PREMIÈRE PARTIE

Dosage colorimétrique de la thyroxine, de la diiodotyrosine et de la monoiodotyrosine. Application aux protéines iodées.

Les thyroglobulines renferment de la thyroxine et de la 3.5 diiodotyrosine et, par ailleurs, la 3.monoiodotyrosine a été isolée des protéines artificiellement iodées. Plusieurs méthodes permettent de déterminer la teneur en thyroxine et en diiodotyrosine des unes des autres, tandis qu’il n’en existe encore aucune pour y doser la monoiodotyrosine.

Avant d'entreprendre la discussion des travaux antérieurs, il nous paraît utile de résumer les principales propriétés des trois acides aminés iodés, en particulier celles mises à profit pour leur dosage par voie chimique.

I. Thyroxine. — La thyroxine cristallise en gerbes et en rosettes. Elle est presque insoluble dans l’eau pure, totalement dans l’eau faiblement acétique. Insoluble dans la plupart des solvants organiques, elle est cependant extractible par le n. butanol, plus difficilement par l’acétate d’éthyle. Elle est assez stable même à chaud en milieu alcalin, en présence de baryte plus que de soude, sans doute par suite de la faible solubilité du sel de baryum. L’hydrazine ou le stannite de sodium, à chaud, désiodent quantitativement la thyroxine. Celle-ci forme avec les bases deux séries de sels (mono et di) dont ceux de sodium basique sont solubles dans les mélanges hydroalcooliques. La faible solubilité dans l’eau du sel monobasique a été utilisée par ailleurs, au cours de la purification de la thyroxine. Le dérivé argentique est complètement insoluble. Elle fournit avec les acides, des sels plus solubles en présence d’alcool qu’en milieu aqueux pur. Comme les acides aminés, elle donne une réaction bleue violacée avec la ninhydrine et comme celles de nombreux o-diiodophénols, ses solutions chlorhydri-

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ques alcooliques se colorent en jaune orangé par addition de nitrite de sodium et virent ensuite au rouge par alcalinisation à l’ammoniaque.

II. 3.5 Diiodotyrosine. — La diiodotyrosine cristallise avec un nombre plus ou moins grand de molécules d’eau selon le milieu à partir duquel on l’isole. Ses cristaux en forme d’aiguilles prismatiques sont plus solubles dans l’eau que ceux de tyrosine, la diiodotyrosine présente des caractères plus acides que celle-ci, son pK étant voisin de 4.2. Elle est stable en milieu très alcalin même à chaud, cependant elle est assez facilement détruite par chauffage à pH 8. L'alcool n.butylique l’extrait de sa solution acide mais très faiblement de sa solution alcaline. L’acide phosphotungstique, l’acétate de plomb et les sels d’argent la précipitent incomplètement. Elle est désiodée quantitativement à chaud en donnant naissance à de la tyrosine, soit par l’hydrogène en présence de carbonate de calcium et de palladium, ou par le stannite de sodium, soit par SO,H,7N ou par l’hydrazine. Elle ne donne pas la réaction de MILLON, mais présente par contre une réaction positive à la ninhydrine et celle aux ions nitreux commune à de nombreux o.diiodophénols.

III. Monoiodotyrosine. (3.iodotyrosine). — La 3.iodo.L tyrosine cristallise anhydre, en navettes ou en losanges tandis que la 3.iodo-DL-tyrosine cristallise avec une molécule d’eau, en forme de prismes, de rosettes et souvent de navettes. Les solubilités de la 3.iodotyrosine sont intermédiaires entre celles de la diiodotyrosine et celles de la tyrosine ; c’est ainsi qu’elle est plus difficilement extractible d’une solution acide par le n.butanol que la première, mais cette extraction est plus facile que pour la seconde. Elle donne la réaction de MILLON comme la tyrosine et ne présente pas la réaction des o-diiodophénols aux ions nitreux commune à la thyroxine et à la diiodotyrosine mais sa désioduration s'effectue dans les mêmes conditions.

Le dosage chimique des acides aminés iodés dans les protéines pose deux problèmes distincts : d’une part, leur mise en liberté par hydrolyse et d’autre part, leur détermination proprement dite. Les diverses solutions préconisées ont été l'application des propriétés particulières que nous venons de rappeler.

Pour la commodité de l’exposé, nous réunirons les différen-

tes méthodes de dosage particulières à chacun des acides aminés.

À. — Dosages de la thyroxine.

Aucune des méthodes proposées pour le dosage de la thyroxine n’est basée sur la constitution de ce corps. Aussi sa détermination dans les protéines iodées ne peut elle être effectuée qu'après hydrolyse. Celle-ci comporte d’ailleurs deux conditions, d’une part la stabilité de la thyroxine au cours du chauffage avec l’agent d’hydrolyse et d’autre part sa complète libération de la molécule protéique par action de celui-ci.

