RECHERCHE ET IDENTIFICATION DU BACILLE COLI

En France, pour cultiver, identifier et numérer le bacille coli, on se sert généralement de la méthode de Vincent.

La culture est basée sur la propriété du bacille coli de vivre dans une eau peptonée légèrement phéniquée et à la température de 42°, l’acide phénique et la température de 42° étant des conditions dysgénésiques pour de nombreux germes banaux.

L'identification est simple : examen microscopique, Gram, réaction de l’indol, fermentation de la gélose lactosée tournesolée et du bouillon glucosé, coagulation du lait, etc., tous procédés classiques sur lesquels nous n'avons pas à nous étendre. FE a

La numération se base sur cette hypothèse, vérifiée d’ailleurs expérimentalement dans l'immense majorité des cas, qu'une colonie est produite par un seul germe.

En somme, dans son principe, la méthode de Vincent consiste à faire l’ensemencement du bacille coli dans un milieu sélectif, où il proliférera mieux et plus vite que les autres sermes. De cette culture primaire, on fait un prélèvement qu'on ensemence sur des milieux solides, sur lesquels il sera facile d'isoler le bacille. |

C'est ainsi que, dans la plupart des laboratoires français, et notamment dans les laboratoires municipaux, On procède à la recherche du bacille coli dans les eaux.

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CPP PTT :

Avec d’autres bactériologistes, nous avons pensé que cette méthode, si elle est commode et rapide, n’est pas à l'abri de toute critique

D'abord, comme dans tous les milieux liquides, il y a lieu de tenir compte de la concurrence vitale, et il faut se méfier de certains bacilles qui, poussant plus mal et moins vite que d’autres, sont étouffés par ces derniers, plus prolifiques, de sorte qu’on ne peut plus les isoler du liquide de culture.

Ensuite, la température de culture (42°) nous paraît élevée, et nous craignons une action inhibitrice, si faible soit-elle, s’apparentant à l’action des antiseptiques.

Enfin et surtout, l'acide phénique a un pouvoir inhibiteur incontestable. C’est ainsi que nous montrons (p. 60) qu’un gramme d'acide phénique ajouté à 1.000 grammes de certains milieux liquides empêche toute culture.

Il n’est donc pas impossible que dans les milieux phéniqués le bacille coli soit, au moins dans certains cas, bactériologiquement en sommeil et inerte, et que, pour nous révéler son existence, il ait besoin d’être transposé dans un milieu plus favorable, par exemple dans l'intestin, où il se réveillera et se retrouvera avec toutes ses propriétés.

Ainsi peut-il arriver de conclure à l’absence du bacille coli dans une eau, alors que cette eau, en réalité, en contient.

MM. Diénert et Etrillart, exposant les causes d’erreur de la méthode de Vincent, vont même jusqu’à écrire qu'avec cette méthode ils ont « maintes fois obtenu des résultats négatifs pour le bacille coli avec des eaux manifestement contaminées ».

Pour isoler le bacille coli, nous avons donc cherché des milieux qui ne présentent pas les inconvénients cités plus haut.

Les milieux que nous avons réalisés, que ce soit en vue de l'hémoculture ou pour la recherche du bacille coli dans les eaux, procèdent du même esprit, s’inspirent des mêmes données, et sont tellement voisins qu’ils sont plutôt des aspects différents d’un même milieu que des milieux différents, ou,

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mieux encore, ne constituent guère qu’un seul et même milieu adapté à des buts différents.

Convaincu, en effet, que la recherche et la numération du bacille coli en milieu liquide présentent certains aléas qu’elles ne connaissent pas en milieu solide, car là — et là seulement — les divers germes ensemencés sont isolés et peuvent pousser rapidement à l’abri de toute concurrence vitale; convaincu des avantages que l’on peut retirer de la culture du bacille coli en utilisant les milieux solides, nous-avons pensé à préparer, en vue des examens bactériologiques d’eau, par exemple, un support fait de gélose et. de gélatine et en proportion telle que ce mélange soit liquide à la température de 42° et solide à une température de 30°.

Ainsi concevions-nous la possibilité d’ensemencer directement l’eau à examiner sur un milieu momentanément liquide, qui, dès l’ensemencement fait, se solidifiant très rapidement, permettrait une culture en milieu solide.

Nous avons donc déjà fait connaître un procédé qui offre les avantages suivants

1° Ensemencement direct de l’eau à examiner.

2° Culture sur milieu solide et qui satisfasse à deux conditions

a) que tous les germes ensemencés soient isolés sur le milieu et puissent se développer isolément (d’où pas de concurrence vitale);

b) que les colonies de bacille coli soient faciles à différencier des autres espèces.

3° Pas de substance antiseptique dont on peut craindre l’action inhibitrice. ee

4° Une culture à basse température.

