ACTION DE L’EXTRAIT EN MILIEU ASEPTIQUE

J'ai déjà signalé (voir p. 28) dans quelle mesure la manifestation d’un phénomène pouvait être masquée par suite des différences de qualité nutritive des milieux. Quand j'ai étudié l’inactivation du milieu par la levure qui y prolifère, J'ai montré que celle-ci, en fournissant un aliment non dosable aux larves, pouvait conduire, sinon à des erreurs, tout au moins à desinexactitudes quant à la valeur réelle des chiffres fournis par les expériences.

Cherchant s’il existe une corrélation entre le nombre de facettes de l'œil Bar et les conditions de nutrition et de développement des larves, j'ai déjà montré (Cuevais, 1942) que cette corrélation n’est pas constante. On peut traduire les qualités nutritives des milieux d'élevage par la durée de la vie larvaire et le poids des mouches; on constate alors que le nombre des facettes n’est pas exclusivement sous la dépendance de ces qualités nutritives. En effet, des milieux de composition différente mais également nutritifs donnent dès mouches dont les yeux peuvent être plus ou moins grands, Inversement, des milieux de composition identique, mais se distinguant par leurs qualités nutritives, conduisent à de fortes variations dans la taille de l’œil. C’est ainsi que des larves, élevées sur des milieux standards ensemencés avec des solutions de levure vivante à des concentrations de plus en plus faibles, fournissent des mouches dont les yeux sont de plus en plus grands: pour les concentrations assurant une nutrition convenable, les yeux des mâles ont 70,6 facettes, alors que pour celles où les qualités nutritives sont les plus défectueuses, le nombre atteint 123,8, soit 1,7 fois plus.

De même, l’activité de milieux contenant de l'extrait de Calliphora sera nettement influencée par la quantité de levure ajoutée aux milieux. Pour les mêmes concentrations que ci-dessus, le nombre de facettes passe de 105,3 à 241,2. Ceci montre clairement que l’action de l'extrait doit être étudiée en dehors de tout autre facteur de modification de la taille de l’œil, et en particulier que la prolifération plus ou moins intense de la levure peut être une cause de variabilité qu’il faut écarter.

En dehors de l'influence qu’elles peuvent avoir sur le métabolisme des larves, les qualités nutritives du milieu sont susceptibles également d’agir indirectement sur les phénomènes étudiés, en allongeant ou raccourcissant la durée de la vie larvaire. Beapze, Tarum et CLancy (1938) ont mis au point une technique qui permet de modifier dans des proportions notables la longueur du développement larvaire. Si l’on fait jeûner des larves âgées de moins de 70 heures (après la ponte de l'œuf), la pupaison se produit plus tard que normalement. Cet accroissement de durée s'accompagne de transformations internes des organes de la larve; en particulier, ses corps gras

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subissent des modifications qui les rendent capables de former et de libérer des substances que l’on ne pouvait pas mettre en évidence dans les larves élevées normalement. C’est ainsi que des larves vermilion qui étaient, jusque-là, incapables de former la substances v* nécessaire à la formation du pigment sauvage de l'œil, parviennent, si on les élève sur un milieu pauvre en levure, à élaborer cette substance à partir de leurs corps gras. Bien que les processus touchés dans ce cas soient éloignés de ceux qui interviennent dans le déterminisme de la taille de l’œil, de tels phénomènes montrent suffisamment que tout le métabolisme des larves est en jeu quand, pour une raison ou pour une autre, surviennent des variations dans la durée de la vie larvaire.

De son côté, BopensTeIN (1939), en sous-alimentant des larves, agit de la même manière sur la période larvaire de mouches Bar. Comme :il a été amené, à la suite d'expériences de transplantation, à supposer que le nombre de facettes de l’œil de l’imago dépend de la durée du séjour du disqué oculaire dans la larve, il cherche à voir si, grâce à la technique de BEapze, Tarum et CLancy, il retrouve cette corrélation. Les résultats obtenus lui montrent que, en raccourcissant la période larvaire, on diminue le nombre des facettes, alors qu’on l’augmente en accroissant cette même période. C’est ainsi que des larves élevées sur un milieu pauvre sont toutes plus ou moins retardées dans leur développement, et que le nombre des facettes est augmenté de façon significative (139 facettes chez les mâles, contre 83 chez les témoins). Mais, comme Bopenstein trouve que ce sont les mouches les plus retardées qui ont les yeux les moins augmentés, ce qui est en contradiction avec les expériences de transplantation, il en vient à penser que le traitement affecte non seulement le développement de l'œil, mais également le développement général de l’organisme.

On doit donc, si l’on veut poursuivre l'étude du comportement de l’œil au cours de la vie des mouches, arriver à concilier tous les facteurs qui peuvent l’influencer. Il faut réaliser un milieu suffisamment nutritif, ne subissant aucune modification durant tout le temps que les larves passent sur lui. Un seul facteur agissant sur le nombre des facettes, à savoir la quantité d'extrait de Calliphora, sera soumis à variations.

