CULTURES SUR EMBRYON DE SOURIS HACHÉ

W. Lloyd, Max Theiler et N. I. Ricci furent les premiers à appliquer cette méthode au virus amaril, en 1935. Ils employèrent un procédé de culture qui est sensiblement le même que celui de Rivers et Ward pour la lymphe vaccinale.

Les embryons de souris étaient extraits aseptiquement des utérus de souris gravides et lavés pendant quatre heures dans une solution de Nacl à o, 9 %; ces embryons étaient ensuite coupés en petits carrés de 2 m/m de côté et placés dans une solution de Tyrode préparée selon la formule suivante :

Nacl ENENNNRERE 8 Gr.

RÉGIE ENS" CRAN EEE Oo Gr. ie Cacle) "IN PONEENNENENS NE o Gr'ira

PONS RS o Gr. os KO RN AN ASTRA La IN Gr:

CHUICOSE NS VAS ANTENNES 1 GFS Eau distillée q.s.p. .... x litre

dans les proportions de o Gr. 1 de tissus pour s c/c de solution.

À ce milieu de culture était ajouté ro % en volume de sérum normal d'homme ou de macasus rhésus. Le virus (sérum de singe infecté ou suspension de cerveau de souris infectée) était ensemencé dans les tissus embryonnaires ; l’ensemble placé dans des flacons d'Erlenmeyer hermétiquement bouchés et mis à l’étuve à 37° C. Les flacons avaient été numérotés de façon à ce que chaque subculture puisse être faite de flacon à flacon de numéro correspondant. Toutes ces cultures étaient incubées pendant trois à quatre jours avant le transfert dans un nouveau flacon. On vérifiait de temps en temps l’aseptie du milieu de culture soit par une simple inspection minutieuse (apparition d’un trouble en cas de présence de bactéries) soit en inoculant o cc 1 du milieu dans un tube à pneumocoques en cas de doute. On se rendait compte également à la fin de chaque subculture si le virus était toujours présent, en inoculant à des lots de souris, par la voie intra cérébrale; quelques centimètres cubes du milieu de culture.

Lloyd, Theiler et Ricci, cultivèrent ainsi plusieurs souches de virus amaril viscerotrope ou plus exactement pantrope sur plusieurs milieux en suspension dans une solution de sérum et liquide de Tyrode en flacons d’Erlenmeyer. Ils ont réussi plus de 130 subcultures avec le tissu embryonnaire de souris haché ou de poulet et de testicules de souris adultes; plus de 54 pasasges de la mème souche avec du tissu ha-

ché de cobaye adulte et plus de vingt passages dans le même liquide et derme d’embryon de poulet.

Les souches cultivées par ces auteurs furent : 1° la souche Asibi pantrope ayant subi, en 6 ans + 53 passages

de singe à singe, avec des périodes intermédiaires de vie

chez l’Aedes Œgypti.

Cette souche avait conservé son pouvoir pathogène et

était capable de tuer 95 % des singes trois à sept jours

après l’inoculation.

2° la souche neurotrope française de Dakar ayant subi 305 passages par cerveau de souris.

3° la même souche, mais utilisée après 105 passages seulement.

ls inoculèrent un certain nombre de singes après plusieurs subcultures successives de ces différentes souches sur embryon de souris haché : Après les dix premiers passages, les deux singes inoculés moururent de fièvre jaune. Ils inoculèrent ensuite dix singes avec un virus du 15° au 25° passage. Cinq de ces animaux résistèrent à l’inoculation. Entre les 25° et 45° passages, il n’y eut qu’un seul singe mort sur neuf inoculés. Et enfin, du 45° au 105° passages, aucun des 17 animaux inoculés ne succomba.

Ces auteurs conclurent que le pouvoir viscérotrope du vi. rus décroissait progressivement, sans modification du neurotropisme pendant 130 subcultures.

Il est à noter également que le temps d’incubation était toujours le même, ainsi que l'intervalle séparant le moment de l’inoculation de la mort de l'animal.

Si ces auteurs n'ont jamais rencontré de cas d’encéphalite lorsque l’inoculation était pratiquée en dehors de la voie nerveuse, ils ont cependant constaté que sur les 8 singes ino-

culés par le canal rachidien avec la souche Asibi, un animal seulement présenta une encéphalite, alors qu’avec la souche neurotrope française les 23 singes inoculés par la voie rachidienne contractèrent tous une encéphalite.

