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PaGeT, suivant les techniques dont nous allons préciser les détails.
Nos essais ont porté sur plasma et globules rouges et visèrent les dosages du cholestérol libre et des esters du cholestérol.
La plupart des travaux publiés jusqu’à ce jour, se rapportant au sérum, il nous a paru inutile de nous limiter à cette étude, et nous avons jugé plus rationnel d’explorer les phases solide et liquide du sang.
C’est ainsi, nous semble-t-il, que nous avions les plus grandes chances de saisir les perturbations du cholestérol libre et de
ses esters.
La comparaison avec les chiffres trouvés antérieurement, devenait d’ailleurs toujours possible puisque le professeur PAGET a récemment montré (1) que plasma mur et sérum ont sensiblement la même teneur en cholestérol, les différences enregistrées par les auteurs et surtout par BUGNARD étant dues, non pas à une modification de l’équilibre acido-basique au cours de la coagulation, mais au fait que la comparaison a porté, soit sur des plasmas oxalatés, soit sur des plasmas provenant du sang recueilli sur anti-coagulant salin modifiant la perméabilité globulaire (fluorure de sodium, citrate de soude: ...etc.):
(1) M. PaGerT, G. PIERRART. — JR. Soc. Biologie, t. CXXVI, 1937,p. 1204.
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Nous avons employé comme anti-coagulant, le polyanétholsulfonate de soude (liquoïd Roche) qui, à la concentration de 0 gr. 20 par litre, ne lyse pas la membrane des hématies, ainsi que l’ont récemment prouvé CHABANIER, GUILLAUMIN, LAUDAT,
Lévy et PAGET (1).
Séparation du plasme et des globules
La séparation des globules étant effectuée conformément aux prescriptions de ces derniers auteurs — c'est-à-dire par centrifugation à 4.500 tours-minute pendant un temps suflisant qui est ainsi défini pour Chaque machine — on observe le volume globulaire de 5 en 5 minutes, et l’on s’arrête au temps à partir duquel une nouvelle action de 5 minutes, ne modifie pas le volume observé,
Le temps est ordinairement de 25 minutes, c’est la durée que nous observons dans nos essais, mais il peut être inférieur et varie légèrement avec les divers échantillons sanguins.
Soulignons en passant qu'il est expressément recommandé de n’utiliser qu’une machine susceptible d'atteindre la vitesse 4.000-5.000 tours-minute, parce que des vitesses moindres
risquent de ne produire qu’une centrifugation imparfaite de
(i) CHABANIER, GUILLAUMIN, LAUDAT, LEVY, PAGET. — Bull. Soc. Chim. Biol., t. XIX, n° 5 1937, page 802 et suivantes.
SR
la masse globulaire, quelque prolongation qu’on donne au temps de la centrifugation.
Il n’est ni nécessaire, ni même conseillé de recourir aux vitesses élevées de certains appareils (8 à 10.000 tours) parce qu'il n’est pas démontré que la mise en jeu de telles forces ne risque pas de provoquer unealtération du globule même.
Après lecture des volumes plasmatiques et globulaires, on procède à la décantation du plasma et on parfait l'élimination
du liquide surnageant à l’aide de papier-filtre.
Prélèvement des prises d’essais
Les prises d’essais ont eu lieu, à l’aide d’une pipette à écoulement total, soigneusement étalonnée et dont les eaux de rinçage étaient jointes au liquide écoulé .
Le prélèvement de la prise d’essai globulaire se faisait en plongeant franchement la pipette dans la masse, pour éviter d'entraîner du plasma. L’extrémité de la pipette était essuyés
avant d’en transvaser le contenu.
Méthodes de dosage
a) Dosage du cholestérol total dans le plasma. Le dosage fut effectué à l’aide de deux procédés.
Précisons de suite que l'écart obtenu dans l’un et l’autre cas
nn 5 =
fut toujours compris dans la marge des erreurs expérimentales inévitables (inférieur à 3 %).