A. — HYDROLYSE.

a. STABILITÉ. — La thyroxine se décompose facilement en milieu acide. LELAND et FOSTER [107] indiquent en effet que 38 p. 100 de cet acide aminé sont détruits par chauffage à l’ébullition dans SO,H,2N pendant 18 heures. C’est pour cette raison que les bases ont été généralement utilisées tant pour l'isolement de la thyroxine que pour certaines opérations de son dosage. |

1°) Action de la soude. — La stabilité de l’acide aminé pur en présence de soude a été étudiée en détail par LELAND et FOSTER [107], puis par BLAU [20] [21]. Leurs résultats sont rassemblés dans le tableau suivant :

Normalité de la soude Temps de chauffage Thyroxine détruite employée à l’ébullition en p. 400 N 18 heures 4,4 N 63 — 40 2N 6. — 10 2N 18 — 25,4

Il ressort de l’examen de ces chiffres que la thyroxine n’est pas très stable en milieu sodique. La libération complète des protéines iodées par action de la soude à chaud entraîne toujours une perte plus ou moins importante. Un autre élément empêche de connaître avec certitude la quantité de thyroxine réellement détruite dans des conditions expérimentales définies. En effet, alors qu’il est possible de récupérer 83 p. 100 de thyroxine quand celle-ci est ajoutée à de la poudre de thy-

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roïde, l’hydrolyse étant effectuée dans NaOH 2 N ; 75 p. 100 seulement sont retrouvés avec NaOH N. Aussi LELAND et Fos- TER [107] considèrent-ils que l’hydrolyse par NaOH 2 N est préférable à celle par NaOH N.

2°) Action de la baryte. — HARINGTON [64] a utilisé le premier avec succès la baryte comme agent d’hydrolyse mais l'étude de la stabilité de la thyroxine pure chauffée avec Ba(OH),, 8H,0 n’a été entreprise [21] que beaucoup plus tard. Par chauffage à l’ébullition, pendant 6 heures, avec de la baryte à 8 p. 100, 3 p. 100 environ de thyroxine sont détruits ; alors que 7 p. 100 environ le sont en présence de baryte à 40 p. 100, par hydrolyse au bain-marie bouillant pendant 20 heures. Lorsque l’hydrolyse de diverses protéines additionnées de thyroxine est effectuée, à l’ébullition pendant 6 heures, avec Ba(OH):8H,0 à 8 p. 100, 91 p. 100 de l’acide aminé iodé sont retrouvés. Dans tous les cas la baryte a un effet destructeur moindre sur la thyroxine que la soude, sans doute à cause de l’insolubilité du sel de baryum.

b. LIBÉRATION DE LA MOLÉCULE PROTÉIQUE. — Les résultats de l’action des alcalis sur 1x thyroxine seule ou ajoutée à des protéines doivent être complètés par l’étude de la libération de l’acide aminé compris dans la molécule protéique elle-méme. BLAU [21] étudia l’hydrolyse de la poudre de thyroïde par NaOH, 5 N, 2 N, Ba(OH); 8H,0 à 8 p. 100. Des dosages si-. multanés de la thyroxine et de l’azote aminé ont montré qu’après traitement de 6 heures par Ba(OH);, 8H,0 le rendement maximum en thyroxine est atteint, bien qu’il n’y ait alors que 99 p. 100 d'azote aminé libéré, tandis que 18 heures sont nécessaires pour obtenir le même résultat par NaOH 2 N avec 70 p. 100 d’azote aminé. L’hydrolyse par NaOH 0,5 N fournit des chiffres inférieurs. L’iodoprotéine est done hydrolysée de façon différente selon l’agent alcalin mis en œuvre.

©. CONDITIONS PARTICULIÈRES D'HYDROLYSE. —— HARINGTON et RANDALL [75] ont proposé d'utiliser NaOH N 4 heures à l’ébullition. Dans ce cas la thyroxine n’est pas détruite mais elle n’est probablement pas entièrement libérée: BRAND et KASSELL [34] préconisent NaOH 5 N pendant 20 heures à 100° C en tube scellé, ce qui comporte la libération totale de l'acide aminé, mais une importante destruction de celui-ci,

Les conditions adoptées par LELAND et FOSTER [107], et à l'échelle microanalytique par TREVOROW [195] et TAUROG

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[193], comportent une hydrolyse par NaOH 2 N, pendant 18 heures à l’ébullition, ce qui a pour conséquence de libérer la thyroxine en totalité, mais avec une perte minimum de 17 p. 100 environ.

Pour libérer la thyroxine des iodoprotéines artificielles REI- NEKE et TURNER [171] ont utilisé la baryte à 40 p. 100 ce qui conduit à une perte d’au moins 7 p. 100 et la formation de produits de destruction d’autres acides aminés iodés pouvant interférer dans son dosage.

En résumé, il est préférable d'utiliser la baryte pour hydrolyser les protéines iodées en vue de la détermination de la thyroxine puisque, d’une part, elle détruit moins cet acide aminé que la soude et que, d’autre part, elle la libère plus rapidement de la molécule protéique. Les conditions les meilleures qui découlent de l’exposé des travaux précédents, et qui ont été adoptées par BLAU, sont l’hydrolyse des protéines thyroïdiennes par la baryte à 8 p. 100 pendant 6 heures à l’ébulltion, la perte en thyroxine étant dans ce cas inférieure à 5 p. 100. Cependant, comme nous le verrons par la suite, l’emploi de la baryte n’est pas toujours possible.