VI. — Recherches témoins. Leur nature

L — Généralités et techniques.

Dans nos recherches sur les réactions humorales de la vaccine, nous sommes partis d'un fait clinique et expérimental maintes fois observé.

Des malades ayant été vaccinés quelque temps auparavant et qui, entre nos mains, présentaient à une insertion secondaire de vaccin, le type de la « réaction précoce », avaient toujours leur sérum doué d’un pouvoir nettement antivirulent, mais il ne déviait pas le complément vis-à-vis de la lymphe vaccinale. Au contraire, nous pouvions observer cette déviation de l’alexine d'une façon précoce et transitoire, au moment où, dans les quelques jours qui suivent une vaccination, le phénomène de Von Pirquet n’est pas dissociable de la réaction traumatique.

Une question d'ordre très général se posait donc : quelle est la signification du phénomène de Von Pirquet envisagé dans ses rapports avec les propriétés acquises du sérum d’un sujet vacciné ?

D'autre part, la réaction de fixation que nous employons est-elle capable de mettre en évidence les substances qui créent l’état d'allergie ou n'est-elle en rapport qu'avec la période d'infection et d'évolution vaccinale, à laquelle succède ultérieurement cet état allergique ?

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Pour étudier ces questions, il fallait rechercher les propriétés du sérum de l'individu vacciné depuis un temps variable, en essayant parallèlement de déterminer chez lui le phénomène de Pirquet. Il fallait enfin établir la valeur respective des différentes réactions observées.

Nous avons cherché à la préciser par des vaccinations expérimentales, en modifiant pour chaque voie d'inoculation du vaccin, les doses employées et le nombre des injections.

Nous avons constamment comparé les résultats obtenus par la déviation complémentaire avec ceux parallèlement fournis par l'étude du pouvoir antivirulent.

Danstoutes ces recherches il ne faut pas oublier que l’on se trouve sans cesse sur un lerrain fort dangereux : nous avons déjà montré que la lymphe vaccinale est un complexe et qu'il faudra tenir compte des substances albuminoïdes inoculées avec le virus vaccinal.

Aussi est-1l indispensable de pratiquer un nombre considérable de recherches témoins pour bien déterminer ce qui appartient en propre aux anticorps du vaccin et non des albuminoïdes.

Nous indiquerons d’abord la technique générale employée dans nos recherches sur le pouvoir virulicide du sérum. La mise en évidence de la substance antivirulente a été constamment pratiquée selon le procédé que nous a communiqué le regretté professeur Kelsch.

On fait une solution de vaccin au 1/100, en partant d'un tube de vaccin glycériné du commerce. Nous avons toujours employé pour cela le vaccin de l’Institut de vaccine animale de la rue Ballu.

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On prend un centimètre cube de cette solution que l'on mêle à 5 centimètres cubes du sérum à étudier ; on prend également 1 centimètre cube de la solution vaccinale pour l'étendre de 5 centimètres cubes de sérum physiologique. Ces deux mélanges sont placés pendant une demi-heure ou trois quarts d'heure à l’étuve à 37°.

La vaccination avec le mélange d'épreuve est ensuite faite sur un lapin d'après la technique de Calmette et Guérin. L'animal est rasé sur le dos {on a soin de prendre un lapin ne présentant pas de nœvus sur le tégument) de

façon à 1rriter la peau : celle-c1 étant bien tendue, on

mesure au centimètre un espace que l'on peut subdiviser pour l'essai de plusieurs échantillons.

La vaccination est pratiquée avec une pipette par simple grattage de la peau, en évitant de faire des scarifications trop profondes.

Il faut avoir soin de mettre Ja même quantité de liquide pour chaque échantillon.

Enfin, pour chaque animal il importe de faire une zone témoin vaccinée avec le mélange indiqué plus haut (eau physiologique- vaccin).

Vers le cinquième ou sixième jour les résultats peu-

vent être lus.

On compte les papules apparues sur chaque zone et connaissant leur superficie, on ramène le nombre des éléments au centimètre carré.

À plusieurs reprises, nous avons essayé le sérum normal par comparaison avec le sérum à étudier et la soluion de vacein dans l’eau salée : il peut exister de très légères différences entre cette dernière solution et le mélange sérum normal-vaccin, c'est-à-dire que l’érup-

se cé murs

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tion peut être un peu plus forte quand le vaccin est dilué dans l’eau physiologique, que lorsqu'il se trouve en contaet avec le sérum normal ; mais cette différence est loujours minime, et jamais un sérum neuf ne se montre antivirulent.

