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et un pansement en rapport avec cette petite intervention chirurgicale.

Autant que possible il faut fixer la pièce anatomique immé-

diatement après son prélèvement. Mais lorsque celui qui a pratiqué une biopsie n’est pas histologiste, comment'doit-il la faire parvenir au laboratoire où il désire la faire examiner ? Si la pièce peut être reçue moins de 12 heures après son ablation, il vaut mieux ne la mettre dans aucun liquide, car une fixation défectueuse compromet souvent toute recherche ultérieure. Il ne faut pas davantage la placer, comme en ont tendance nombre de chirurgiens, dans de la gaze stérilisée parce que la gaze absorbe le sang, la lymphe, la sérosité et que la pièce arrive alors au laboratoire toujours exsangue, parfois desséchée, raccornie et inutilisable.

La biopsie doit donc être placée dans un petit flacon bien sec et soigneusement bouché, ou bien encore dans un fragment de tissu imperméable replié sur lui-même et assez lâchement attaché pour que le fragment excisé ne soit pas comprimé. La pièce peut rester ainsi plusieurs heures en parfaite conservation et sans rien perdre des liquides qu’elle renferme.

Si, au contraire, la pièce ne pouvait parvenir au laboratoire avant dix ou douze heures (1), elle ne doit être envoyée que préalablement fixée: Le liquide fixateur, que nous considérons de beaucoup comme le meilleur, est le liquide de Dominici dont nous donnons plus loin la formule. Il peut se faire que le dermatologiste non outillé pour la technique histologique n'ait pas le

-4. Nous indiquons ce temps de dix à douze heures afin qu’en suivant notre recommandation on ne s'expose jamais à un mécompte. Mais en réalité, ce temps peut être facilement doublé. Nous avons reçu récemment, par la poste, des pièces anatomiques envoyées du Pas-de-Calais à Paris, simplement expédiées dans un petit flacon sec et bien bouché. Nous avons fixé ces pièces vingt-sept heures après leur prélèvement sur les malades. À l’examen histologique nous avons constaté que ces pièces nous étaient parvenues dans un excellent état de conservation. Les caractères cytologiques les plus délicats des diverses variétés cellulaires pouvaient être fort bien mis en évidence.

temps ou le moyen de le préparer. Voici une autre formule du liquide de Dominici que notre maitre emploie pour des examens extemporanés et qui peut être faite facilement par tout praticien ayant à sa disposition de la teinture d’iode-et une solution aqueuse saturée de bichlorure de mercure. On verse dans un

flacon la quantité de solution de sublimé, jugée nécessaire (soit

200 cc.) et on ajoute goutte à goutte de la teinture d'iode, en agitant le liquide, jusqu'à apparition d'une belle teinte jaune. Le fixateur est prêt à recevoir la pièce qui y séjournera de 4 à 5 heures suivant son volume. Si l’on a à sa disposition du formol du commerce à 40 0/0 il sera mieux encore d'ajouter pour

-100 ce. du liquide fixateur ainsi obtenu 10 à 12 cc. de formol.

Au sortir du fixateur, c’est-à-dire au bout de 4 à 5 heures, la pièce est mise dans l'alcool à 60° ou à 90° où elle peut se conserver des jours et des semaines et être envoyée ainsi dans de

- très bonnes conditions au laboratoire.

Si le dermatologiste n'avait pas La possibilité de faire le liquide de Dominici, ainsi simplifié, ou de changer la pièce en temps

voulu, il faudrait faire la fixation au liquide de Bouin dont voici

la formule :

Solution aqueuse d’acide picrique. . . . 30 cc. Formolducommerce ET 0 Ce:

Aoide acétique cristallisable . . . . . 2 ce,

On peut toujours avoir une provision de ce liquide chez soi car il n'est pas nécessaire qu’il soit préparé extemporanément. Les pièces peuvent y être non seulement fixées, mais encore conservées. Son usage est donc très commode, mais c’est à ce titre seulement que nous le recommandons, car bien que ce soit un fort bon fixateur il ne nous à pas paru valoir le liquide de

Dominier.

Quant à l’alcool dans lequel nombre de médecins ont coutume de mettre leurs pièces anatomiques nous considérons que c’est, actuellement, l'un des plus mauvais fixateurs que l’on puiss emplover.

Fixation.

Nous avons essayé différents réactifs fixateurs, l'alcool, le bichromate de potasse, l'acide osmique, le liquide de Flemming, le liquide de Bouin, le sublimé acétique, le formol, en les comparant toujours au liquide fixateur de Dominiei. Nous avons trouvé ce liquide si nettement supérieur à tous les autres que nous n’en employons plus d'autre, non seulement pour les recherches de cytologie fine, mais même pour la technique courante (1).

. Voici la formule qui nous semble donner les meilleurs résultats. Il faut la préparer au moment de s’en servir :

Mettre dans une capsule de porcelaine contenant une quantité d'eau à peu près égale à la quantité de fixateur que l’on désire faire (soit 250 ou 300 cc.) un notable excès de bichlorure de mercure (2). Faire dissoudre le sublimé à une température égale ou supérieure à 60°, puis laisser refroidir à 40°. On constate que la solution est saturée car il se forme des cristaux de sublimé par refroidissement. On décante ou l'on filtre la solution encore chaude (40°) et l’on ajoute goutte à goutte de la teinture d'iode tout en agitant vivement. Le liquide reste d’abord incolore car l’iode se combine au bichlorure de mercure, puis peu à peu le liquide se teinte, l’iode restant simple-

1. Le liquide de Dominici formé en additionnant diode du bichlorure de mercure est essentiellement un mélange de bichlorure de mercure, d’iodochlorure de mercure et diode libre. À ce mélange peuvent être ajoutés de l’acide osmique, de l'acide chromique, des bichromates, de l’acide acétique, du formol, de l'acide picrique, de l’iodure de potassium, etc... Il en résulte que de très nombreuses variantes de ce liquide . peuvent être imaginées. Notre maître M. Dominiei et nous-mème en avons essayé de multiples combinaisons qu’il serait oiseux de décrire ici.

