 pour 1 cc. de prise d’essai. Or, après calcul, en tenant compte du pourcentage de la caséine en tyrosine . de 7,14 % trouvée précédemment, il y a théoriquement dans la prise d'essai de 1 cc. : o mg. 13 + o mg. 35 — o mg. 48 de tyrosine. Nous avons, de même, additionné x cc. d’une solution sodique de caséine La Roche, dont la teneur en tyrosine était de 6,46 %, de o mg. 19 de tyrosine. La tyrosine retrouvée était de o mg. 15.
On peut donc admettre la réaction de Zuwerkalow ainsi modifiée comme assez exacte puisque, à peu de choses près, elle nous a permis de retrouver la presque totalité de la tyrosine ajoutée à des solutions diverses de matières protéiques.
9° Résultats obtenus :
Nous avons appliqué cette méthode à diverses matières
albuminoïdes let nous avons obtenu les résultats suivants
que nous avons groupés avec les chiffres trouvés par Zuwerkalow. |
Pourcentage en tyrosine
Par notre procédé Selon Zuwerkalow Fihne 2277 7,7 Edestine de chènevis 6,45 - 5,52 - 5,20 4,9 - 5,0 - 4,8 - 4,8 Sérum globuline... 7,57 - 6,23 Sérum albumine... 5,56 Gélitiie Mn 0,36 - 0,23 Albumine d'œuf... 5,60 4,2 - 4,8 - 4,4
Caséine (Bouchara) 7,8 Caséine (Levaltier) 7,14 - 8,0 - 7,08 6,8 - 6,8 - 7,2 - 6,8 Caséine (Roche).. 6,52 - 6,46
On voit que dans l’ensemble nous trouvons des chiffres plus élevés que ceux de Zuwerkalow.