— La première technique utilisée était celle de GrIGAUT, le temps de contact « éthéro-alcoolo-plasma » était cependant porté à une demi-heure.
Ce détail, banal en soi, est capital aux yeux du professeur PAGEr et de ses collaborateurs, et ne prendrait sa pleine signification qu’auprès de ceux-là seuls, qui ont la pratique cou-
rante de ce dosage colorimétrique.
— La deuxième technique était celle récemment mise au point par le professeur PAGET et son élève PIERRART et publiée dans les Comptes rendus de la Société de Biologie, sous le titre « Nouvelle méthode de détermination du rapport esters du cholestérol
E dans le sérum ou le plasma sanguin.
cholestérol total P =
En voici l'exposé détaillé, tel qu’il se trouve rapporté dans
la note de ces auteurs.
b) Méthode de M. PaGEr et G. PrerrART. Dosage du cholestérol total et de ses esters.
19 Extraction. — Effectuer l'extraction du bloc : cholestérol
+ esters sur 3 centimètres cubes de sérum ou de plasma,
de —
soit par la technique classique de GRIGAUT, soit par celle de
BLoor et VELLUZ (1 et 2).
20 Dosage du bloc: cholestérol + esters.
Dissoudre le résidu d’extration dans 10 centimètres cubes de trichloroéthylène. Doser colorimétriquement le cholestérol total sur 5 centimètres cubes de cette solution.
Pratiquer la réaction de Libermann de la façon suivante :
5 centimètres cubes de solution tricholoroéthylénique plus
2 centimètres cubes de trichloroéthylène, plus 3 centimètres cubes du mélange (anhydride acétique 10 centimètres cubes, acide sulfurique pur et concentré XX gouttes). Laisser la coloration se développer à l’obscurité.
Faire la lecture au colorimètre 25 à 30 minutes après le début
de la réaction.
3° Dosage des esters.
Verser les 5 autres centimètres cubes de solution trichloroéthylénique dans une capsule de porcelaine, le porter à l’ébullition, y ajouter à la pipette et assez rapidement, 1 centimètre cube
de la solution suivante: digitonoside 0,10 ; méthanol pur
(1) VeLLzuz. — C. R. de la Société de Biologie 1933, t. 112, p. 265.
(2) Nous avons également obtenu de bons résultats en substituant le mélange : alcool 1 volume plus acétone 3 volumes au mélange alcool-éther de Bloor et Velluz.
de ché Lines, + Ed
ee
5 centimètres cubes, 5 centimètres cubes du mélange : trichloroéthylène 1 partie ; éthanol, 2 parties.
Imprimer à la capsule quelques mouvements de rotation afin de bien mélanger, puis laisser l’ébullition se poursuivre pendant 1 minute environ pour amener le contenu de la capsule à un volume de 3 centimètres cubes environ. Le méthanol étant alors éliminé, ajouter lentement, pour ne pas interrompre l’ébullition, le mélange : 6 centimètres cubes acétone pur, plus 4 gouttes d’eau.
Après quelques bouillors, retirer la-capsule, du bain marie, et laisser refroidir sans agiter. La précipitation du complexe est terminée au bout de 3 à 4 minutes.
Evaporer à sec et à douce température (1).
Reprendre le résidu encore tiède par du trichloroéthylène (2 fois 3 centimètres cubes). Filtrer les solutions sur un très
petit filtre plissé, pour arrêter les parcelles de digitanoside ou
de complexe, entraînées mécaniquement.
Recueillir le filtrat dans une éprouvette rigoureusement
graduée de 15 centimètres cubes, compléter à 7 centimètres
(1) On peut ne pas évaporer et opérer par centrifugation. Le liquide surnageant le culot de centrifugation et l’éther de pétrole ayant servi au lavage de ce dernier sont évaporés. Le résidu ne renferme plus que les esters qui sont évalués colorimétriquement.