2, IL n’y a pas à craindre de perdre le sublimé mis en excès dans la capsule. Lorsque l’on a décanté la solution refroidie, il suffit de recouvrir d'une plaque de verre la capsule contenant le dépôt de sublimé en excès. Il peut servir à nouveau.

ment à l'état de mélange. On continue d’ajouter de l'iode jusqu’à ce que le liquide prenne une belle teinte jaune orangé. IL ne doit pas se former de précipité. Si l’on ajoute trop diode il peut s’en produire un; il n'y à alors qu’à filtrer, mais souvent le liquide filtré est nettement rouge et il.y a un excès diode. Il faut alors ajouter du sublimé car l'excès d’iode est à éviter ; il est susceptible en effet de provoquer des altérations cellulaires.

Le liquide étant franchement jaune orangé on ajoute 12 parties de formol du commerce à 40 0/0 à 100 parties de l’iodochlorure de mercure iodé ainsi formé. Le liquide est dès lors terminé, sa température doit être voisine de 37°, car il s’est refroidi pendant les manipulations et on peut y plonger les pièces que l’on désire fixer. Quand on ajoute le formol le liquide pâlit légèrement, il est bon parfois de l'additionner de nouveau de quelques gouttes de teinture d'iode pour lui rendre la teinte voulue.

Le flacon contenant le liquide de Dominiei et les pièces anatomiques peut être laissé à la température ordinaire du laboratoire. Nous l’avons mis assez souvent dans l’étuve à 370. La fixation excellente dans le premier cas est peut-être encore meilleure dans le second ; mais surtout la pénétration parait plus rapide et la durée de la fixation peut être légèrement abrégée.

La durée de la fixation varie naturellement suivant l’épaisseur des pièces : deux ou trois heures suffisent pour une très petite pièce, quatre ou einq heures représentent une bonne moyenne, les petites pièces ne sont pas surfixées, les grosses sont parfaitement pénétrées.

Au cours de la fixation le liquide se décolore. On maintient sa teneur en iode en ajoutant de temps en temps quelques gouttes de teinture d'iode, mais il faut toujours se défier de l'excès d'iode et il vaut mieux pécher par défaut que par excès.

La quantité de fixateur doit toujours être relativement considérable par rapport au volume des pièces qu’on y immerge afin que la formule du fixateur reste aussi constante que possi-

ble pendant toute la durée de la fixation. 200 cc. sont une bonne quantité pour une biopsie.

Au sortir de l’iodochlorure les pièces sont placées dans l’alcool à 90° et elles y sont laissées jusqu’au moment où l’on pratiquera l'inclusion. Il y a tout intérêt à ce que celle-ci ne soit pas trop diftérée, l’action de l'alcool, nécessairement plus ou moins chargé de sublimé, pouvant être nuisible à la longue.

Récemment nous avons étudié comparativement sur des fragments pris sur les mêmes pièces la fixation ainsi obtenue parle séjour habituel de cinq heures dans l’iodochlorure et la fixation prolongée pendant 12 et 15 heures. Dans ce dernier cas nous lavions à l’eau courante pendant 48 heures les fragments qui avaient subi la fixation prolongée, puis ils étaient inclus et colorés comme les précédents. Ce procédé est moins rapide et ne doit donc être choisi que si l'examen que l’on désire faire n’est pas pressé ; mais dans ce cas il nous semble devoir être utilisé de préférence. Certains détails, notamment les granulations neutrophiles des polynucléaires ordinaires sont alors beaucoup plus faciles à mettre en évidence.

Voici une autre formule qui est très recommandable et qui nous a donné de forts beaux résultats ;

Sublimé saturé à 60° et refroidi à 400 . . . . 100 cc. Teinture d’iode ajoutée goutte à goutte . . . q- S. Formol du commerce à 40 0/0 . . . . . . 12 ce. Acide acétique cristallisable . . . . . . . D=CC*

. En raison de l'acide acétique la pénétration est beaucoap plus rapide et la durée de la fixation doit être notablement diminuée. Trois heures suffisent à fixer une pièce que l’on eût laissée quatre heures dans l’iodochlorure non additionné d'acide acétique.

Si l’on veut étudier la graisse on peut allier l'acide osmique à l'iodochlorure ou employer l'acide osmique ultérieurement. Voici comment on peut alors procéder. La pièce fixée au liquide de Dominici est lavée à l’eau puis on en détache au rasoir une coupe épaisse de 1/2 millimètre que l'on rince encore à l'eau distillée et que l’on met noircir pendant 6 à 12 heures dans le

Rubens Duval 0

liquide de Flemming ou dans l'acide osmique à 1 ou 2 pour 100.

Sauf ce cas particulier les pièces sont placées, au sortir du fixateur, dans l'alcool à 60° ou à 90° en attendant de les inclure. Si l'on veut faire l'inclusion rapidement, on peut les mettre directement dans l’alcool absolu ou dans l’acétone.

Inclusion

La très grande majorité de nos pièces ont été incluses à la paraffine. Nous avons longtemps hésité entre le collodion et la paraffine, mais actuellement nous employons presque exclusivement l'inclusion à la paraffine.

L'inclusion à la paraffine est plus rapide (1) et moins coûteuse que l'inclusion au collodion ; les coupes sont plus faciles à pratiquer, on peut les obtenir plus minces, plus étendues et plus régulières. On peut les recueillir en rubans et les disposer en série. Enfin les coupes collées sur lame se prêtent à beaucoup plus de manipulations que les coupes au collodion qu’il faut nécessairement porter de godets en godets dans les divers réactifs histologiques.

En raison de sa commodité la méthode d’inclusion à la paraffine est donc supérieure à celle au collodion. Mais certains histologistes rejettent la paraffine qu'ils accusent, même lorsqu'elle est fort bien maniée, de ne pas respecter aussi bien que le col- * lodion les structures délicates. C’est là un point qu’il importe d'envisager car il prime tous les autres.