La technique de la réaction de fixation est au contraire beaucoup plus complexe.

On sait en quoi consiste cette fixation dont nous allons rapidement rappeler le mécanisme.

Quand, tn vitro, un antigène est mis en présence du sèrum renfermant la sensibilisatrice spécifique, c’est-àdire l’anticorps correspondant, il se constitue un mélange antigène-sensibilisatrice, qui est un mélange fixant capable de fixer Valexine ou complément, en sorte que cette alexine n'est plus décelable dans le milieu.

Donc, pour savoir si le sérum étudié contient une sensibihsatrice vis-à-vis de l'antigène employé, il faut constaler si l’alexine a disparu par fixation où déviation.

Pour cela, on ajoute un mélange réactif constitué par des globules rouges et un sérum hémolylüique chauffé si ce mélange trouve de l’alexine dans le milieu, c’est qu’elle n'a pas été déviée, 1l se produira une hémolyse et on en déduira que le sérum étudié ne contenait pas de sensihilisatrice.

Au contraire, si le mélange réactif ne rencontre plus d’alexine, c'est qu'elle a été fixée, il ne se produira plus d'hémolyse, et on déduira que le sérum étudié contenait une sensibihsatrice.

Ce résumé rapide suffit à nous montrer les éléments nécessaires pour pratiquer une réaction de fixation ; 1l faudra donc : ;

Le sérum à étudier,

Un antigène,

Une alexine ou complément,

Un groupement réactif, globules rouges, sérum hémolytique.

Dans nos réactions, nous nous sommes loujours servis comme globules rouges, de ceux du mouton ; comme sensibilisatrice, du sérum de lapin anti-mouton chauffé et rigoureusement titré.

Comme alexine, nous avons employé le sérum de cobaye, utilisé au bout de 4 heures, pur et à la dose de 0,1.

Le sérum à étudier était pris à la dose de 0,2, après l'avoir inactivé à 56°, pendant une demi-heure. En effet, il nous a toujours semblé préférable de détruire l’alexine normale par le chauffage, pour ajouter un alexine, toujours la même, et susceptible d’être titrée avant l'emploi.

Pour nous assurer que le sérum en expérience était complètement inactivé, nous faisions, dans toutes nos recherches, un tube témoin contenant : antigène, sérum, globules rouges, sensibilisatrice. Si le chauffage était bien fait, 1l ne se produisait pas d'hémolyse.

La seule difficulté était de trouver l'antigène à

employer.

Il nous a semblé que les résultats si imprécis et discordants des quelques auteurs qui ont rapporté des faits expérimentaux, tenaient principalement à une technique insuffisamment réglée ; nous nous sommes efforcés de l'établir avec plus de rigueur.

Nous avons d'abord employé du vaccin de lapin en

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sait tion ft rires st

solution aqueuse dans du sérum physiologique ; le titrage de cet antigène montre que l'on peut employer jusqu'à 1 centimètre cube de la solution à 1/50, sans obtenir la moindre déviation. Ce vaccin de lapin a été essayé en solution alcoolique au 1/10 et diluée au moment de l'emploi à 1/2, 1/5 et 1/10. Les résultats obtenus avec cet antigène ne furent pas satisfaisants.

Nous avons essayé le vaccin humain obtenu par raclage des pustules et broyé au mortier, puis dilué dans le.sérum physiologique. Nous avons abandonné cette technique pour deux raisons : la difficulté d’avoir des pustules au moment voulu, et enfin la difficulté qu'il y a à faire celte récolte chez des malades, pour obtenir une quantité suflisante de lymphe.

Nous avons essayé de préparer notre anligène en partant du vaccin glycériné. Nous avons suivi la technique de Casagrandi, telle qu'il a bien voulu nous l’adresser par une lettre personnelle.

Nous résumerons la technique : le contenu pesé, d’un tube de vaccin, et mis dans du sérum physiologique, à raison de 1 p. 50 ; 1l est centrifugé à trois reprises en changeant la solution salée ; le dépôt du vaccin provenant de la centrifugation est trituré au mortier en y ajoutant une quantité de sérum physiologique, de façon à porter la dilution à un rapport qui ne dépasse pas 1 p. 20. Une nouvelle centrifugation est faite de façon à obtenir un liquide seulement opalescent.

Le vaccin préparé selon cette technique peut être employé à forte dose. En effet, on n’observe de déviation spontanée qu'en atteignant le taux de 1 centimètre cube 1/2 environ.

