MATÉRIEL ET TECHNIQUES

Souches. — Les souches utilisées sont prises parmi celles que nous entretenons au laboratoire à l’état ënbred depuis plus de septans. Avant d’entreprendre les études sur la mutation Bar, la souche Bar et la souche sauvage ont été croisées pendant trois générations pour les rendre isogéniques, et gardées ensuite à l’état inbred.

La liste ci-dessous contient le nom des différents mutants dont il sera question dans ce mémoire. Les noms sont précédés de leur symbole que j'utiliserai dorénavant dans les formules et dans les tableaux, et suivis au nombre moyen de facettes de l'œil de l’imago.

+ Type sauvage : Oregon R. .. . . . g : 661 Q : 698 B POINT me NE ER ere 78 66 B/+ Femelles Bar hétérozygotes, . . . . 285 VEN E STE DIN CT DURE RONDES Aer Pete AE NO 29 25 Bi LNRE EU te pe MS OU RUES LEE 478 348 BÉBAGOuO le EG-BAr ENS ELITE 75 63 v DERULION ES ITS CERN Des comme “+

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Bien que toutes les précautions aient été prises pour maintenir des conditions uniformes d'élevage (température, humidité, composition des milieux), on remarquera que le nombre de facettes peut varier d’une expérience à l’autre. Aussi, chaque résultat expérimental sera accompagné du chiffre du témoin fait en même temps et sur un milieu identique. Toutes les fois que cela sera utile, je donnerai aussi le rapport : chiffre expérimental sur chiffre témoin, et ce seront alors ces rapports qu'il faudra comparer entre eux.

Composition des milieux d'élevage :

Milieustandarde:. Cassonuade Li, 16 gr.

Seénioule detMalssMOULN UT 1S-on.

CAE NN COTES DE RTE 2 gr.

CARS AE PRE re ti HALLe me 100 cm?

Milieu I: NA EN RS ONE NE TO RE 3 gr. DRE UN RE EE ET rate 100 Cm?

Milieu II : levure de boulangerie séchée . 5 gr. AR AP TD PS Ab NL ES Peu Le 3 gr.

RS CT ACT RS EREME PMRRER PTEe AT 100 Cm

(1) Composition de la solution de Ringer : NaCI : 7,5 gr., KOI : 0,35 gr., CaCl: : 0,21 gr. Eau bidistillée : q. 8. 1.000 cm.

Re ER EEE CR 2 CU

Milieu.Il : levure de boulangerie séchée . 5'ent autolysat de levure Byla. . . 5 gr.

ARADESS DAS VEN Lee die VE e Me EDS 3 gr.

RIRES TENUE SRE AE EE 100 cm°

Techniques d'élevage. — Comme onle verra par la suite, il est nécessaire de connaître avec précision l’âge des larves au moment où on les utilise. Pour cela, il y a deux méthodes.

La première consiste à prendre des œufs aussitôt après la ponte. Quand les femelles utilisées à cette fin sont âgées de quelques jours déjà, et suffisamment nourries,les œufs pondus sont âgés de deux à trois heures (depuis leur fécondation). La technique consiste donc à placer dans un bocal, où l’on a mis une trentaine de femelles et une trentaine de mâles, une cuiller contenant environ 10 centimètres cubes de milieu standard. Deux à quatre heures après (suivant la précision requise) on retire la cuiller et on la garde dans une boîte de Pétri. Vingt-deux heures après, la plupart des œufs sont éclos.

La seconde méthode consiste à prélever, non des œufs, mais des larves nouvellement écloses des œufs. Pour cela, on laisse la cuiller 24 heures en présence des mouches. Puis on la sort du bocal, et on retire toutes les larves déjà écloses. Deux à quatre heures après, on prélève les larves écloses pendant cet intervalle de temps. Cette méthode est plus précise que la première, car l’âge des œufs pondus reste toujours approximatif, et, par conséquent, le délai de 22 heures n’est qu’une moyenne.

Technique ordinaire. — On utilise la seconde méthode de prélèvement. L'âge des larves est donc connu, à deux ou quatre heures près, depuis leur éclosion. Les larves nouvellement écloses sont alors repiquées dans un cristallisoir contenant 100 centimètres cubes environ de milieu standard, au nombre de 150 par cristalhsoir. Elles sont ensuite sorties des cristallisoirs au moment de l’expérimentation, lavées plusieurs fois au Ringeret à l'alcool à 95°, et soit opérées soit remises sur les milieux à expérimenter.

Technique aseptique. — L'asepsie des larves est réalisée suivant la méthode de Tarum et BEaoze (1939). Des œufs (première méthode de prélevement) pondus sur des cuillers stérilisées sont plongés pendant 10 minutes dans l’alcool à 85°, puis repiqués au nombre de 40 dans des tubes contenant 4 centimètres cubes de milieu I stérilisé. Au moment de l’expérimentation, les larves sont sorties en prenant les précautions ordinaires d’asepsie, et placées sur les milieux à étudier, eux-mêmes stérilisés. Quand toutes les larves sont pupées, un test bactériologique est fait pour chaque tube, et les tubes non stériles sont éliminés. Par cette technique, le nombre des tubes non stériles n’atteint pas 5 0/0 du nombre total. Comme ici le prélèvement est fait à la ponte, il y a lieu de retirer 22 heures pour avoir l'âge en période de vie larvaire. Pour simplifier le texte, je donnerai toujours les âges à partir de l’éclosion des larves, comme pour la technique ordinaire, la période correspondant à la vie embryonnaire ayant été déduite au préalable.