Soit une pièce dont une moitié a été incluse au collodion et les coupes colorées dans les godets, et dont l’autre moitié a été incluse à la paraffine et les coupes collées sur lames. Si nous comparons les préparations fournies par ces deux séries de coupes il est évident que les coupes au collodion sont supérieures. En effet les cellules des coupes au collodion ne sont nullement modifiées dans leur forme ni dans leurs rapports et les parties

1. Surtout si l’on déshydrate à l'acétone et si l’on passe directement dans la paraffine dure.

les plus délicates sont parfaitement ménagées. Sur les coupes collées sur lames les résultats sont bons aussi, mais assez souvent cependant les cellules paraissent un peu étalées, elles sont tassées les unes contre les autres, sur un seul plan ; la coupe manque de relief, de fins détails enfin peuvent être plus ou moins masqués par suite de l’aplatissement général de la coupe.

Si nous nous en tenions à cet examen nous devrions conclure à la supériorité du collodion. Mais nous avons comparé moins une inclusion au collodion à une inclusion à la paraffine qu'une coupe qui n’a cessé de flotter librement dans des liquides à une coupe qui a été étalée et collée sur une lame de verre où on l’a laissée sécher.

Si, suivant la pratique qui nous a été indiquée par M. Dominici, nous pratiquons sur notre bloc de paraffine de nouvelles coupes et que nous les portions immédiatement dans un godet de xylol pour enlever la paraffine et de là dans un godet d'alcool absolu pour éliminer le xylol et que nous les traitions alors de godet en godet comme nous avons fait pour le collodion, nous obtenons des préparations qui ne le cèdent en rien à celles pratiquées après ce mode d’inclusion. Les cellules ne sont n1 étalées, ni tassées, tous les plans existent, la coupe garde son relief et les plus fins détails sont mis en valeur avec la plus grande netteté.

Ainsi donc certaines modifications attribuées à l’inclusion à la paraffine relèvent du collage des coupes sur les lames de verre où elles ont une certaine tendance à se tasser. Il en résulte que l'inclusion à la paraffine n’est pas inférieure au collodion pour l'étude cytologique fine. Elle a en outre les avantages de la commodité et des coupes sériées (1).

Bien plus, sur certaines coupes collées sur lames, provenant

1. Aussi actuellement nous collans toujours sur lame (avec l’albumine de Mayer) un certain nombre de coupes qui nous donnent la topographie générale des lésions et qui permettent les colorations et les manipulations les plus variées, tandis que d’autres coupes sont immédiatement plongées dans le xylol puis conservées dans l’alcool et servent à l'étude histologique fine.

d'ailleurs le plus souvent de blocs de paraffine qui se coupent mal, la pièce étant insuffisamment pénétrée, on constate des altérations beaucoup plus marquées. Non seulement les cellules sont étalées et tassées, mais encore elles sont desséchées, les noyaux et les protoplasmes sont déformés. On dit alors que la pièce est cuite, on inerimine le séjour à l'étuve, on pense que les pièces y sont restées trop longtemps ou que la température de l’étuve était trop élevée. Cependant si de la pièce qui a fourni ces mauvaises préparations on fait encore quelques coupes et qu’on les colore immédiatement dans des godets sans les coller on constate que toutes ces altérations ne se retrouvent plus. On avait donc attribué à l’action du bain de paraffine dure une altération due uniquement à la dessication d'une coupe mal pénétrée.

Avant d’avoir fait cette remarque nous étions toujours obsédé par la crainte de cuire nos pièces, aussi nous craignions les bains de paraffine trop chauds, et nous risquions d'employer une paraffine à peine fondue ; nous redoutions les séjours trop prolongés et nous n’obtenions que difficilement des pièces bien pénétrées de paraffine. Nous nous sommes assurés que des tissus délicats tels que ceux de la rate et de la moelle osseuse peuvent rester 3 heures dans un bain de paraffine à 54° centigrades sans subir de ce fait la plus minime altération.

En résumé l’inclusion à la paraffine ne le cède en rien à l'inclusion au collodion. Ceci n’est vrai toutefois que si l’on compare au collodion des inclusions à la paraffine bien réussies.

Lorsque l'inclusion à la paraffine n'est pas bonne, non seulement les coupes collées sur lame s’altèrent par dessication, mais encore on ne peut très souvent les utiliser pour les colorations dans les godets. En effet, lorsque les pièces se coupent mal, le rasoir du microtome ne tranche pas nettement, mais rabote en quelque sorte le bloc de paraffine. Il en résulte que les attaches délicates, qui relient entre eux les éléments des tissus fragiles, sont rompues et lorsque l'on enlève par le xylol la paraffine qui servait de support aux coupes, celles-ci se désagrègent en une poussière qui tombe au fond du godet et on ne peut plus uti-

liser que les débris qui correspondent aux tissus les plus résistants et les plus homogènes, tels que l’épiderme ou les blocs de sclérose.

Il importe donc d'obtenir d’excellentes inelusions à la paraffine. En ce qui concerne la peau, ce n’est pas chose aisée. Nous pensons toutefois y être parvenu.

Nous avons essayé différentes variantes de l'inclusion après déshydratation par l'alcool absolu et passages dans le xylol ou l'essence de cèdre, dans le xylol-paraffine, l’éther-paraffine, ou la paraffine à 36°. Telle a été notre pratique pendant plusieurs années et nous en avons obtenu d'excellents résultats. Mais cependant, surtout en ce qui concerne la peau, ces procédés donnent assez souvent lieu à des mécomptes et nous les avons abandonnés.

Voici la technique que nous employons actuellement (1). Au sortir de l'alcool à 60° ou même directement au sortir de l’iodo-chlorure les pièces sont mises dans l’acétone (2) après avoir été débitées en tranches de 1 à 3 millimètres d'épaisseur environ. Elles y séjournent au moins 24 heures et si l’on prévoit que le fragment cutané que l’on désire couper est de ceux qui sont particulièrement difficiles à inclure (3) il ne faut pas crain-

4. Nous devons la connaissance de ce procédé à M. Dalous qui l’emploie avec succès depuis longtemps. Nous sommes heureux de le remercier ici de son obligeance. L'auteur du procédé nous est inconnu. Il semble que ce soit Berdal qui ait introduit l’acétone dans la technique des inelusions à la paraffine.

