PRÉPARATION DES SPÉCIMENS BIOLOGIQUES DESTINÉS A L'EXAMEN
1** Sang. — a) Pour les recherches bactériologiques, Tasepsie est évidemment essentielle.
La peau (lobule de Toreille, extrémité digitale) sera nettoyée à Talcool à 90^, séchée avec du coton stérilisé, piquée avec une aiguille stérilisée, pressée de façon à faire perier une goutte de sang. La gouttelette de sang
ainsi obtenue est touchée avec le milieu d'un des bords d'une lame porte-objet, nettoyée préalablement à Talcool-éther et séchée. Ce bord enduit de sang est mis en contact sur toute son étendue avec la face supérieure d'une autre lame nettoyée et séchée de même. Quand le sang s'est bien étendu sur toute la longueur de l'angle formé par les deux lames, on fait glisser rapidement et légèrement la première sur la seconde, soit en poussant dans la direction de l'angle obtus, soit en tirant dans la direction de l'angle aigu. Le sang doit s'étaler en une couche mince et uniforme. On fera sécher rapidement par agitaticn douce dans l'air.
Suivant les colorants il conviendra ou non de fixer la préparation.
Si les colorants sont dissous dans l'alcool méthylique pur (.Jenner, Leishmann, etc.), la fixation est
inutile. Le colorant agit comme fixa- Fig. 415. — a kd. Les quatre temps suc- ^^yp cessifs de l'exécution <i*un frottis du ,v t^ v i. //*i •
sang. — e, aspect que doit présenter le o) Pour quelques recherches (filai-
frottis terminé (d'après M. Langeron). res), il est nécessaire d'employer des
enduits épais de sang. Dans ce cas on n'étalera pas les gouttes, mais, au contraire, on en réunira plusieurs en une) seule qu*on laissera sécher. On emploiera ensuite divers artifices que nous indiquerons.
2® Culture. — Déposer avec les précautions d'asepsie élémentaires une goutte de culture sur une lame, laisser sécher ou étaler suivant les cas.
3® Pus. — ^[^Procéder comme pour le sang. S'il est trop épais, le diluer avec une goutte de sérum artificiel.
40 Crachats. — Placer une particule de crachat sur une lame porteobjet ; écraser avec une seconde lame ; frotter les deux surfaces en contact jusqu'à écrasement et mélange parfaits; séparer les deux lames; para-
TECHNIQUE BACTÉRIOLOGIQUE 373
chevcr rétalement sur chaque lame avec une lame propre ; laisser sécher à Tair ; fixer en passant la lame (ou la lamelle), enduit en haut, à travers la flamme d'une lampe à alcool ou d'un bec Bunsen.
Homogénéisation des crachats.
1° Recueillir toute l'expectoration (100 à 200 centimètres cubes ou davantage). Ajouter une égale quantité d'anliformine» Laisser séjourner pendant deux à quatre heures au thermostat.
2^ Centrifuger à une grande vitesse tout ce qui a été homogénéisé ; décanter et laver à deux reprises différentes avec une solution physiologique.
3° Étendre en mince couche tout le résidu sur plusieurs lames que Ton colorera par la fuschsine phéniquée de Ziehl. Puis décolorer par les acides et Talcool.
Uaniiformine que Ton peut préparer soi-même est un mélange à parties égales d*hypochlorite de soude (eau de Javcl) et de soude caustique à 15 p. 100.
50 Exsudais de la gorge» — Enlever un fragment d'exsudat avec un tampon stérilisé monté sur une pince ou un porte-coton (au besoin on le stériliserait extemporanément par immersion dans Teau bouillante) ; frotter le tampon sur une lame nettoyée et stérilisée ; opérer ensuite comme avec les crachats.
60 Frottis d'organes. — Racler Torgane (par exemple ulcération génitale, coupe de foie, etc.) avec le bord d'une lamelle de façon à recueillir un peu de la matière à examiner, continuer comme pour un enduit de sang.
