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Concentration de l’inoculum : L'augmentation de la dilution de la culture est susceptible de faire croître le diamètre des cercles.

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DILUTIONS dela CULTURE

Croissance de l'organisme test : Si l’on place après le dosage les plaques à une température basse pendant quelques heures, il y a naturellement augmentation de la phase de latence et agrandissement des cercles. Une Pénicilline, qui portée immédiatement à 37° aurait donné un cercle de 22 mm., après sept heures de glacière en donnera un de 25 mm.

Pose des cylindres : La régularité de la pose des cylindres et la profondeur à laquelle ils sont enfoncés dans la gélose influent sur les cercles dans une limite difficile à préciser. |

On voit qu'il est nécessaire, comme l’avait proposé Hunter, de standardiser les dosages et particulièrement dans un même laboratoire, de fixer sa méthode. Cependant la précision de cette méthode est nettement suffisante, d’après HeaTLey la marge d’erreur ne serait pas supérieure à 20-25 %. Il est certain même que ce taux a été abaissé aux environs de 10 % dans les laboratoires de contrôle pharmaceutique américains où l’on pratique une moyenne de deux à trois cents dosages en triple ou quadruple exemplaires par jour.

Cette méthode a l’avantage de titrer avec une relative facilité un grand nombre d'échantillons. Ceux-ci, de plus n’ont pas besoin d’être stériles. Pour le titrage de Pénicillines de taux complètement inconnus, elle permet d’at-

le

teindre rapidement la zone sensible. Enfin, elle permet d'éliminer des produits rencontrés fréquemment au cours de la préparation de la Pénicilline tels que la Notatine et la Pénatine qui ne diffusent pas dans l’Agar.

Nous avons dit que ce qui nous intéressait surtout ici était l’utilisation des méthodes pour le titrage en milieu organique. Or, la méthode HgarTLey ne dose pas au dessous de 0,25 U.O. et la majorité des liquides organiques contiennent des quantités nettement inférieures. Cependant, elle garde toute sa valeur pour le dosage des liquides septiques à forte teneur en Pénicilline, notamment c’est une méthode excellent pour le dosage dans l’urine. Ce dosage présente une grande utilité soit que l’on veuille récupérer la Pénicilline, soit que l’on veuille établir le bilan d’élimination. La Pénicilline s’altérant rapidement, il est utile de la traiter. Le procédé utilisé par R. MarTiN consiste à recueillin les urines sur 10 % de tampon M/15 à pH 5,2 additionné de 8-10 cc. par litre d’acétate d’amyle ou de 2 % de chloroforme.

Plusieurs modifications ont été proposées qui portent sur le support du liquide à examiner et le germe.

Méthode des cupules de FLEMING

Elle consiste à pratiquer sur une plaque d’Agar déjà ensemencée avec du staphylocoque, des orifices cylindriques avec un perforateur stérile de 6 mm. de diamètre (perce-bouchons stérilisé). Le fond de ces cavités est recouvert d’une goutte d’Agar fondu stérile pour éviter que le liquide ne se répande entre le fond des plaques et le milieu de culture. Dans ces cupules, on place les solutions de Pénicilline et on en mesure l’activité par le diamètre de la zone d’inhibition comme précédemment.

Méthode des disques de papier de V.G. VINCENT

C’est la plus simple et la plus commode de toutes. Sur des boîtes ensemencées à l’ordinaire, on pose des disques

de papier filtre de 7 mm. 5 de diamètre, imbibés des solutions de Pénicilline à étudier. Ersren utilise la même méthode avec des disques de papier de un centimètre de diamètre posés sur la gélose contenue dans des grandes boîtes en pyrex de 31 X 26 em.

Méthode utilisant le B. Subtilis

Exposée en détail par Forsrer et Wooprur, cette méthode présenterait suivant ces auteurs plusieurs avantages sur les méthodes utilisant le staphylocoque. En effet, la pousse de la souche de staphylocoque en milieu liquide est très irrégulière pour des temps donnés. Elle peut troubler seulement le bouillon ou laisser un gros dépôt après vingt-quatre heures de pousse. Nous avons même constaté que le staphylocoque peut produire une culture à la surface du bouillon qu'il est difficile de dissocier. Bien qu’il soit possible de pallier à ces inconvénients en opérant sur une dilution d’opacité donnée, 1l est certain que l’entretien de la souche nécessite un soin constant. Le chauffage à 45° pour réaliser le film d’ensemencement altère certains staphylocoques et fait varier le taux d’ensemencement. Cette température est trop près de celle où la gélose se solidifie, ce qui est gênant quand on opère sur un grand nombre de boîtes. Le staphylocoque: nécessite une ineubation à 37° ce qui amène des gouttes de condensation qui risquent de retomber rendant ainsi le dosage difficile à lire. Enfin, le temps d’étuve modifie les cereles beaucoup plus pour le staphylocoque que pour le B. Subtilis.

Temps d’incubation Diamètre en mm.

Staph. doré B. Subtilis

17 heures 24,5 17,3

21 heures 25 17,9

46 heures 25,8 17,2

Les auteurs utilisent une souche ne contenant que des spores de B. Subtilis. Cette souche est cultivée en bouillon

PSS DEA

pendant 5-6 jours en l’agitant constamment pour éviter la formation du voile et sous courant d’air stérile. Au bout de ce temps, la culture est pasteurisée à 60° pendant trente minutes pour détruire les formes végétatives. La gélose est ensemencée ensuite de manière qu’elle contienne 2 X 10° spores par cc. Le titrage se fait comme dans la méthode Hrarzzv, soit avec des disques de papier, soit avec des cylindres.

Les avantages résident dans la conservation très longue à la glacière de la culture de spores. La température du film d’ensemencement peut être de 55 à 60° donc stérilité plus grande et absence de solidification de l’Agar. La pousse se fait à 30° pendant six heures, d’où rapidité, absence de souillures et de gouttes de condensation. Enfin, les cercles d’inhibition seraient plus nets et mieux visibles.