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Mais l'antigène ainsi obtenu, ne nous a pas toujours donné de résultat précis, aussi nous nous sommes surtout servis du vaccin frais de génisse qui a paru, dans toutes nos recherches, comme très nettement supérieur aux autres préparations vaccinales.

Ce vaccin frais nous fût très gracieusement donné par M. le docteur Fasquelle, directeur de l'Institut de vaccine de la rue Ballu. Nous ne saurions trop lui exprimer notre vive gratitude pour l'aimable obligeance avec laquelle :1l a loujours répondu à nos si fréquentes demandes de matériel.

On recueille la pulpe des pustules vaccinales de la génisse au quatrième ou cinquième Jour, la récolte a toujours été employée dans les deux heures qui ont suivi la prise; la pulpe est pesée, elle est finement et longuement broyée dans le mortier, de façon à obtenir une substance bien homogène. On met du sérum physiologique en proportion de 1 p. 50, en ayant soin de ne l'ajouter que lentement, à mesure que le broyage se poursuit. Quand l’'émulsion est faite, le tube est placé à la glacière pendant une 1/2 heure ou 1 heure, afin de laisser déposer les particules un peu volumineuses. Une centrifugation rapide est ensuite faite, pour obtenir un liquide surnageant, à peine opalescent : ce liquide est employé immédiatement, aucune de nos expériences ne fut faite avec un liquide même de la veille et conservé à la glacière.

Titrage. — 1° L’émulsion vaccinale fraîche ne produit jamais à elle seule l’hémolyse ; nous avons à plusieurs reprises inlercalé dans nos expériences des tubes témoins contenant soit :

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a) Antigène, globules rouges, alexine, jamais nous n'avons observé la présence d'une sensibilisatrice à l'égard des globules rouges de mouton constamment employés.

b) Antigène, globules rouges, sensibilisatrice, jamais nous n'avons observé dans notre antigène une quantité d’alexine suffisante pour réactiver l’ambocepteur antimouton toujours employé.

2° L'émulsion vaccinale ne dévie pas à elle seule le complément, à moins d'atteindre les doses très élevées de 1 centimètre cube 3, ou 1,5 C&.

Il est de toute utilité que la liqueur opalescente ne contienne pas de particules solides. Nous avons remarqué dans les tubes témoins, des retards quelquefois considérables à l'hémolyse, quand l’émulsion n’est pas soigneusement faite, et la pulpe parfaitement broyée.

Nous avons employé dans les expériences les doses croissantes d’antigène suivantes :

le plus généralement trois tubes nous donnaient satisfaction, contenant chacun les doses respectives de :

0,2 — 0,5 — 0,7 ou 0,3 — 0,6 — 0,8.

comparativement, les résultats sont semblables entre les deux séries.

En général, dans nos résultats, nous avons observé qu'au-dessous de 0,2 la quantité d’antigène est insuflisante et que le résultat est indifféremment le même avec 0,7 ou 0,9. Il y a souvent une progression très nette dans trois tubes et quelquefois les déviations sont absolues dans les deux derniers tubes, alors qu'il y a une légère hémolyse au premier. Ceci nous a souvent permis

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de suivre toute l'évolution des réactions apparaissant au

troisième tube d’abord, devenant totaie dans les trois,

disparaissant ensuite au premier et au second, pour

demeurer quelque temps encore dans le tube n° 3 conten . 4 Va

nant la plus forte quantité d'antigène.

Dispositif de la réaction. — Nos réactions de fixation furent toujours faites selon le dispositif de la réaction de Wassermann {ypique ramenée à 3 centimètres cubes.

Nous avons constamment fait la série des {émoins, ce

qui pour nos expériences était d'une absolue nécessité. Le vaccin que nous employons ne peut être considéré comme toujours identique à lui-même. L'âge de la vaccination (que nous nous efforcions de choisir de 4 à 5 jours) variait de quelques’ heures. La richesse de la pustule, non toujours semblable, la plus ou moins grande quan-

tité de matières organiques recueillie avec la pulpe, tout. \ Le) er"

cela introduisait forcément dans nos expériences des causes d'erreur dont nous nous rendons compte, et que nous avons tàché d’amender, sans avoir la prétention toutefois d'y être lotalement parvenu.

Aussi, à chaque expérience, avons-nous répété les tubes témoins qui constituent un titrage incessamment refait.

Des cinq tubes lémoins, trois étaient destinés à prouver que les doses respectives d'antigène employées étaient incapables de dévier à elles seules le complément. Le quatrième tube vérifiait la valeur du groupement hémolytique. Le cinquième prouvait que la sensibilisatrice était bien inactivée. |

Les tubes de la réaction étaient également pour chaque

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