B. — DOSAGE PROPREMENT DIT

Les diverses méthodes de détermination de la thyroxine dans les iodoprotéines naturelles ou artificielles, à l'exception de celle de BRAND et KAssEL [34], comportent la séparation de l’acide aminé des autres composés iodés et le dosage de l’halogène dans la fraction contenant le premier.

La plus ancienne technique élaborée par HARINGTON et RaAN- DALL [75] est basée sur l’insolubilité de la thyroxine à pH 4.5 (*), pH auquel la diiodotyrosine n’est que faiblement soluble. Elle conduit à des résultats trop élevés car la diiodotyrosine précipite en même temps que la thyroxine soit par adsorption soit en combinaison peptidique avec la thyroxine.

La modification proposée par BLAU [21] et consistant à doser l’iode acido-insoluble dans l’hydrolysat barytique des protéines thyroïdiennes représente une amélioration notable du point de vue théorique mais, comme le signale cet auteur, de réalisation pratique délicate.

L'application de l’une ou l’autre de ces méthodes aux pro-

(*) Le pH est voisin du pK OH de la diiodotyrosine. On précipite ce corps dans ces conditions au cours de sa préparation.

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téines artificiellement iodées a fourni des résultats inconstants ne permettant pas d'évaluer de manière satisfaisante leur teneur en thyroxine [159] [52].

La solubilité de la thyroxine dans le butanol a servi de base à d’autres méthodes. L’hydrolysat alcalin des iodoprotéines naturelles obtenu dans les conditions indiquées par LELAND et FosTER [107] est extrait directement par du n.butanol. Les liqueurs butanoliques contiennent alors toute la thyroxine libre et, en plus, un peu de diiodotyrosine, laquelle est éliminée par un lavage ultérieur à la soude normale. Après évaporation du butanol le dosage de l’iode dans le résidu sec permet d’évaluer ainsi la teneur en thyroxine. Les résultats obtenus sont environ 50 p. 100 plus faibles que ceux de la méthode d’'HA- RINGTON et RANDALL [75], ce qu’explique en partie la destruction de la thyroxine au cours de l’hydrolyse sodique prolongée.

D’après BLAU [20], une acidification préalable à pH 3,5 de l’hydrolysat obtenu selon LELAND et FOSTER [107] permet une meilleure solubilisation de la thyroxine dans le butanol, mais 80 p. 100 de la diiodotyrosine présente sont également extraits. On peut néanmoins l’éliminer complètement par deux lavages avec NaOH 5 N. Cependant les chiffres obtenus par BLAU [20] sont à peine supérieurs à ceux publiés par LELAND et FOSTER [107]. Aussi l'intérêt de cette modification serait-il resté limité sans des travaux qui en ont élargi le champ d’application. En effet, BLau [21] a adopté par la suite la baryte au lieu de la soude pour hydrolyser les iodoprotéines naturelles. Le sel de baryum de la thyroxine étant insoluble dans le butanol, on acidifie l’hydrolysat par HCI jusqu'à pH 3,5-4.0, ce qui libère la thyroxine que l’on extrait alors de façon satisfaisante. La teneur en thyroxine déterminée sur un même échantillon de poudre de thyroïde est beaucoup plus élevée par cette méthode que celle obtenue par la technique de LELAND et FOSTER [107], mais inférieure à celle trouvée par le procédé de HARING- TON et RANDALL [75]. La discussion portant sur les hydrolysats et les contrôles effectués par BLAU permettent de considérer cette méthode comme la meilleure de celles préconisées jusqu'ici pour le dosage de la thyroxine dans les protéines thyroïdiennes, mais elle ne peut être mise en œuvre que sur au moins cinq milligrammes de thyroxine.

Par la suite REINEKE et ses collaborateurs [172] ont montré que cette méthode ne pouvait pas être appliquée aux iodoprotéines artificielles. Les teneurs de thyroxine obtenues sont

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trop élevées et ne correspondent pas à l’activité biologique des produits analysés. Ces auteurs incriminent l’hydrolyse qu’ils considèrent comme insuffisante, peut-être s'agit-il plutôt d’une destruction incomplète des dérivés iodés de lhistidine lesquels seraient partiellement solubles dans le butanol, car l’acide aminé non iodé est entièrement décomposé par chauffage prolongé dans la baryte. Une hydrolyse préalable de 20 heures au bainmarie bouillant par de la baryte à 40 p. 100 suivi du dosage de l’iode dans les conditions réglées par BLAU [21] donnerait des résultats satisfaisants. C’est là à notre connaissance la seule méthode proposée pour doser la thyroxine par voie chimique dans les protéines artificiellement iodées ; sa spécificité toutefois n’est pas démontrée car, au cours de l’hydrolyse, certains produits iodés solubles dans le butanol sont également libérés. Ainsi PITTr RIVERS [157] a isolé un corps iodé, la 3.5 diiodohydroxybenzaldéhyde, extractible par le butanol (*).