De nombreuses expériences ont confirmé le fait que, si une lente augmentation de virulence se rencontre entre les 20° et 28° passages, il s’agit toujours d’une accentuation des caractères viscérotropes, lesquels vont ensuite en diminuant, et après 130 passages, on se trouve en présence d’un virus à virulence viscérotrope diminuée, sans modification du neurotropisme.

La vaccination avec ce virus pantrope atténué, associé à l’immun sérum humain, a été alors tentée et on a réussi à immuniser fortement les singes inoculés par ce procédé.

Il a été prouvé que chaque fois qu’on associait au virus l’immun sérum humain à la dose de o cc 5 par kilogramme de poids d'animal, on pouvait toujours constater la présence d’anticorps dans le sang circulant depuis le moment de l’inoculation jusqu’à l’immunisation totale.

Les expériences de Lloyd, Theiler et Ricci ayant été satisfaisantes chez l’animal, Lloyd tenta alors la vaccination chez l’homme.

Il inocula 20 personnes avec une quantité connue d’immun sérum humain, titré suivant la méthode de Sawyer, Kitchen et Lloyd. Il employa des quantités de virus variant entre 25.000 et 170.000 doses minima mortelles pour la souris et des quantités d’immun sérum humain, variant entre o cc 5 et o cc 6 par kilogramme de poids du corps.

Sur les 20 personnes ainsi vaccinées, 7 seulement présentèrent une légère élévation de température, sans toutefois dépasser 37°7 c. Un sujet présenta de la céphalée, avec sen-

sation de froid et de malaise le 3° jour après l’inoculation. Aucun symptome de maladie ne fut observé chez les autres personnes pendant la période de surveillance. Deux observations détaillées seulement ont pu être prises : De la leucopénie assez marquée a été constatée chez les deux personnes : les 5°, 6° et 7° jour chez l’une; le 6° jour chez l’autre. (4.000 leucocytes par m/m°). Ni l’une ni l’autre ne présentèrent d’albuminurie à aucun moment.

Chez 13 sujets vaccinés, durant la période de 14 à 28 jours qui suivit l’inoculation, on pratiqua la recherche des anticorps protecteurs. On en trouva chez tous, le titre variant entre 1/8 et 1/128; chez aucun d’entre eux on ne décela aucune trace de virus amaril dans leur sang circulant.

Les légères augmentations de température constatées chez 7 Sujets parmi les 20 vaccinés et le fait que cet état subfébril survint chaque fois deux à six jours après la vaccination, permet d’écarter toute idée d’encéphalite amarile, puisque dans cette dernière l’élévation de température s’observe beaucoup plus tard, vers le 7° et même 14° jour et qu’elle est d’une plus grande intensité et d’une plus grande durée.

Aucune des 190 personnes ainsi vaccinées à Londres au moyen du virus cultivé sur tissu vivant d’embryon de souris et d’immun sérum humain n’a eu de réaction suffisamment sérieuse pour l’obliger à s’aliter. En dehors d’une légère céphalée vers le 3° ou 4° jour, les malades ne se sont plaints d’aucun malaise, sauf dans un cas où, cinq jours après l’inoculation, un homme a présenté une amygdalite folliculaire bénigne banale.

En Amérique, ce nouveau genre de vaccination ne sembla guère convaincre les auteurs qui s’intéressaient à cette question .En effet ceux-ci montrèrent que si on prend des cultures

se

bactériologiquement stériles, faites avec des cerveaux de souris apparemment saines et si on injecte à d’autres souris par la voie intra cérébrale le liquide filtré à travers les bougies de Berkefeld, on voit que ce filtrat est pathogène, non seulement pour les nouvelles souris inoculées, mais encore pour les Macacus Rhésus, les rats et les cobayes en produisant des lésions au niveau des méninges et des plexus choroïdes. Les lésions seraient dues à un virus identique à celui de la chorioméningite lymphocytaire décrite par Armstrong et Lillie, en 1934. Ce virus pousse facilement en culture sur sérum-solution de Tyrode et embryon de souris haché, mais comme il est beaucoup plus gros que le virus de la fièvre jaune, on pourrait le séparer par filtration.

Il paraissait donc judicieux d'éviter l'emploi dans le milieu de culture de tissu d’embryon de souris, dans la crainte que le virus de la chorioméningite lymphocytaire ou quelque autre virus comme celui de la glande salivaire des souris, ne puisse être dans le milieu. |

On s'orienta alors vers une autre voie, qu était celle de la culture des virus sur embryon de poulet, déjà étudiée par Lloyd, Theilér et Ricci dans leurs expériences.