PATES

boîte de Pérrr stérile. Laisser refroidir sur une surface plane pendant un quart d’heure. Placer ensuite les boïtes dans une étuve à 42° pendant deux heures.

Deuxième temps : Ensemencement.

11 peut se faire de deux manières

1° Faire fondre au bain-marie des tubes de milieu n° 2. Laisser refroidir. Dès que l’eau aura atteint une température de 48-50°, ensemencer avec 0 cc. 2 de la culture de staphylocoque étalon préparée comme nous l’avons indiqué. Agiter soigneusement pour rendre le mélange homogène. Prélever cette gélose ensemencée avec une pipette de 10 cc. stérile tiédie à la flamme d’un bec Bunsen. Mettre 2 ce. de cette gélose sur des boîtes préalablement préparées et chaudes. Etaler rapidement en agitant d’une manière circulaire et laïsser refroidir à plat.

2° On verse avec une pipette Pasteur, sur la plaque d’Agar préparée, une quantité suffisante de culture en bouillon de 16 à 24 h. du staphylocoque standard. Cette culture peut être diluée au 1/10°, 1/100°, 1/1.000 suivant les résultats obtenus, mais l’inoculum doit être le même pour une série de dosages. On balance la plaque d’un côté et de l’autre, puis on la place inclinée à environ 20° par rapport à l’horizontale, de façon que l’excès s’accumule dans une petite zone du bord où on le réaspire avec la pipette. On marque au crayon gras sur la plaque la dite zone. Avec cette méthode, il conviendrait de faire le titrage sur quatre plaques différentes en changeant pour chacune d’elles la position de l’échantillon à titrer. Celuiei serait placé à 90° de la position qu’il occupait sur la plaque précédente de façon qu’un cylindre différent soit situé chaque fois dans la zone où l’on a réaspiré.

Troisième temps : Pose des cylindres.

Les cylindres qui sont conservés dans des tubes en verre et stérilisés à l’autoclave à 120°, seront placés à ce moment sur la surface de la gélose. Chaque cylindre sera

CHABBERT 2

Eg À prélevé avec une pince stérile et légèrement chauffé à la flamme à sa partie inférieure. Il doit être appliqué sur la surface du milieu en le faisant tomber d’une hauteur de 5 mm. pour qu’il s'enfonce légèrement. CocxiLL emploie une gélose à 2 % d’Agar où les cylindres s'appliquent naturellement sans flambage, ni pression. Ces cylindres seront placés à 1 em. 5 de la périphérie de la boîte, à raison de cinq par boîte.

Quatrième temps : Remplissage des cylindres.

Avec une pipette stérile à tétine de caoutchouc on rem: plit jusqu’au ras trois cylindres avec des solutions de titre inconnu de Pénicilline. Les deux autres recevront une solution étalon contenant üne unité par cc.

On place à l’étuve à 37° pendant 18 heures. On lit alors les résultats en mesurant à la pointe sèche ou par transparence sur un papier millimétrique, le diamètre des auréoles.

Interprétation des résultats :

Œ\ rh D

Pour avoir le chiffre en Unités Oxford on se réfère à

une courbe standard préalablement établie.

D/AMETRE EN MM

On dessine les courbes standard en déterminant les diamètres des cercles d’inhibition produits par des solutions

to

renfermant des quantités d’unités Oxford connues, échelonnées entre 0,25 U.O. et 3 unités par ce.

Approximativement cent zones d’inhibition sont déterminées pour chacune des cinq concentrations 0,25 - 0,50 - 1-2 -3 U.O. par ce. Une fois les courbes standard établies, comme il y a des variations minimes mais réelles pour chaque boîte, on essaie seulement une unité standard dans chaque boîte pour préciser la courbe qui doit être utilisée.

Facteurs influant sur les diamètres des zones d'inhibition De nombreux facteurs, d’après ScxMiDT et Meyer sont susceptibles d’influer sur les diamètres. Il est utile de les connaître pour standardiser une méthode dans un laboratoire.

Profondeur de la gélose : Avec 25 cc. pour des boîtes de 10 em. de diamètre, les disques sont nets, maïs avec 15 cc. ils deviennent indistincts.

pH de la gélose : Suivant le pH le diamètre varie. Par exemple, pour une Pénicilline titrant 2 U.O. : pH 6. Titre moyen sur 10 dosages 24 mm. 6 pH 7. Titre moyen sur 10 dosages 23 mm. 1 pH 8. Titre moyen sur 10 dosages 22 mm. 6 De plus à pH 6 les cercles seraient moins nets qu’à 7.

Variations de la souche : Il importe de conserver la souche dans les mêmes conditions de milieu et de temps de culture à une température donnée.

La souche de staphylocoques H standard du N.C.T.C. de Londres est susceptible de variations. Cowax, expérimentant sur sept échantillons utilisés dans différents laboratoires a trouvé des variations de pousses microbiennes importantes suivant la concentration en Pénicilline et en germes du milieu,