3. MODES DE FIXATION LES PLUS USUELS. — Suivant les cas on fixe la préparation :
a) Soit par la flamme, en coupant ladite flamme, quatre ou cinq fois avec la lame, face chargée en haut, de façon à ne pas dépasser (approximativement) 70 à 80« ;
b) Soit par un mélange à parties égales d'alcool-éther (aa) ; verser 2 ou 3 gouttes sur la préparation sèche, laisser évaporer ;
c) Soit par les vapeurs de formol. Verser du formol (formol du commerce à 40 p. 100) dans un verre de montre. Chauffer jusqu*à émission de vapeurs. Exposer les lames, face enduite en bas, pendant une minute ;
d) Soit par Talcool absolu. Pour empêcher l'alcool absolu de s'hydrater, le mettre dans un flacon à large ouverture, au fond duquel on dispose une couche de 2 à 3 centimètres de sulfate de cuivre anhydre. On reconnaît que le sulfate de cuivre est saturé d'eau et doit être changé, lorsque, de blanc, il est devenu totalement bleu.
On plonge les lames à fixer dans ce flacon pendant une à quinze minutes, suivant les cas. Puis on sèche à l'air libre ;
e) Soit par l'acide chromique à 1 p. 100 (acide chromique : 1 gr. ; eau distillée : 100 gr.).
On plonge la préparation dans le mélange pour la ressortir aassilôL On lave soigneusement, à Fesam» On laisse sécheF.
4. LES MODES DE COLORATION LES PUiS USUELS — ha pféparation, séchée et fixée comme il vient d'être dit, est colorée. Nous rappellerons seulement les deux modes de coloration élémentaire les plus généraux : coloration générale, méthode de Gram. Les méthodes et artifices particuliers et spéciaux (méthode dc'Ziehl, etc.) seront décritSj s'il y a lieu, à l'occasion de la bactérie pathogène pour laquelle ils ont été imaginés.
a) Coloration générale. ^ — Faire tomber sur la préparation séchée et fixée 2 à 3 gouttes de la solution colorante, laisser en contact une demi à une minute (ou plus suivant les cas). Laver à l'eau, de préférence au moyen d!une pissette, et en ayant soin que le jet n'atteigne pas la partie colorée, pour ne pas entraîner lc8 microbes. Sécher de préférence au papier buvard. Examiner.
En bien des cas^ il est indiqué de laver et de décolorer légèrement, après le lavage à l'eau, au moyen de quelques gouttes d'afcool absolu ; l'assèchement se fait alors automatiquement par évaporation de l'alcool. On peut quelquefois encore, après l'alcool, clarifier la préparation par lavage au xylol.
En cas d'examen avec un fort grossissement (objectif à immersion), déposer sur la préparation une goutte d'huile de cèdre, dans laqu4?lle plongera la lentille de l'objectif pendant l'examen. Après examen on enlèvera l'huile de cèdre par lavage au xylol.
b) Méthode de Gram. — Colorer au violet de gentiane phénolé ou aniline environ 30 à 50 secondes. Sécher au papier buvard, sans laver ; verser la solution iodo-iodurée de Gram (iode, 1 gr. ; iodure de potassium, 2 gr. ; eau distillée, 200 gr.), ou plonger la lame dans un récipient renfermant ladite solution. Laisser agir une minute ; retirer la lame, et laver à l'alcool absolu et goutte à goutte, jusqu'à ce que la préparation ne se décolore plus. Laver doucement à l'eau, sécher au l»uvard ; recolorer trente secondes à l'éosine.
On dit qu^un organisme u tient le Gram ^> lorsqu^il retient le violet quand on le traite par la méthode de Gram ; il ne « lient pas le Gram » quandy décoloré par l'alcool, il abandonne le violet :
Microorganii-m.s à Gram positif Streptoco jue , Staphylocoque, (tenant le Giam) : Pneumocoque, B, diphtérique,
B. du tétanos, Actinomyces.
Microorganismos à Grom nrgatif Gonoco jue, Méningocoque,B. ty- (ne tenant pas le Gnm) : phique, B. co'i, B. de la peste,
Micrococciis melitensis.
c) Bîéthode de Ziehl (voir ci-dessous à Bacille de Koch).
TECHNIQUE BACTÉRIOLOGIQUE 375
Classification morphologique élémentaire des bactéries.
CLASSIFICATION DES BACTÉRIES ((VapTès Grimbert).
Rondes ,
Isolées Micrococcus
Par groupe de deux Diplococcus ^
Bn amas Siaphylococcus itm
En chapelets Stmptococcus •••^
Par groupe de quatre Telracoccus tt
En amas cubiques Sarcina
A peine plus iongues que larges. Baclerium,
Lonir^ies ! Beaucoup pk» longues que larges. Bacillus
( Id. en chapelets SlrepiohacUlus
L En virgule Vibrio. ^.