2. L’acétone doit être anhydre. Elle l’est suffisamment si elle ne trouble aucunement le xylol. Pour vérifier si l’acétone ne trouble pas le xylol il ne faut pas mélanger à parties égales le xylol et l'acétone dont on fait l'essai. Dans ces conditions il pourrait ne se produire aucun trouble alors qu’il pourrait être manifeste si à un centimètre cube de xylol on ajoute seulement quelques gouttes d’acétone. Le trouble ainsi produit disparait si l'on ajoute un excès d’acétone. Une acétone troublant aussi faiblement le xylol ne doit pas être employée.

3. En règle générale la peau normale ou peu modifiée est plus difficile à inclure que la peau très infiltrée. L’abondance du tissu cellulaire lâche est aussi un grand obstacle.

dre de les y laisser 48 heures. M. Léon Tixier nous à en effet indiqué, que pour un tissu difficile à inclure (thymus), il était nécessaire de prolonger ce temps l'immersion dans l’acétone, pour obtenir une bonne inclusion. Nous avons vérifié l'exactitude “de sa remarque, en ce qui concerne la peau. Si une lame d'un fragment cutané épaisse de 2 millimètres s’inclut mal après un séjour de 24 heures dans l’acétone, ce n’est pas en détachant sur le morceau, resté en réserve dans l’alcool à 60°, une lamelle de moins de 1 m/m d'épaisseur, que l’on obtiendra une meilleure inclusion, mais en laissant le nouveau fragment le double de temps dans l’acétone.

La durée du séjour dans l’acétone doit donc être proportionnée plus à la résistance présumée du tissu à la pénétration qu’à l’épaisseur du fragment (à condition toutefois que celle-ei soit modérée). C'est ainsi, que trois heures suffisent pour déshydrater une rondelle de moelle osseuse fémorale de lapin de même épaisseur qu'un fragment cutané, quine pourra être bien inclus, qu'après un séjour de 48 heures dans l’acétone.

Ce séjour de 48 heures n’altère aucunement les éléments cellulaires fixés par l’iodochlorure. Nous avons eu le soin de nous en assurer.

L’acétone doit être renouvelée une à deux fois pour que la déshydration soit convenable.

De l’acétone les pièces sont portées directement dans le bain de paraffine dure fusible à 54° placé dans une étuve réglée à 55° pour que la paraffine soit parfaitement liquide. Nous avons indiqué plus haut, que des altérations attribuées à la cuisson sont dues, en réalité, à une dessication ultérieure des coupes collées sur lame, lorsque la pièce a été insuffisamment pénétrée. Ce n’est donc pas la cuisson qui est à craindre, mais le défaut de pénétration. Si les fragments de peau ne dépassent pas 2 millimètres d'épaisseur et si leur déshydratation est parfaite, il suffit le plus souvent d’un séjour de 3 heures dans le bain de paraffine pour qu’ils soient complètement pénétrés.

Ce séjour de 3 heures dans le bain de paraffine dure paraîtra peut-être d’une durée très exagérée, et cependant ce n’est qu'ex-

ceptionnellement que nous laissons nos pièces aussi peu de temps. Actuellement, en effet, nous ne sommes plus obsédés de la crainte de cuire nos pièces, et nous prolongeons le bain de paraffine toute la nuit, soit environ 12 heures. Nous évitons ainsi à coup sûr les pénétrations incomplètes et nous ne relevons jamais aucune altération artificielle imputable au bain de paraffine.

Mais ceci n’est vrai que si la température du bain de paraffine reste constante oscillant au plus de 54° à 56° degrés centigrades. Or la température des étuves est en général fort mal prise. En effet le thermomètre est ordinairement suspendu dans l’air de l'étuve et non plongé dans le bain de paraffine ; il indique par suite la température de l’air et non celle de la paraffine fondue. L'écart entre ces deux températures peut être considérable. Ainsi dans une étuve munie d’un thermomètre suspendu et exactement réglée à 54°, la température du bain de paraffine s'élevait en réalité à 62°, Depuis cette constatation, l'étuve dont nous nous servons est réglée sur un thermomètre placé à demeure dans un flacon de paraffine, situé sur le même plateau que les capsules où se trouve la paraffine qui sert aux inclusions et nous n'avons plus jamais eu d’altérations imputables à l’action de la chaleur.

Voici, en résumé, comment nous procédons actuellement. Une pièce fixée 5 heures à l’iodochlorure est placée au sortir du fixateur jusqu'au lendemain dans l'alcool à 60°. Le lendemain elle est débitée en tranches de 2 à 3 m/m d'épaisseur. Celles-ci sont mises dans l’acétone où elles séjournent environ 48 heures. Pendant ce temps l'acétone est changée deux ou trois fois. Les pièces sont alors immergées (1) dans le bain de paraffine dont

4. Nous disons que les pièces sont immergées dans le bain de paraffine. Si on ne les immerge pas jusqu'au fond du bain de paraffine, il arrive quelquefois que le fragment à inclure, imbibé, d'acétone flotte à la surface du bain de paraffine. L’acétone s’évapore alors très rapidement et la pièce se dessèche. On n’a plus ensuite que l'inclusion d'un tissu raccorni et profondément altéré, inutilisable. Il importe donc de plonger le fragment en pleine paraffine et de s'assurer qu'il ne remonte pas à la surface. Au bout de quelques instants toute surveillance est inutile, dès qu’il a commencé à s’imbiber de paraffine il ne revient plus flotter.

24 CYTOLOGIE DÉÈS INFLAMMATIONS CUTANÉES

la température est de 54° et elles y restent la nuit soit 10 à 12 heures. Enfin elles sont coulées dans un moule à paraffine. ILest de la plus élémentaire prudence, quand les dimensions de la pièce le permettent, de ne pas faire tout inclure d'un coup et de garder une partie de la pièce dans l'alcool à 60° pour pouvoir recommencer une nouvelle inclusion si un accident se produit.