D’autres méthodes de dosage de la thyroxine reposant sur des principes différents ont été proposés. Elles consistent à libérer l’halogène de cet acide aminé par un réducteur tel que l’hydrazine ou le stannite de sodium. Avec le premier réactif PaaL et MoTz [152] ont montré que la désioduration est complète par chauffage à l’ébullition pendant une heure avec NaOH N en présence d’hydrazine, le dosage des iodures formés permet indirectement de déduire la quantité de thyroxine analysée. Cette technique fournit des résultats satisfaisants avec le corps pur, elle ne peut pourtant pas être appliquée à sa détermination dans les iodoprotéines naturelles et artificielles, car la diiodotyrosine est désiodée dans les mêmes conditions que la thyroxine, en sorte que sa séparation est nécessaire pour déterminer celle-ci. Les différents composés iodés qu’elles renferment la rendent absolument inutilisable dans le cas des iodoprotéines artificielles.

Nous ne signalerons ici que pour mémoire les dosages biologiques de la thyroxine, basés sur l’augmentation des échanges gazeux d'animaux éthyroïdés, sur la métamorphose de têtards de batraciens ou la perte de poids consécutive à l’administration de ce produit. L’exposé critique de ces méthodes sort du cadre de cette mise au point [188].

(*) Antérieurement SALTER [188] avait réussi à obtenir cristallisé, d’un hydrolysat barytique de sérumalbumine iodée, un composé se rapprochant par l’analyse élémentaire et les propriétés du produit obtenu par Pitt RIVERS.

B. — Dosages de la diiodotyrosine.

La stabilité de la diiodotyrosine au cours du chauffage dans les alcalis concentrés n’a pas été étudiée de façon systématique ; selon LuGG [119] la diiodotyrosine ne donne pas la réaction de MILLON, même après un chauffage de 20 heures à 100° C ; elle est donc stable dans ces conditions. PITT RIVERS et HARINGTON [73] ont étudié la stabilité de la diiodotyrosine au cours du chauffage à différents pH, la destruction est de 80 p. 100 après ébullition d’une heure à pH 7.5.

Les différents auteurs qui ont proposé des méthodes de dosage de cet acide aminé ont admis plus ou moins implicitement que ce composé n’était pas altéré par l’hydrolyse alcaline.

Ces diverses méthodes de dosage de la diiodotyrosine comportent, comme celle de BRAND et KassEL [34] la désioduration de cet acide aminé et la détermination de la tyrosine qui prend naissance au moyen de la réaction de MILLON. Elles exigent cependant la séparation de la diiodotyrosine et de la thyroxine ou la mise en œuvre de conditions telles que ce dernier composé n’intervienne pas. C’est ainsi que BLOCK a adopté la méthode de LuGG [119] pour doser la diiodotyrosine dans les protéines thyroïdiennes après action du stannite de sodium, la thyroxine étant préalablement extraite au moyen de n. butanol.

PaaLz et MoTz [152] ont montré que la diiodotyrosine comme la thyroxine est quantitativement désiodée par chauffage en milieu sodique par l’hydrazine.

Nous avons basé [113] sur ce fait une technique de dosage. Après élimination de l’excès d'hydrazine par du nitrite de sodium et de ce dernier réactif par l’urée, la détermination de la tyrosine est effectuée par la microméthode de BERNHART [19].

De même la désioduration de la diiodotyrosine par chauffage 20 heures à l’ébullition au bain de paraffine à 140° C avec SO,H, 8 N a servi de base à une technique que nous avons proposée [184].

Cependant toutes les méthodes que nous venons d'exposer applicables aux solutions pures de diiodotyrosine ne tiennent pas compte du fait que la menoiodotyrosine, présente dans les iodoprotéines artificielles et dont la désioduration s’effectue simultanément, fausse les résultats.

Nous nous sommes proposés de réaliser le dosage des trois acides aminés iodés par des techniques nouvelles basées sur des réactions colorées spécifiques de chacune dans des conditions expérimentales bien définies. Nous pouvions espérer que la mise en œuvre de propriétés particulières de ces corps et non plus seulement la présence d’halogène dans chacun, nous permettraient d’une part, de doser la thyroxine avec plus de sécurité et, d’autre part, de déterminer les taux respectifs de diiodotyrosine et de monoiodotyrosine.

Les solutions chlorhydriques de nombreux o-diiodophénols se colorent en jaune orangé par addition de nitrite de sodium et virent au rouge après alcalinisation par l’ammoniaque. Cette réaction fortement positive avec la thyroxine et la diiodotyrosine (KENDALL et OSTERBERG [98], INGVALDSEN et CAMERON [89], HARINGTON [67]), est négative avec la monoiïodotyrosine et la tyrosine (HARINGTON et Pitt RIVERS [72]). Par ailleurs, ces deux dernières donnent la réaction dite de MILLON (coloration rouge en présence de sulfate mercurique et d’acide nitreux), tandis que tel n’est pas le cas pour les deux premières, dès lors il était légitime d’entreprendre des recherches sur lapplication de ces réactions aux dosages des divers acides aminés iodés et tel est l’objet de ce travail. Au cours de celui-ci nous avons mis en œuvre la réaction aux ions nitreux pour le dosage de la thyroxine et de la diiodotyrosine, après séparation de ces corps au moyen de leurs différences de solubilité dans le butanol à divers pH, et la réaction de MILLON pour le dosage de la monoiodotyrosine.

Nous exposerons successivement l’étude du dosage des acides aminés iodés en solution pure, dans leurs mélanges, et dans les protéines thyroïdiennes ou iodées par voie chimique.