CHAPITRE" "TITI TECHNIQUE NÉPHÉLÉMÉTRIQUE PERSONNELLE

1 — Dosage des Protides totaux.

La technique que nous proposons résulte de nos recherches tendant à satisfaire à la double nécessité de disposer :

a) d’un bon procédé de précipitation quantitative b; de troubles stables et homogènes.

a) Procédé de précipitation è

C’est essentiellement pour parer à l'inconvénient du tassement du précipité protidique au sein du liquide que nous avons imaginé :

1) d'éviter la précipitation par des réactifs chimiques d’action toujours brutale, tels que les acides forts employés ; 2) de provoquer cette précipitation au sein d’un liquide de densité élevée.

De cette façon, pensions-nous, les particules solides seraient maintenues en suspension homogène durable.

C'est ainsi que nous avons été conduits à envisager la précipiation par la chaleur en milieu neutre - ou faiblement acide - en présence d’un électrolyte dont la concentration serait assez forte pour lever notablement la densité du liquide à étudier. Le sel qui s’alaptait parfaitement à cette condition était le sulfate de magnésium, lont la très grande solubilité dans l'eau froide fournit des solutions le densité élevée à pH neutre.

Nous avons donc commencé nos essais avec une solution queuse saturée à froid de sulfate Mg cristallisé pur de densité 1,28 à 15°.

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Les essais préliminaires ont porté sur des solutions de protéine: sanguines provenant d'un mélange de sérums normaux Nous avon: fait une première dilution du sérum à l’eau physiologique suivie d'une deuxième dilution au 10: dans la solution magnésienne de façon à réaliser, dans les liquides mêmes qui serviront à l'évalua: tion opacimétrique, des concentrations en protides s’échelonnant de 0 gr. 10 à 0 gr. 40 pour mille au maximum. Les tubes à réaction sont alors mis au bain-marie à 160’ pendant 13 minutes puis retirés et refroidis sous un courant d’eau. :

b) Aspect des troubles obtenus :

À ce moment, on constate à l'œil nu que les flocons de protéines précipitées remis en suspension par une bonne agitation se dispersent dans le liquide qui se présente alors, non pas comme une suspension granuieuse à conglomérats visibles, mais comme une solution opalescente, très homogène, dans laquelle il est im possible de distinguer des grains séparés. De plus, l'émulsion reste Stable et, après 24 heures de repos, elle présente encore le même aspect homogène sans aucun dépôt dans le fond du tube.

Nous avons appliqué cette méthode aux solutions de protéines d'origines les plus diverses : LCR, liquides d’ascite, pleuraux, urines, avec des résultats exactement semblables.

Ainsi, au moins quant à l'apparence et sous bénéfice d'un inventaire plus détaillé (dont il sera fait plus loin une analyse poussée lors de l'établissement de la courbe d'étalonnage:, les troubles obtenus paraissent remplir les bonnes conditions déjà définies.

Restait à déterminer les possibilités de la méthode au regard de plusieurs facteurs importants : |

— précipitation quantitative

— influence des lipides

— influence du pH

— rapport sérine-globuline.

1) Précipitation quantitanve.

… Elle l’est en effet. La réaction terminée, sur la suspension soigneusement filtrée jusqu'à obtention d'un filtrat absolument limpide, on fait la recherche des protéines par les réactifs sensibles :

acide trichloracétique, réactif du biuret, réactif de Tanret. La recherche est parfaitement négative. Hi

21 Influence des limdes.

Le taux des lipides n'a pas eu d'incidence sur les résultats, comme nous le montrerons plus loin dans la confrontation des résultats de notre méthode avec la méthode pondérale. Notamment

ARE r NA Er

dans un sérum de néphrose lipoïdique, le chiffre trouvè par notre procédé était de 53 Gr alors que la pesée donnait 54 Gr, 30 pour mille.

3) Influence du pH.

| Elle nous a été perceptible lorsque nous avons étudié l’influjence du vieillissement des sérums ou de leurs solutions sur la valeur opacimétrique des troubles. En effet, si l’on procède à des mesures | de sur des dilutions de sérum effectuées immédiatement après le prélèvement, puis à des intervalles de huit, seize, vingt-quatre et quarante-huit heures, on constate que les densités optiques sont des chiffres régulièrement décroissants. La possibilité d'une protéolyse ou autre altération étant éliminée par la conservation du sang en glacière.