Colorations.

Nous n'avons pas fait porter nos recherches sur la graisse, sur le glycogène, ni sur les éléments nerveux. Nous ne dirons donc rien des techniques qui permettent de les déceler (1).

Voici par contre quelques remarques à propos de certaines des colorations que nous avons employées.

1° Eosine, orange, bleu de toluidine. — Cette coloration due à Dominici est la plus importante. C’est celle qui permet le -mieux d'étudier l’état basophile ou acidophile des cellules et les caractères des granulations leucocytaires. C’est la coloration cytologique par excellence.

Nous renvoyons au livre de Dominici pour l'exposé général de cette coloration et nous n’en disons que ce qui est relatif à la coloration de la peau.

Les coupes sont laissées dans l’éosine orange environ une heure, puis lavées à l’eau filtrée ou à l’eau distillée, pendant quelques instants, jusqu’à ce que l’eau de lavage ne se teinte plus par l'éosine. Elles sont alors portées dans une solution de bleu de toluidine à 1 0/0 pendant une minute, de facon que la coupe soit colorée à fond dans toute son épaisseur.

Après le bleu de toluidine on peut :

a) ou bien, à la manière de Dominici, laver et décolorer aussi lentement que possible à l'alcool absolu en jetant de

1. On les trouvera dans les ouvrages classiques. Ranvier. 7raité technique d'histologie. — Bolles Lee et Henneguy. Méthodes techniques de

l'anatomie microscopique. — Æncyclopädie der mikroskopischen Technik. R. Krause. Berlin.

temps en temps l'alcool qui s’hydrate et en le remplaçant par de l’alcool absolu. Quand on pense la décoloration près du terme, on repasse encore une fois de l’alcool absolu pour terminer la déshydratation, puis du xylol et on monte à l’huile de cèdre. On examine alors au microscope. S'il y a un excès de bleu, on enlève l’huile par le xylol et on revient à l'alcool absolu, mais en se souvenant que la décoloration par l'alcool absolu est plus rapide après l’action de l'huile de cèdre et en surveillant encore de plus près. S'il y a un gros excès de bleu on peut activer la décoloration en employant de l’alcool à 90° ou de l'alcool à 60°. Plus un alcool est faible et plus son action décolorante sur le bleu de tolnidine est accusée. Mais on perd en précision ce que l’on gagne en rapidité et les alcools faibles ont en outre l'inconvénient d'enlever en même temps une certaine quantité d'éosine. À moins qu'un excès concomittant d’éosine n'indique l'emploi de l'alcool à 60°, il vaut mieux s’en tenir à l’alcool absolu et prolonger son action le temps nécessaire.

Tout récemment M. Sabrazès nous a indiqué que l’on décolorait les bleus basiques à la fois très rapidement et avec beaucoup de précision en acidifiant très légèrement l’alcool absolu. Les rouges sont en outre rendus plus éclatants. Nous avons déjà utilisé plusieurs fois le procédé de M. Sabrazès et nous en avons toujours obtenu d'excellents résultats. Il ne faut ajouter qu’une trace d’acide à l'alcool de lavage. Cet acide peut être l'acide acétique, l’acide salicylique ou un acide quelconque très dilué.

Un très léger excès de bleu est à respecter. Les préparations * tendent en effet à se décolorer légèrement à la longue. Le léger excès disparait de lui-même au bout de quelques semaines et la préparation se bonifie en vieillissant et se met au point avec une remarquable précision.

b) ou bien, comme je l’ai essayé récemment, on peut laver largement à l’eau filtrée ou distillée jusqu'à ce que l’eau de lavage ne se colore presque plus-en bleu et mettre sur la préparation quelques gouttes du liquide de Unna connu sous le

nom de Glycerinaethermischung. On ne les y laisse que 15" à 30” secondes, d'autant moins longtemps que la préparation retient moins énergiquement le bleu. On lave de nouveau soigneusement à l'eau pour enlever complètement le glycerina-

ethermischung. Alors seulement, on déshydrate à l’alcool absolu, on passe au xylol ef on monte à l'huile de cèdre.

La préparation se trouve mise d'emblée au point en général, de plus les bleus sont énergiquement fixés par l’action du tannin contenu dans le mélange. S'il persiste un léger excès de bleu, on peut, comme dans le cas précédent, soit le conserver soit, siil est plus marqué, l'enlever avec un peu d'alcool absolu.

Pour cette décoloration par le glycerinaethermischung, il faut avoir soin de ne pas servir d'alcool, niimmédiatementavant, ni immédiatement après ce réactif, sinon la décoloration serait brutale et risquerait d'être excessive.

Par le procédé du glycerinaethermischung, les préparations à l'éosine bleu sont exécutées et plus rapidement et plus facilement. Le plus souvent elles ne le cèdent en rien à celles qui ont été obtenues par l’action prolongée de l'alcool absolu employé seul. Ce procédé est cependant, dans certains cas, moins délicat. Aussi l’'employons-nous surtout comme technique courante, mais lorsque nous voulons préciser certains détails d’affinité basophile ou acidophile nous contrôlons toujours les préparations ainsi obtenues par d’autres très lentement décolorées à l'alcool absolu.

Aïnsi que nous l’a recommandé Dominici, nous montons toujours nos préparations dans l'huile de cèdre et non dans le baume du Canada. L'huile de cèdre conserve en effet beaucoup mieux

les couleurs d’aniline que le baume du Canada (1). Une déshy- dratation parfaite est également une condition de bonne conservation. Si toutes ces conditions ont été réalisées les préparations

l. Son seul inconvénient est de sécher plus lentement que le baume. Il faut bien avoir soin de monter à l’auILE DE cèpre, et non à l'ESSENGE de cèdre qui est trop fluide, qui ne sèche qu’extrémement lentement et qui s'évapore au point, que la coupe insuffisamment ose se dessèche à son tour et est irrémédiablement perdue.