Emploi d'un milieu aseptique. — C’est pourquoi j'ai repris une partie des expériences précitées en me servant d’un milieu stérilisé et en utilisant la technique stérile décrite précédemment. Pour toutes ces expériences en conditions aseptiques, c'est le milieu III qui sera employé. Il a été choisi après un certain nombre d’essais comme étant suffisamment nutritif, en absence de levure vivante, pour donner un développement larvaire normal ; la vie des larves y dure 96 heures et les mouches issues de ces larves ont le nombre de facettes et le poids des témoins.

La première expérience conduite dans ces conditions est celle où les larves sont placées, sur un milieu contenant 10 o/o d'extrait, à des âges variés, compris entre o heure et 70 heures. Elle est donc l’'homologue des expériences représentées par les tableaux 1 et 2,et les figures 3 et 4. Ses résultats sont donnés par le tableau g et la figure 10. On voit immédiatement qu'ils sont différents de ceux fournis par les expériences du même type en

L'OEIL DU MUTANT BAR DE LA DROSOPHILE el

RER LC A SP en CR

TABLEAU 9 EE oo ne, Ages TL EE n m mnt n m m/T T 79 111,9 64 74,8 0 1 269 2,40 1 156 2,08 10 11 257,1 2,30 11 169,2 2,26 an 16 246,4 2,20 15 198,9 2,66 “ 18 279,9 2,50 39 172,9 2,91 17 225,4 2,01 32 173,4 2,32 4o 30 240,2 2,15 36 156,5 2,08 45 24 260,6 2,33 27 184,0 2,46 27 210,9 1,88 kr 167,8 2,24 0 47 104,6 0,94 5a 76,6 1,02 70 31 102,1 0,91 55 74,8 1,00

ÉnPme me sosie pipes D QT MU TE

Fig. 10. — Nombre de facettes en fonction de l’Age des larves au moment du transfert sur l'extrait. Technique aseptique.

milieu non stérile. La seconde portion des courbes est bien semblable dans les deux cas, montrant que, en l'absence d'organismes vivants (levure vivante ou bactéries), il existe également une période de sensibilité à l'extrait. Cette période doit avoir les mêmes limites que dans le cas de cultures septiques. Sa fin se place à la 60° heure. Son début est plus difficile à

préciser, car la variabilité (!) entre les différents points de la courbe est grande. Il semble se situer avant la 45° heure, donc probablement vers Lo heures, comme dans les expériences précédentes.

Mais c’est la première portion de la courbe qui diffère ici. En effet, il ne se produit pas d’insensibilisation des larves par l’extrait ingéré durant les Lo premières heures. La courbe est horizontale depuis l’éclosion jusqu’au début de la période de sensibilité. Le fait pour les larves d’avoir absorbé de l'extrait avant ce stade critique ne les empêche pas d’utiliser l'extrait quand elles sont devenues sensibles.

Ce résultat est important, car il semble montrer que le pouvoir insensibilisant de l’extrait ne peut se manifester que sous certaines conditions et, en particulier, seulement en présence de levure vivante. Cela expliquerait alors plusieurs des données fournies au chapitre Il, où l’on a vu que l'insensibilisation ne se retrouvait que lorsque les larves elles-mêmes avaient ingéré l'extrait. La formation de la fraction insensibilisante serait le résultat de processus complexes où interviendraient l'extrait, les larves et la prolifération de la levure.

Il peut y avoir aussi une autre explication à ce manque d’insensibilisation en milieu aseptique. On a vu que, en présence de levure, le pouvoir insensibilisant de l'extrait est fonction de la concentration de celui-ci dans le milieu. On pourrait donc penser que, dans les conditions d’asepsie, la concentration en extrait a été insuffisante pour provoquer l’action de la fraction insensibilisante, celle-ci ne se manifestant que pour un minimum de concentration, comme l’a montré la figure 9. :

IL y aurait donc intérêt à faire des élevages sur un milieu plus concentré en extrait. Malheureusement, l'extrait contient une fraction toxique qui empêche parfois le développement des larves. Dans le tableau 9, deux mouches seulement ont achevé leur développement, sur 60 œufs repiqués sur le milieu. Et si l'on examine les autres chiffres, on voit que, pour un milieu à 10 0/0 d'extrait, le nombre des mouches issues de larves repiquées aux premiers stades, est faible. Si donc l’on veut pouvoir monter dans la gamme des concentrations, il faut auparavant débarrasser l'extrait de ce qui peut le rendre toxique, sans, pour cela, nuire à son activité.

Purification par dialyse. — Le premier moyen de séparation utilisé a été la dialyse sur cellophane d’une solution aqueuse d’extrait. Un essai préliminaire ayant montré la nécessité d’un certain nombre de précautions (asepsie, température), destinées à éviter une altération de l'extrait, un essai plus complet a été réalisé ainsi :

Cent centimètres cubes d’une solution aqueuse d'extrait à 10 o/o sont, après stérilisation, dialysés au travers de cellophane, contre 130 centimètres cubes d’eau distillée, à la température de + 10 à + 20, La solution est laissée ainsi pendant {4 heures, au cours desquelles l’eau distillée est changée 6 fois. Au bout de cetemps, comme aucun produit coloré ne dialyse plus, l'opération

(") Gette variabilité est due au manque de précision dans la détermination de l’âge exact des larves issues des œufs recueillis stérilement. Voir page 43.