AA'(E'A', —EA

AAA À BRAS RARE A) CRETE UT nn

On verra plus loin comment Hüfner a appliqué cette formule au dosage simultané de l’oxyhémoglobine et de l’hémoglobine dans le sang.

Jai supposé jusqu'ici que l’observateur était toujours renseigné sur la nature et le nombre des matières colorantes contenues dans la solution à analyser. Mais il peut arriver fréquemment, surtout dans des recherches physiologiques, qu’à côté de la matière colorante à doser, on soupçonne Pexistence d’autres produits colorés dont l’action absorbante viendrait fausser les résultats. Enfin, à un point de vue purement qualitatif, il peut être du plus haut intérêt de savoir si un liquide physiologique contient une ou plusieurs matières colorantes. L'étude photométrique des spectres. d'absorption permet de résoudre ces questions d’une manière très simple.

En comparant entre eux les coefficients d'extinction que fournit, dans deux régions spectrales, une solution contenant une matière colorante unique, on voit que leur rapport est constant, quelle que soit la concentration de la solution. Ainsi les chiffres suivants, empruntés à Vierordt, montrent que pour le bichromate de potasse et dans les régions spectrales, E 80 F —F

et F21G—F 32G, ce rapport est sensiblement égal à 5

et indépendant de:

la concentration.

Région spectrale. Concentration des solutions.

ge" — —

0,00125 0,000625 0,000312 ES80F—F 0,5575 = 1 0,2718 = 1 0,1359 = 1 PACE 22111857 0,5738— 2,1 0,2840 — 2,1

Ces expériences permettent d’affirmer que, si un liquide examiné sous des concentrations variables, fournit dans deux régions spectrales des coefficients d'extinction dont le rapport est constant, ce liquide ne contient qu'une seule matière colorante.

Il est à peine nécessaire de faire remarquer combien un semblable moyen d'investigation est précieux pour l’étude des liquides physiologiques colorés, tels que le sang, l’urine ou la bile (1).

Dosage de l’oxyhémoglobine par voie spectrophotométrique. — Appliquons maintenant ces connaissances au dosage de l’hémoglobine dans le sang par voie spectrophotométrique.

La puissance colorante de ce liquide étant très considérable, il est nécessaire de le diluer fortement pour rendre possible analyse spectrale. Les proportions les plus convenables sont de 1 de sang pour 160 à 200 d’eau, et comme 3 à 4 cent. cubes du liquide dilué suffisent amplement à l’analyse spectrale, on voit que la quantité de sang nécessaire est tout à fait minime. Si la solution ainsi obtenue n’absorbe qu’une quantité de lumière trop faible, il est bon de l’examiner sous une épaisseur de deux ou trois centimètres. Des mesures photométriques faites sous deux ou trois épaisseurs différentes constituent du reste un excellent contrôle de l’exactitude des déterminations. Ces dilutions peuvent être faites en mesurant les volumes d’eau et de sang

(4) Il m'est impossible de donner ici une idée des nombreuses applications qu'a reçues entre les mains de Vierordt la méthode spectrophotométrique. Ainsi, ce procédé lui a servi au dosage des substances incolores qui présentent une réaction de coloration (dosage du sulfocyanure de la salive), à la détermination de la puissance décolorante du noir animal et à l'examen des mélasses, à l'étude du pouvoir absorbant du sang, de la bile, de l'urine, des fecès, des liquides pathologiques, des parties vertes de quelques plantes, etc. L'étude des matières colorantes naturelles et artificielles du vin, si obscure encore et si délicate, trouverait certainement, dans l'emploi de cette méthode, un secours précieux.

à l’aide de pipettes graduées. Mais pour des recherches très exactes, il vaut mieux, à l’exemple de Hüfner, introduire la petite quantité de sang nécessaire à l’analyse, dans de petits ballonnets contenant de l’eau et tarés à l’avance.

Pour que la solution obtenue soit absolument limpide, il est de règle de Padditionner d’une faible quantité de soude, ou mieux de carbonate de soude sec. Koerniloff et Leichtenstern ont montré que cette addition a pour effet de diminuer légèrement le coefficient d’extinction, c’est-à-dire la quantite de lumière absorbée. La différence qui est surtout sensible pour des sangs de leucémiques, tient à ce fait que la soude augmente la limpidité du liquide en dissolvant les corpuscules graisseux en suspension.

Le dosage de la matière colorante doit se faire à l’état d’oxyhémogiobine: mais il est inutile d’agiter la solution à l’air. L’eau qui a servi à la dilution contient une quantité d'oxygène amplement suffisante pour oxyder toute Phémoglobine.

Pour que le dosage soit possible, il faut d’abord être sûr que le sang ne contient qu'une seule matière colorante. Supposons pour l'instant qu’il en est ainsi; les expériences qui le démontrent jusqu’à l’évidence seront plus commodément exposées tout à l’heure.

La région spectrale choisie de préférence est celle qui correspond à la deuxième bande d’absorption de l’oxyhémoglobine. Elle va de D 63 E à D 84 E. Des mesures photométriques montrent en effet que l’absorption lumineuse y est plus forte que dans la première, bien que celle-ci paraisse sensiblement plus sombre. Cela tient à ce fait que la première bande se trouvant près du rouge qui est une région très lumineuse, ressort plus nettement que la seconde. On éclaire donc la fente mobile, et on repère la région D 63 E — D 84 E qui est isolée du reste du spectre à l’aide des écrans mobiles.