CYTOLOGIE DES INFLAMMATIONS CUTANÉES paré

peuvent conserver des années leurs nuances les plus vives et les plus délicates.

Quelquefois, pour des raisons qu’il est assez difficile de préciser, mais qui sont sans doute en rapport avec la durée plus ou moins longue de la fixation à l’iodochlorure et peut-être du séjour dans l'acétone (ou aux impuretés qui peuvent exister dans celle-ci), les coupes prennent mal le bleu ou gardent mal l'éosine.

Lorsque les coupes prennent mal le bleu, il suffit souvent de prolonger l’action de celui-ci. Si l’on échoue, cela tient peut- être à ce que les coupes ont une réaction acide trop prononcée, en tous cas on réussit à faire prendre le bleu en laissant séjour- ner au préalable les coupes colorées à l’éosine orange pendant une à 24 heures dans un récipient contenant une grande quantité d’eau filtrée (qui est toujours légèrement alcaline) additionnée d'une faible quantité d'éosine orange pour que la coloration des coupes se maintienne.

Si les coupes gardent mal l’éosine orange, malgré une coloration prolongée dans une solution forte de ce colorant et un court passage dans le bleu, on peut mordancer pour l’éosine en immergeant quelques secondes les coupes, bien lavées à l’eau, dans une solution d'alun de fer à 1 0/0, eten les remettant, après nouveau lavage à l'eau, dans l’éosine orange. Ce passage dans l’alun

de fer doit être très rapide, car trop prolongé il entraverait la coloration ultérieure par le bleu de toluidine.

Au lieu de bleu de toluidine on peut employer le bleu de méthvylène ou le violet de méthyle. Il est important que le bleu de méthylène soit le méthylenblau de Hôchst, on s’en sert habituellement en solution à 1 0/0, nous préférons une solution plus diluée à 1/500 qui déplace moins l’éosine que la solution à 1 0/0. Le bleu de méthylène déplace d’ailleurs toujours plus l’éosine que le bleu de toluidine, aussi ne doit-il être employé que sur les coupes qui gardent bien Le colorant rouge. Il en est de même du violet de méthyle (1) que nous employons aussi en solution à

1. Le violet de méthyle dont il faut se servir après éosine orange est le violet de méthyle 6B dont la coloration violet bleu tranche sur les

1/500. C’est un colorant de choix pour les noyaux dont il met en évidence la chromatine avec une précision remarquable sans l'empâter jamais comme le fait quelquefois le bleu de toluidine.

Le glycerinaethermischung peut être employé après le bleu de méthylène, mais non après le violet de méthyle.

2° Alun de fer ; éosine orange ; bleu de méthyléne. — Comme nous l'avons vu précédemment, l'alun de fer mordance pour les colorants acides et gêne l’action du colorant basique.

J'ai utilisé cette propriété pour mettre en évidence les nucléoles et les distinguer de la chromatine. Le mordancage pour les colorants acides ne renforce pas seulement leur pouvoir tinctorial, mais aussi leur action élective. Ainsi, après éosine orange, les globules rouges, par exemple, doivent se colorer en orangé pur, tandis que le collagène doit se teinter de rouge vif (Dominici). [1 arrive parfois que sur certaines coupes, la dissociation entre l'orange et le rouge ne se produit pas aussi électivement et les hématies prennent autant l’éosine que l'orange. Si l’on décolore ces coupes et qu'après les avoir mordancées à l’alun de fer on recommence la coloration au mélange d’éosine et d’orange on constate que cette fois la différenciation s’est produite, les hématies sont exclusivement teintées de jaune orangé et le collagène de rouge franc.

Voici comment il faut procéder. Les coupessortant de l’eau distillée sont laissées pendant 15 secondes dans une solution d’alun de fer à 1 0/0. On les y agite pour que la pénétration de la solution ferrique soit bien uniforme, puis on les lave rapidement à l’eau filtrée qui arrête plus rapidement que l’eau distillée l’action de l’alun de fer. Les coupes sont alors placées dans la solution d’éosine orange à 1 0/0 pendant 1/4 d'heure à une heure. On lave à l’eau et on colore au bleu de méthylène à 1/500 (on peut employer aussi le bleu de toluidine ou le violet de méthyle 6B)

- colorants rouges. Le violet 5R excellent seul est mauvais en coloration combinée, car il donne un violet rouge malaisé à distinguer de l’éosine. D'ailleurs le violet 5R ne donne que des colorations fugaces. Celles du

violet 6B sont beaucoup plus stables et se maintiennent au moins quelques années,

pendant deux ou trois minutes, on lave à l'eau et on décolore lentement à l’alcool absolu comme il a été indiqué plus haut. Si la préparation est réussie la chromatine des noyaux doit être bleue (ou violette si lon a employé le violet de méthyle) ainsi que les protoplasmes basophiles ; les nucléoles doivent être nettement apparents teintés de rouge orangé, les hématies jaune orangé, le collagène rouge vif, quelquefois rose pâle.

Si le bleu n’a pas pris, ou à pris insuffisamment il est absolument inutile de recommencer la coloration par le bleuen la prolongeant, car il y a un excès d’alun de fer, le bleu ne prendrait pas mieux la deuxième fois que la première, il chasserait seule-

ment l'éosine et arriverait notamment à décolorer presque com-

plètement.le collagène. La préparation n'est cependant pas perdue, mais il faut revenir plus en arrière et remettre les préparations dans l’éosine orange puis de là les laisser séjourner dans une grande quantité d’eau filtrée additionnée d’un peu d’éosine orange. Quand on pense que le séjour a été suffisant pour enlever seulement l’excès et non tout l’alun de fer on colore au bleu comme précédemment.

Si au contraire le bleu a trop pris et si les nucléoles sont teintés de bleu comme la chromatine, c'est que le mordançage à l’alun de fer a été insuffisant. On peut revenir à l’alun de fer ou plus simplement mordancer un peu plus longtemps une autre coupe. Pratiquement il vaut mieux mordancer inégalement une série de coupes ou laisser des temps inégaux dans l’eau filtrée faiblement

éosinée une série de coupes également mordancées.

