Cas des protéines iodées

Le dosage de la thyroxine dans les protéines artificiellement iodées présente des difficultés particulières en raison de la te-

(*) Il est recommandé, comme dans tous les dosages colorimétriques, de faire un essai témoin sur les réactifs mis en œuvre dans les conditions du dosage, et, s’il y a lieu, de soustraire la valeur de € ainsi déterminée de celle obtenue en présence de l’hydrolysat protéique. Dans cet essai à blanc € ne doit pas dépasser 0,03.

(**) Dans lexemple cité plus haut, la thyroglobuline de bœuf étudiée renferme 0,243 p. 100 de thyroxine déterminée par la méthode de BrLau.

neur élevée de ces produits en autres dérivés iodés solubles dans le butanol. Ces derniers ne donnant pas la réaction colorée des o.diiodophénols, il apparaissait que l'application de notre méthode aux iodoprotéines artificielles pourrait être réalilée, une fois fixées les conditions d’hydrolyse à adopter. REI- NEKE, TURNER, KOHLER, HOOVER et BEEZLEY [172], ont proposé de doser la thyroxine dans les iodoprotéines en utilisant la méthode de BEAU sur des hydrolysats obtenus par action de la baryte à 40 p. 100 pendant 20 heures au bain-marie bouillant. Les pertes en thyroxine résultant de cette opération étant de 6 à 7 p. 100, nous avons préféré lui substituer l’hydrolyse par la baryte à 8 p. 100 au bain d'huile à 115-120° pendant 6 heures, laquelle ne libère que 2 à 4 p. 100 de l’iode sous forme d’iodure. Par ailleurs, l’étude parallèle de la teneur en iode total et en thyroxine — la première déterminée par la méthode de MICHEL et LAFON [135] et la seconde par colorimétrie — de l'extrait butanolique des hydrolysats préparé selon le mode opératoire de REINEKE et de ses collaborateurs a révélé de notables écarts, sur lesquels nous reviendrons plus loin. Aussi y a-t-il lieu de réaliser une purification de cet extrait, riche en dérivés iodés autres que la thyroxine.

C’est ainsi que la diiodohydroxybenzaldéhyde isolée par PITT Rivers des hydrolysats alcalins de caséine iodée, soluble dans le butanol comme la thyroxine, entraîne une erreur par excès dans le dosage de celle-ci par la méthode des auteurs américains. :

L'application à la diiodohydroxybenzaldéhyde de la réaction aux ions nitreux effectuées dans les conditions adoptées pour le dosage de la thyroxine en solution pure montre que 500 ug du premier composé fournit une coloration correspondant à 25 ug seulement du second de sorte que l’on peut négliger son influence.

Principe de la méthode. — La thyroxine, libérée de l’iodoprotéine par hydrolyse barytique, est extraite quantitativement par le butanol à pH — 3,5-4,0. Après lavage à la soude 5 N de la solution butanolique, dont la plus grande partie des dérivés iodée non-thyroxiniens est ainsi éliminée, on évapore le solvant à + 70°. Le résidu sec obtenu est repris dans de l’eau acidulée à pH = 3,5-4,0 par l’acide chlorhydrique et soumis à une nouvelle extraction par le butanol. Celui-ci est ensuite lavé à la soude 5 N et évaporé à + 70°, cette double extraction étant indispensable pour éliminer complètement la diiodotyro-

sine en excès. Après reprise du résidu sec par un milieu approprié, on opère sur une partie aliquote la réaction colorée de la thyroxine aux ions nitreux, dont on mesure l'intensité du photomètre de Pulfrich. On détermine sur une courbe d’étalonnage, établie au préalable sur une solution titrée de thyroxine pure, la quantité de celle-ci présente dans la prise d'essai (*).

Mode opératoire. — 100 à 200 Mg de protéine iodée sont additionnées de 5 à 10 cm* de solution (5 em° par 100 Mg) de Ba(OH), à 8 p. 100 et chauffés pendant 6 heures au bain d'huile à 115-120° sous réfrigérant à reflux. Après refroidissement, on transvase quantitativement dans une ampoule à décanter de 50 em. On amène le milieu à pH — 3,5-4,0 à l’aide d'HCI N (virage au bleu ardoisé du bleu de bromophénol) et l’on porte à 15 cm° avec de l’eau distillée. On ajoute 15 em de butanol et l’on agite énergiquement, puis on laisse reposer 12 heures ; la totalité de la thyroxine passe alors dans le butanol avec une partie importante de la diiodotyrosine et d’autres dérivés iodés. Pour éliminer ces composés, dont le premier seul donne la même réaction colorée que la thyroxine, on lave l'extrait butanolique avec NaOH 5 N (2 lavages avec 15 cm et 1 avec 7,5 cm? NaOH 5 N) en ayant soin de ne pas éliminer les produits insolubles rassemblés à la limite de séparation des deux liquides. On centrifuge, on décante le butanol que l’on évapore à l’étuve à 70°. Afin de se débarrasser complètement de la diiodotyrosine, on procède à une nouvelle extraction au butanol du résidu sec de la première repris par 15 em* d’eau acidulée à pH — 3,5-4,0 par HCI N. Le produit de cette seconde extraction est traité comme celui de la première et évaporé à 70. Ceci fait, on dissout le résidu sec obtenu dans 15 cm* de solution hydroalcoolique de chlorure de sodium (solution I, voir page 33) et l’on dose la thyroxine sur une partie aliquote selon le mode opératoire décrit à propos des produits thyroïdiens.

Les résultats obtenus sont exacts à + 4 p. 100 près, comme l'ont montré les essais réalisés sur de multiples hydrolysats d’une même préparation additionnés ou non de quantités connues de thyroxine.

(9) I va de soi que l’on peut substituer au photomètre de Pulfrich un autre appareil de mesure en disposant d'un écran de même sélectivité que celui choisi par nous (Sx) ou que lon peut opérer par colorimétrie directe en mettant en œuvre une solution étalon de thyroxine,

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Justification de la méthode. — Une double extraction au butanol réalisant une purification du premier extrait de l’hydrolysat est indispensable dans le cas des protéines artificiellement iodées, alors qu’elle est inutile dans celui des produits thyroïdiens. Il en est ainsi, en raison de leur teneur élevée des premières en diiodotyrosine (jusqu'à 9,3 p. 100 dans certains iodocaséines préparées en milieu ammoniacal) et en autres acides aminés iodés peu solubles dans le butanol. On trouvera ci-dessous les résultats d’une expérience particulièrement démonstrative. |

Deux préparations d’iodocaséine renfermant respectivement 6,75 p. 100 d’iode (A) et 8,80 p. 100 I (B) ont été hydrolysées selon le mode opératoire décrit plus haut (baryte à 8 p. 100 ; six heures au bain de paraffine à + 115°). La solution obtenue a été divisée en trois parties égales, lesquelles ont été soumises à une extraction butanolique (extraction à pH — 3,5-4,0, lavages avec NaOH 5 N, évaporation à sec et remise en solution). On a répété une fois cette opération, le lavage et l’évaporation sur le résidu sec de l’un des trois essais, et deux fois sur celui du troisième. La thyroxine a été dosée dans les produits ainsi obtenus par colorimétrie et par dosage de liode total. Les valeurs déterminées par l’une et l’autre de ces méthodes sont les suivantes.