L'explication qui s'impose est que le pH du sérum fraîchement recueilli, très voisin de la neutralité : 7,3— 7,4, tend à augmenter progressivement jusqu'à 8 par perte du CO2 dissous. À ce moment, lalcalinisation du milieu devient un obstacle empêchant la précipitation totale des protides par la chaleur. On peut d’ailleurs confirmer expérimentalement ce fait en modifiant dans le sens de l’alcalinité le pH d’une solution de sérum par addition ménagée de carbonate de soude. Le chiffre réel est restitué si on rétablit la neutralité.

De même si l’on veut doser l’albumine dans des nrines alcalines. En conséquence, nous avons pris le parti d'opérer à pH fixe, très faiblement acide, soit à 6,6 en ajoutant au liquide une quantité déterminée de tampon acéto-acétique de formule suivante : acide acétique N/5 4 ce acétate Na M5 96 cc

4) Rapport sérine-globuline.

Il est essentiel de déterminer dans les méthodes de dosage

global des protéines avant toute séparation si l’albumine et les globulines ont, à poids égaux, des actions identiques.

Nous avons vu, à propos de l’azotométrie, que les coefficients de transformation de l'azote en protéine sont sensiblement différents pour les deux constituants du sérum, et que si, pour des sérums normaux il est possible, sans sacrifier à l'exactitude, de se servir d’un coefficient moyen, pour les sérums pathologiques - et ce sont eux dont l'étude est la plus demandée et la plus intéressante - pareil artifice ne peut être employé. Cette remarque a une valeur générale.

En ce qui concerne notre technique, les vérifications que nous avons effectuées montrent que l’albumine et la globuline fournissent effectivement, à poids égaux, des réactions semblables, c'est-à-dire des opacités égales.

Nous avons donc préparé à partir d’un mélange de sérums frai préalablement étalonné par gravimétrie des solutions séparées, don titrées, d’albumine et de globulines, en utilisant la méthode clas sique de séparation au sulfate d'’ammonium. Nous avons appliqu: notre technique sur des dilutions croissantes et définies de ces deu: liqueurs et nous avons constaté que les courbes obtenues sont su perposables, c'est-à-dire qu'à une densité optique donnée corres: pond le même chiffre de sérine et de globulines.

En conclusion, quelles que soient dans une $olution protéinique les proportions respectives de sérine et de globulines, le dosage des prOÉtnEe totales effectué à l’aide de notre technique demeure vaable.

Technique arrétée :

Sérum dilué à l’eau physiologique au 1/20e Occ,2

Solution saturée à froid de sulfate Am Occ,l Tampon acéto-acétique Occ,1 Solution sulfate Mg d=—1,28 1cc,6

N.-B. — L'addition de sulfate d'Am n’a d'autre but que d’accentuer l'aspect opalin de la supension, ainsi que nous avons pu le remarquer en faisant le dosage de la sérum-albumine seule.

Les liquides sont mis dans l'ordre dans un tube à hémolyse. que l'on bouche au bouchon de caoutchouc pour éviter la perte d’eau par évaporation. Bain-marie 4000 pendant 15 minutes, refroi-| dissement et lecture au photo-colorimètre de Bonnet-Maury à, l'écran 15 avec rallonge. Les densités optiques s'expriment en degrés Vernes.

L'aspect des suspensions obtenues rappelle celui de l’émulsion de l’antigène de Bordet-Ruelens préparée suivant une marche inversée (en versant l'antigène dans l’eau physiologique) ou à une. émulsion microbienne de cocci. Au microscope, une goutte de la suspension montre des agrégats très petits, mais pas de floculats semblables à ceux que l’on rencontre dans les séro-agglutinations microscopiques positives. |

Il nous semble avoir réalisé ces suspensions bleutées et non. blanches dont Dognon dit qu'elles sont celles qui se prêtent le mieux à une mesure précise d'opacité.

Courbe d'étalonnage :

La courbe d'étalonnage qui nous permet de trouver pour une densité optique donnée le chiffre des protéines totales du sérum a été établie à partir d’un mélange de sérums dont le titre a été déterminé par gravimétrie.