3° Hématéïne, Van Gieson. — Cette coloration est bien connue, et nous ne ferons que quelques remarques à son sujet.

On peut employer une hématoxyline ou une hématéine quelconque. Il nous parait préférable d'employer l'hématéine concentrée de Dominici et de surcolorer les coupes. Ensuite pour empêcher l'acide picrique du Van Gieson de faire pâlir les noyaux, on les fait virer au noir intense en plongeant la préparation dans l’alun de fer.à 1 ou à 3 0/0. L’excès d'hématéine est

chassé par l’alun de fer et la coloration devient exclusivement nucléaire.

On arrête l’action de l’alun de fer, alors qu'il y a encore un peu de surcoloration, par lavage à l’eau filtrée. Les noyaux étant très fortement colorés par la laque ferrique d'hématoxyline on peut laisser assez longtemps le Van Gieson et il y a toujours avan- tage à le laisser longtemps, environ une minute.

Le Van Gieson à employer doit être la Van Giesons’che Lüsung de Grübler. Les mélanges d'acide picrique et de fuchsine que l’on trouve dans les formulaires histologiques ne donnent que des résultats approchés mais jamais une différenciation aussi nette ni aussi précise.

Les préparations au Van Gieson doivent être montées par exception, non dans l'huile de cèdre, mais dans le baume acide, ainsi que l’a recommandé Curtis {1). Dans ce milieu acide en effet les vives couleurs de la fuchsine ne perdent rien de leur intensité et se conservent admirablement. Pour préparer le baume acide, Curtis dissout de l'acide salicylique à saturation, . à froid dans du xylol et emploie le xylol salicylé comme dissolvant du baume. Nous avons utilisé le procédé de Curtis dès que nous avons eu lu son travail et il nous a donné de si bons résultats que nous montons toujours maintenant au baume acide les coupes colorées au Van Gieson. |

4° Hématéïine, éosine, vert lumière. — Cette coloration doit être analogue à celle du Prof. Prenant (2). Nous n'avons pas trouvé le manuel opératoire de la coloration du Prof. Prenant que nous croyons être : hématoxyline au fer de Heïdenhain, érythosine et vert lumière.

Alors que nous n’avions pas connaissance de ce procédé nous avons imaginé le nôtre dont l'idée nous a été fournie par la remarque que nous avions faite, que l’alun de fer mordance pour les colorants acides et sensibilise les tissus à l'égard de leurs affinités respectives.

Ce procédé met en évidence le collagène aussi bien que la

1. Curtis, Nos méthodes électives de coloration du tissu conjonctif. Archives de médecine expérimentale 1905, t. XVII, p. 628. 2. Prenant, d'après Launoy. Technique histologique, p. 11.

fuchsine du Van Gieson, mais surtout il accuse nettement en rouge vif les protoplasmes, même les moins colorables (hyaloplasme).

Voici comment nous procédons : les coupes sont surcolorés à l’hématéine concentrée de Dominici (pendant plusieurs heures), moins pour avoir une très forte coloration nucléaire que pour pouvoir décolorer longtemps dans une solution d'alun de fer à 3 0/0 qui, en même temps qu'elle précise et met au point la coloration nucléaire, mordance pour les colorants acides. La décoloration étant amenée au point voulu, les coupes sont lavées à l’eau filtrée, puis placées dans l’éosine à l'alcool. L'éosine soluble à l’alcool nous paraît supérieure, pour cette coloration, à la solution aqueuse d'éosine orange, que nous employons au contraire de préférence, lorsque nous devons employer ultérieurement un bleu basique.

La solution alcoolique d’éosine est une solution saturée dans l'alcool à 90°. Les coupes y séjournent environ cinq à dix minutes. Si on les y laissait trop peu de temps la coloration risquerait d’être trop faible et, comme elle s’affaiblit encore ultérieurement par le passage du vert lumière et des alcools, il importe qu'elle soit d'emblée intense. Cependant la coloration dans l'éosine ne doit pas être trop prolongée sinon elle absorbe toute l’action mordançante de l’alun de fer, les tissus se surchargent d’un excès d’éosine et le vert lumière ne prend plus ensuite, ou ne prend qu’en prolongeant l’action du colorant. Un excès de vert s'ajoute alors à l’excès de rouge, les coupes deviennent extrêmement sombres ; pour les éclaircir et les mettre au point, il faut alors presque autant de travail que pour exécuter une nouvelle préparation que l’on n’autait pas à retoucher.

Au sortir de la solution d’éosine, les coupes sont largement lavées à l'eau (et non à l'alcool qui les décolorerait) et elles y sont laissées jusqu’à ce que tout l’alcool en ayantété chassé elles soient parfaitement imbibées d’eau. À ce moment, on fait tom- - ber sur elles quelques gouttes d'une solution aqueuse de vert lumière à 1 0/0. Le vert lumière est laissé d’autant plus longtemps que la coloration par l’éosine a été plus prolongée, soi

environ 30 secondes si l’on a coloré dix minutes à l'éosine.

Aussitôt on lave et on déshydrate à l’alcool absolu, puis xylol et huile de cèdre. Si la préparation est réunie, et elle doit l’être, la chromatine des noyaux est franchement noire, les nucléoles et les protoplasmes, les filaments d'union de l’épiderme sont intensément teintés de rouge vif éclatant, le collagène nettement accusé en fert foncé. S'il y a un excès de vert, reconnaissable à la teinte grise que prennent les protoplasmes par suite de la superposition du vert et du rouge, enlever l'huile de cèdre par le xylol, celui-ci par l’alcool absoln et faire tomber alors sur la préparation, quelques gouttes de tannin orange de Unna, qui enlève le vert tout en respectant assez bien l'éosine. On voit des nuages verts se dégager de la préparation. Arrêter l'action du tannin au bout de 15 à 20 secondes, de nouveau alcool absolu, xylol, huile de cèdre. Pendant les passages inévitables à l'alcool absolu procéder rapidement car celui-ci enlève toujours une quantité notable d’éosine. S'il y a un excès d’éosine masquant les détails nucléaires ou empâtant les protoplasmes, la retouche est aisée, il suffit de laver le temps voulu à l'alcool absolu où même de passer très vite un peu d’alcoo!l à 90°.