Ci-dessous exposé, aussi succinctement que possible, notre procédé personnel de recherche, d'identification et de numération du bacille coli dans les eaux, et plus généralement d'analyse bactériologique des eaux.

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Formule de notre milieu et technique personnelle :

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Après dissolution et neutralisation, clarifier au blanc d'œuf, filtrer, ramener à 900 ce.

Ajouter solution filtrée contenant :

ROBE CONÉONMENS. Arias ae cha nec unie der ne 2e. Lessive de soude, dite des savonniers........ Lec: A RS RS ER nn Le 100 ce.

Mélanger. Répartir en plaques de Roux à raison de 45 ce. par plaque. Stériliser à 105° pendant une demi-heure.

Au moment du besoin, faire liquéfier au bain-marie à 42° environ. Ensemencer aseptiquement avec une pipette stérile l’eau à examiner, 1 cc. par exemple. Mélanger. Laisser solidifier horizontalement. Mettre à l’étuve à une température de 25-30°. Au bout de 24 heures, de 48 heures, ou, si l’on veut, de 60 heures, voir les colonies.

Les colonies de bacilles coli apparaissent très nettement sous forme de taches d’un beau bleu clair sur fond rouge croseille. Les colonies de bacille typhique se détachent, elles aussi, très nettement en rouge foncé, mais sont heaucou? plus petites que celles du bacille coli.

Se servir d’une loupe pour plus de sûreté.

Nora. — Si l’on pense que l’eau à examiner doit être très pauvre en bacille coli, on ensemence 10 cc. sur 150 cc. de notre milieu stérilisé, momentanément liquéfié, et contenu dans un ballon. Après mélange, on coulera immédiatement en boîtes de Pétri préalablement stérilisées (en 10 boîtes, si l’on n’a à sa disposition que des petites boîtes de 9 centimètres de diamètre).

On peut aussi centrifuger longuement 50 cc. d’eau dans un tube centrifugeur effilé à sa partie inférieure, gradué, et

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préalablement stérilisé muni d’une coiffe de papier-filtre. La centrifugation opérée, on soutirera au moyen d’un siphon stérile la partie supérieure de l’eau jusqu’à ce qu'il ne reste qu’un volume de liquide compris entre 2 et 1 ce. Pour ensemencer, on versera aseptiquement 15 à 20 cc. de notre milieu liquéfié dans le tube centrifugeur. On mélangera énergiquement par agitation, le tube étant bouché par une rondelle de caoutchouc stérile maintenue par le pouce, et l’on coulera le tout immédiatement en boîte de Pétri. (Centrifuger simultanément dans deux ou quatre tubes : ainsi la recherche portera-t-elle sur 100 ou 200 cc. de la même prise d’eau).

Si l’eau est très chargée de matières minérales, notamment

d'aluminium et de fer à l’état d’oxydes ou d’hydrates, avant

de centrifuger, on filtrera sur filtre-papier stérilisé pour se débarrasser de la plus grande partie de ces substances en suspension, cette simple filtration ne pouvant modifier la flore bactérienne.

Notre milieu et notre technique, tels que nous venons de les présenter, appellent quelques commentaires

1° Dans notre milieu, nous mettons à profit la propriété du bacille coli de faire fermenter les sucres. Il décompose ici le lactose en anhydride carbonique et hydrogène avec formation d'acides lactique, acétique et formique. Ces âcides agissant sur le rouge Congo, très sensible, le font virer au bleu.

Le bacille typhique n’a pas d’action sur le lactose. Il devient rouge foncé en se chargeant de rouge Congo, qui est un colorant vital.

2° Nous avons fait sur notre milieu des expériences très nombreuses. Nous avons notamment cultivé sur ce milieu des eaux dans lesquelles nous venions d’ensemencer à la fois du bacille d’Eberth et du bacille coli. Nous avons toujours vu, au bout de 60 heures au plus, les colonies de bacilles col en bleu clair et les colonies de bacilles typhiques en rouge foncé se détachant les unes et les autres très nettement à l'œil nu, pour peu qu'il soit exercé.

Signalons enfin, et cela est très important, que sur

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notre milieu tous les germes de l’eau cultivent. Ainsi pouvons-nous faire directement et du même coup, non seulement la numération du bacille coli, mais la numération des autres colonies. Cette numération, suivant le procédé courant qu'on emploie sur culture sur gélatine, est d’une facilité extrême. Au bout de quelques jours, si les colonies sont peu nombreuses, on les compte une à une sur toute la plaque après avoir divisé la plaque en secteurs égaux par des traits au crayon gras. Si les colonies sont très nombreuses, on compte les germes de deux secteurs sensiblement aussi riches en bacilles. On fait la moyenne des deux numérations, on multiplie le chiffre par le nombre des secteurs, et l’on rapporte la numération au centimètre cube pris comme unité.