Pour les expériences d'implantation ou d’injection, c’est le milieu standard qui est utilisé depuis la ponte jusqu’à l’éclosion des mouches.

Pour les expériences d'action de l'extrait de Calliphora ou des différentes substances essayées, les larves sont élevées d’abord sur le milieu standard, puis, à l’âge requis, elles sont transportées sur le milieu I ou II (cas de la

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technique ordinaire) ou sur le milieu II stérilisé (cas de la technique aseptique) auxquels on a mélangé, en proportions connues, la substance à expérimenter.

Il faut 1 centimètre cube de milieu par fraction de 10 larves pour assurer une bonne nutrition. Sauf pour les expériences utilisant la technique aseptique, les milieux sont badigeonnés avant l'introduction des larves, avec une solution de levure de boulangerie à 20 0/0 (20 gr. de levure fraiche pour 100 em de solution).

Dans ces conditions, et à la température de 25° + 0,2 à laquelle sont conduites toutes les expériences, les temps de développement sont :

pour l'œuf : 22 heures.

pour les larves : 96 heures.

pour les pupes : 96 heures {depuis le début de la prépusaison).

Comptage des facettes. — Dès leur éclosion, les mouches sont fixées et conservées dans l’acétone. Pour compter le nombre de facettes, on procède ainsi : les mouches sont sorties de l’acétone, et plongées 8 minutes dans une solution de potasse à 10 0/0 bouillante. Elles sont ensuite colorées à l'acide pyrogallique et disséquées dans l’eau. Les yeux, dont il ne reste que

Fig. 2. — Yeux préparés pour le comptage des facettes. I : œil Bar normal (67 facettes) ; II : œil provenant d’une larve Bar traitée par l'extrait (433 facettes).

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la cornée formée de l’ensemble des facettes, sont montés dans l’eau entre lame et lamelle et projetés, à l'appareil d'Edinger, sur un écran vertical. Il est très facile alors de totaliser avec un petit compteur à main supportant un crayon, les facettes dont l'image a une surface de 2 à 3 centimètres carrés. Ce procédé est beaucoup moins fatigant que celui à la chambre claire et aucune erreur n’est possible, l'œil étant entièrement visible etchaque facette étant marquée après son comptage.

La figure 2 montre deux yeux ainsi préparés pour le comptage des facettes. L'œil I est un Bar normal (67 facettes), l'œil IÏ provient d’une mouche Bar dont la larve a reçu, per os, de l'extractif de Calliphora : il possède 433 facettes ; quand les yeux atteignent une grande surface, il est nécessaire de les entailler pour qu’ils puissent s'étaler facilement sous la lamelle.

Implantations et injections. — Les techniques d’implantationet d'injection sont celles utilisées par EPparussi et Brapze (1936). Comme les opérations doivent être faites dans des larves très jeunes, âgées de 4o heures, le taux de mortalité est très élevé. La mortalité est provoquée par la quantité de liquide injecté plutôt que par sa nature, les solutions étant faites dans le Ringer. Aussi, pour éviter d’injecter une trop forte quantité de liquide, on ajoute 0,1 0/0 de rouge neutre aux solutions. On peut ainsi se rendre compte grossièrement de la quantité de liquide injecté au moment de l'opération. Par cette méthode, on injecte environ o mm 05 dans une larve de ho heures. Naturellement, le rouge neutre a été essayé auparavant : 1l n'a aucune action sur la vitalité des mouches ni sur la taille de l'œil.

Préparation de l'extrait de Calliphora.— Des pupes jeunes de Calliphora sont desséchées sous vide. Elles peuvent ainsi se conserver plusieurs années sans s’altérer. Au moment de l'extraction, elles sont broyées finement et dégraissées par cinq passages dans du chloroforme bouillant. La poudre dégraissée est ensuite reprise cinq fois par de l'alcool à 95°-960 à la température de 65°. L'alcool est distillé à 65° sous vide partiel et l’extrait repris par l’eau distillée, puis desséché. On obtient 25 à 30 grammes d'extrait sec à partir de 1 kilogramme de pupes séchées. L’extrait peut se garder au dessiccateur pendant plusieurs années sans perdre son activité. Au moment de l'emploi, il est dissous dans le Ringer au bain-marie et incorporé aux milieux utilisés ou injecté tel quel.

Abréviations. — Outre les symboles génétiques dont j'ai donné la liste, les abréviations suivantes seront utilisées dans les tableaux :

n : nombre d'individus observés.

m : moyenne du nombre de facettes (œil droit) des n individus correspondants.

T : témoin propre à l'expérience.

m/T : rapport du nombre de facettes expérimental au nombre de facettes : du témoin T,

Conc. : concentration des milieux d'élevage en extrait.

Age : âge des larves au moment de l’expérience, exprimé en heures depuis l’éclosion.