On ne peut remédier au défaut d’éosine qu’en recommencant toute la série des manipulations, le défaut de vert lumière se répare plus aisément il n'y a qu'à revenir à ce colorant mais il le faut faire avec prudence. En effet au cours de la première coloration au vert et des lavages ultérieurs à l’alcool absolu la surcharge en éosine a été enlevée, le vert va donc prendre beaucoup plus énergiquement que la première fois et l’écueil à éviter cette fois c'est de trop affaiblir la teinte rouge obtenue.

Lorsque l'on est obligé d'enlever l'excès de vert lumière par le tannin orange, il arrive parfois que la préparation contient - encore des traces d’alun de fer, dans ce cas il se forme un tannate de fer noir qui rend la préparation extrêmement sombre et dont on ne peut se débarrasser.

Pour éviter cet inconvénient éventuel nous avons remplacé le mordançage à l’alun de fer par un mordançage au bichromale

de potasse en solution aqueuse à 1 0/0. Le bichromate de potasse, comme l’alun de fer, fait virer l’hématéine au noir, mais ne la décolore pas. Il faut donc colorer beaucoup moins à l’hématéine ou, si l'on a surcoloré, utiliser les précieuses propriétés décolorantes que présente la teinture d’iode à l'égard de cette substance tinctoriale (1).

5° Colorations à l'orcéine. — On peut employer l’orcéine soit seule soit combinée au bleu polychrome et au tannin orange de Unna. Ce sont là des colorations connues et sur lesquelles nous n'avons pas à insister, mais on peut aussi, et très avantageusement, combiner la coloration à l'orcéine à celle de Dominici (éosine orange et bleu de toluidine).

Les formules de liquides à base d’orcéine sont très nombreuses et beaucoup ne donnent que des résultats très médiocres. Nous utilisons deux solutions différentes, toutes deux excellentes. Nous regrettons vivement de ne pas savoir quels sont les histologistes qui les ont établies.

La première colore les fibres élastiques en 10 à 15 minutes. Sa formule est :

Orééines ser 0 gr. 50

; : . Alcool absolu. . . 40 00

Coloration en 10 minutes a ER) or 20 00 HO Es su XX) soubteS

11 ne faut pas prolonger son action au-delà du temps indiqué, car en raison de sa forte teneur en acide chlorhydrique, elle risquerait de décoller les coupes fixées sur la lame de verre à l'aide de l’albumine de Mayer. Il y a toujours légère surcoloration, aussi faut-il différencier rapidement à l'alcool absolu ou à l'alcool à 90° avant de mettre les préparations dans l'éosime orange. Elle est à employer surtout lorsque l’on veut avoir un renseignement rapide.

1. C’est à Dominici que nous devons la connaissance de ces propriétés de la teinture d’iode nous renvoyons à son ouvrage.

Rubens Duval

34 CYTOLOGIE DES INFLAMMATIONS GUTANÉES

La deuxième agit plus lentement et il faut prolonger son action de 12 à 24 heures. Sa formule est :

Orcenme ter 5 Ogr.10 Coloration en 12 à 24 h. ! AzOSH . . . . . . 2 "500 Alcool à 70% .:.: =: 100: 06

Les coupes ne risquent pas de se décoller, il n’y a pasde surcoloration et il suffit d’un simple lavage à l'eau avant le bain d’éosine orange. Quand on peut attendre au lendemain, il vaut mieux user de cette dernière solution.

L’orcéine mordance pour l’éosine orange et pour le bleu basique (Pappenheim), les temps de coloration peuvent donc être diminués. Mais, l’orcéiïne étant soluble dans l'alcool on ne doit pas décolorer le bleu au moyen de lalcool absolu, mais au moyen du glycerinaethermischung ou à son défaut à l’aide d’une solution aqueuse de tannin à 10 0/0. Après le tannin comme après le glycerinaethermischung, il importe de laver soigneuse-

ment à l’eau avant de déshydrater à l'alcool absolu.

6° Fuchséline de Weigert (1). — Ce dernier colorant, récemment entré dans la pratique histologique colore les fibres élastiques avec peut-être plus de précision encore que l’orcéiue. On peut le combiner à la coloration à l'hématéine et au Van Gieson. On peut aussi l’employer avant la coloration à l’éosine orange et. au bleu de méthylène. Nous recommandons même beaucoup cette combinaison, mais il est à remarquer que si la fuchséline de Weigert mordance énergiquement pour l’éosine orange elle entrave considérablement l’action ultérieure du bleu basique. Il faut donc, après coloration par l’éosine orange, laisser les préparations dans l’eau filtrée faiblement éosinée, afin que leur acidité soit neutralisée par l’alcalinité de l’eau filtrée. La coloration par le bleu basique peut alors s’effectuer. La fuchséline résiste à l'alcool beaucoup plus que l’orcéine. La décoloration peut donc être faite soit à l'alcool absolu soit au glycermaethermischung.

1. La préparation de la fuchséline de Weigert et son mode d’emploi se trouvent exposés en détail dans : Josué et Alexandresceu, Archives de Médecine expérimentale, janvier 4907.

{° Autres colorations. — Nous avons employé aussi les colorations suivantes : Bleu polychrome pur. Picrocarmin de Ranvier. Coloration de Ramon y Cajal et de Borrel au rouge Magenta et au picrocarmin d'indigo. Eosine hématoxyline. Hématoxyline au fer de Heidenhain. Hématoxyline au vanadium. Kernschwarz. Safranine. Bleu de Benda. Triacide. Vert de méthyle. Picrobleu d’aniline. Dahlia, etc.., mais nous n’avons aucune remarque particulière à faire au sujet de ces colorations.