On s’assure préalablement qu’à un égal écartement des deux fentes indiqué par les divisions des tambours correspond un égal éclairement des deux spectres; sinon on déplace la lampe dans un sens vertical jusqu’à ce qu’elle éclaire également les deux moitiés de la fente et que les deux spectres aient identiquement la même intensité lumineuse. Bien entendu, la propreté de toutes les pièces en verre de l’appareil doit être soigneusement

surveillée. De plus, il faut avoir soin de donner à l’œil, devant l’oculaire, une position telle qu’on aperçoive une égale hauteur des deux spectres. Cette condition est indispensable à une comparaison exacte des deux surfaces lumineuses.

La solution colorée, parfaitement limpide, est introduite dans la cuve de Schultz que l’on dispose devant la fente du collimateur avec les précautions qui ont été indiquées plus haut. Les parois de la cuve et le cube en flint doivent être, bien entendu, d’une propreté parfaite. .

On mesure alors l'intensité lumineuse comme on l’a expliqué plus haut, en rétrécissant la fente qui correspond au cube en flint, jusqu’à ce que les deux spectres aient un égal éclairement.

L’écartement primitif choisi doit être dans la règle de 2 millimètres, correspondant à un tour complet de la vis, c’est-à-dire à 100 divisions du tambour. L’intensité lumineuse restante est donc lue directement sur le tambour inférieur et transformée en coefficient d’extinction à l’aide de la table de Vierordt.

Ce chiffre représente d’une manière relative la concentration de la solution observée et peut être conservé sous cette forme. Pour le transformer en un poids absolu d’hémoglobine, il est nécessaire de connaître le rapport d'absorption de l’oxyhémoglobine dans la région D 63 E — D 84 E, puisqu’on à la relation :

Cire La valeur de A est fournie par l’équation.

Fesne €

C’est à dire qu’on l’obtiendra en prenant le coefficient d’extinction de solutions d’oxyhémoglobine de concentration connue, et calculant chaque fois

le produit : qui doit être constant. La détermination de cette constante à

été entreprise pour la première fois par Hüfner, pour l’oxyhémoglobine de sang de chien. Elle constitue une opération des plus délicates, à cause de la

difficulté qu'on éprouve de fixer d’une manière exacte le titre d’une solution d’hémoglobine. Les déterminations les plus exactes et les plus récentes sont de v. Noorden, qui a entrepris, sous la direction de Hüfner, une revision générale de la question. La marche à suivre est celle-ci. On prépare, en partant du sang de chien, des cristaux d’oxyhémoglobine qui, purifiés par trois recristallisations successives, sont finalement redissous dans de l’eau froide. La concentration de cette solution est déterminée par évaporation avec les précautions qui ont été indiquées page 8 . Dans les expériences de v. Noorden, l’évaporation avait lieu dans un petit vase de forme spéciale, qui permettait d'achever la dessication du résidu à 112° dans un courant d'hydrogène.

La solution ainsi obtenue est trop concentrée pour pouvoir servir directement à l’analyse spectrale. Elle doit être préalablement diluée, en employant non pas des vases gradués, mais la balance de précision. Les quantités de liquide sont, en effet, si petites que la moindre erreur de lecture peut entrainer des écarts considérables. Pour cela, on répartit dans de petits ballonnets tarés et bouchés de petites quantités (de 1 à 2 cent. cubes) de la solution type d’hémoglobine; on pèse une seconde fois, puis on ajoute de 25 à 85 cent. cubes d’eau et on reporte sur la balance. En outre on détermine, pour chacune de ces dilutions, la densité par la méthode du flacon. On a ainsi tous les éléments nécessaires pour calculer la concentration de la solution diluée, c’est-à-dire le poids de matière colorante dissoute dans 1 cent. cube de la solution.

Soient :

g, le poids de la solution qui à été soumise à l’évaporation;

g', le résidu de g,

y, le poids de la petite quantité de liquide coloré qui a été pesée chaque fois pour la dilution;

Q, le poids de ce liquide, plus le poids de l’eau ajoutée;

s, le poids spécifique de la solution diluée ;

€, sa concentration.

La concentration cherchée sera donnée chaque fois par la formule :

Ci=—=

Lorsque toutes les pesées sont faites, on additionne les solutions diluées de quelques grains de carbonate de soude bien sec, afin d'obtenir une limpidité et stabilité plus grandes. Ces liquides sont portés au spectroscope et on détermine, pour chacun d’eux, le coefficient d’extinction dans la région D 63 E — D 84 E, qui correspond à la deuxième bande de l’oxyhémoglobine et dans la région D32E — D538E, qui correspond à l’espace qui sépare les deux bandes. ;

Le tableau VI expose les résultats obtenus de cette façon par v. Noorden, dans cinq séries d'expériences. Pour chacune d’elles, il a été fait une nouvelle préparation de matière colorante. Dans ce tableau, on désigne par :

e, la concentration de la solution examinée au spectrophotomètre : &, le Coefficient d'extinction A., le rapport d’absorption £’,,lecoefficient d’extinction A"; le rapport d’absorption

| pour la région D 32 E — D 58 E.

pour la région D 63 E — D 84 E.

Ces résultats ont été obtenus à l’aide du spectrophotomètre de Hüfner.

J’ai suivi exactement, dans mes propres expériences, le procédé qui vient d’être décrit, avec cette seule différence que le résidu d’hémoglobine était desséché simplement dans une étuve à air à 112. J’ai fait une seule série de déterminations avec de l’oxyhémoglobine de chien, et trois avec de l’oxyhémoglobine de cheval.

L'appareil employé était le spectrophotomètre de Vierordt. Les résultats obtenus sont consignés dans le tableau VII.