Le ar

dl 2

Pour fixer la dilution finale à laquelle se feraient la précipitation puis la lecture, nous nous sommes référés à la nécessité-soulignée plus haut-d’opérer sur des concentrations en particules suspendues assez faibles, de manièreànoustrouver danslecasoù la loi Beer-Lambert puisse s'appliquer. Après plusieurs essais, cette concentration correspond à une dilution au 200e dont nous avons déjà fait état par anticipation pour faciliter notre exposé.

Nous avons déterminé 14 points de la courbe s’échelonnant depuis le taux de 6 gr. 50 à 84 gr. 50 de protides totaux par litre. En portant en abcisses les chiffres de protéines et en ordonnée les D. O. correspondantes, nous obtenons ie graphique dont nous donnons la repoduction (1) .Ainsi qu’on peut le voir, c’est une fonction qui suit à très peu près la loi de Beer-Lambert.

Confrontation avec les méthodes éprouvées :

La méthode qui nous a servi d’étalon : la gravimétrie, constituera

la seule référence propre à juger la valeur propre à notre technique.

Voici un tableau des comparaisons que nous avons faites ; Tubes 1 2 3 4 5 6 fl 8 Gravimétrie 79 16,0 54,5 67,8. 64,4 82.4 18,8 8,4 Notre technique :

lé LMD APR Si: 62.286 ILE, 65 2 /ORRIES 5 19,2 8.7 Les sérums correspondants aux tubes 1 et 2 sont des sérums

[normaux

Le » » » 3est un sérum denéphrose Le » » » 4 « cirrhose du [foie

Le tube 5 appartient à un cancer de l’estomac Les autres sont des dilutions de sérums normaux. On peut constater que dans cette gamme de liquides aux teneurs

| en protéines les plus diverses, dans les sérums pathologiques, les dif- | férences sont d’un ordre très petit qui s'expriment par un éclat relatif | de 1, 5 à 3 % au plus. La concordance est donc aussi bonne qu’il est | possible de le souhaiter.

: Application aux autres liquides biologiques.

La technique convient, nous l’avons vu, au dosage des protéines des liquides autres que le sérum. Il suffit d’ajuster les dilutions dans

! les limites des concentrations en protides dans la liqueur qui servira

à la mesure, limites comprises entre 0 et0 gr. 40 pour mille. On se servira de la courbe d'étalonnage établie pour le sérum : pour le calcul, ou tiendra compte de la dilution choisie en se rappelant que cette

courbe a été construite en fonction d’une dilution au 200e.

a) Lipides de ponction : ascite, plèvre, synovie :

1) Voir graphique page 39.

La dilution finale se fera ici au 100e : à savoir une première du liquide pur à l’eau salée, puie une deuxième avec les réactifs au dixième ésalement.

Pour la lecture des résultats sur la courbe, diviser les chiffres trouvés par 2.

b) Liquide céphalo-rachidien :

Notre procédé présénte le grande avantage de pouvoir porter sur de très petites quantités de liquides : 0 cc 3. On fait une dilution unique au quart soit : <

Soit : LCR O:ce.5 ou 0 cc 3

Sulfate Am RTE | ou Occ1 Tampon Occ1 ou Occ1 Sulfate Mg 4'cc3 ou O'ÉeT

Diviser les résultats par 200/4, soit par 50.

c) Urines Même mode opératoire que pour le LCR.

Si les urines étaient très riches en albumine, on élève la dilution au [/8e ou au 16e. Pour l’expression des résultats, diviser par 200/8 ou 200/16.

Dans le cas d’urines fortement alcalines vérifier que la quantité de tempon suffit à amener le liquide au pH voulu, sinon augmenter à Oce2 où Occ3 le volume de solution acéto-acétique.

N.B. — Il est évident que notre technique peut être parfaitement utilisée en vue de l'évaluation diaphanométrique à l’œil nu par comparaison du trouble à apprécier avec des gammes étalons. Elle constitue. dans le cadre même de cette méthode un pas très sensible vers plus de précision, parce qu’elle présente à la lecture visuelle des suspensions très Stables et homogènes. Elle est recommandable dans les cas où une bonne approximation suffit aux besoins de la clinique, quand on ne possède pas de photomètre.