( En spirale allongée... "Bpirillum
5. COLORATION ET CARACTÈRES MICRC3SaOPIQUES DES PRINCI- PALES BACTÉRIES PATHOGÈNCS.
Bacille de Koch. — La préparation (crachats homogénéisés ou non, centrifuges ou non, culot de liquide -cqphalo-rachîdien centrifugé, etc., etc.) étant préparée comme il a été dit ci-dessus, séchée et fixée à la flamme, verser fuchsine de Ziehl et chauffer sur flamme ou mieux sur plaque chauffante jusqu'à émission de vapeurs (cinq à dix minutes), en remettant au besoin du Ziehl pour éviter la dessiccation. Laver largement et longuement à l'eau. Décolorer le fond par immersion d'environ dix secondes dans acide azotique au tiers ou acide chlorhydrique au quart. Laver à nouveau à Teau jusqu'à teinte pelure d'oignon de l'ensemble de la préparation. Pousser la déceioration par lavage, goutte à goutte, à l'alcool éthylique ou méthylique jusqu'à ce que celui-ci ne se colore plus. Rincera l'eau, sécher. Colorer le fond en versant quelques? gouttes de solution aqueuse de bieu de méthylène (trente secondes). Laisser égoutter le bain colorant, laver vivement à l'eau. Sécher au buvard et à la chaleur douce. Monter au baume de xylol. Examiner à l'immersion.
Les bacilles de Koch (acido-résistants) prennent une coloration rouge, les autres microbes et les noyaux cellulaires sont colorés en bleu.
Aspect. — Petits bâtonnets assez longs et grêles, droits ou incurvés, iholéstou en .petits amas, uniformément colorés en rouge sur toute leur longueur ou au contraire granuleux.
Méthode de Biol. — On procède comme ci-dessus pour la coloration parle Ziehl et )a décoloration par l'acide azotique et l'alcool, puis, après ^ un lavage à l'eau, on renforce la colora-
\ ï-l i = tion par immersion de quelques minutes
^\ 1 S-g ^ dans le formol pur. Les bacilles prennent
gi \ -.2'^ S une belle teinte violacée, presque noire,
Hk * 3. S 2 ^ qui dispense de faire une coloration du
fond.
1 gg- - 5 ■« "" g. Pneumocoques. — Préparer un mince
^Ja" ■*'■>. enduit de crachat, de salive ou de sang,
^ ^ Faire sécher. Fixer par la chaleur. Toutes les couleurs d'aniline, le bleu de méthylène, la thionine phéniquée, le violet de gentiane donnent de bons résultats.
Le pneumocoque prend le Gram.
Si l'on voulait mettre la capsule en évidence, on opérerait de la manière suivante :
Verser sur la préparation quelques gouttes d'acide acétique glacial, égoutter aussitôt.
Sans laver, traiter au violet de gentiane aniline.
Laver dans une solution de NaCI à
Examiner à l'état humide ou bien sécher et monter au baume.
Le coccus prend une coloration foncée et est entouré d'une capsule violet très p;ile.
Aspect. — Diplocoques lancéolés (en flamme de bougie), en capsules, ayant tendance à se meUrc en courtes chalneltes.
Bacille de l'Influenza (coccobacille de l'feilTer). — Frottis de sécrétions nasales ou de crachats.
Colorer trente secondes avec fuchi^il.e phéniqué'i étendue de 10 fois son volume d'eau.
Les bacilles se présentent sous forme de petits corps surtout colorés aux exti-émités ; beaucoup sont inclus dans le cytoplasme des leucocytes.
Aspect. — Coccobacilles extrêmement petits, à extrémités arrondies, isolés ou en courtes chaînettes de 2 à 4.
TECHNIQUE BACTÉRtOLOGIQVE
Qonocoque. — Pus étaté sur lames.
r,;i tliiniiini; phéniquée donne d'excellenles préparation!!!.
Le gunnriiqiie ne lient pas le Grani, ce qui en rend, le eus échéant, la
iK ^
- Crscliot tuberculeux a
lugéniUBliun (d'ajir^B lJt>xu[Li;oii).
ditTi'i'enciation très facile avec les autres microbes de la sii]i[niraUnn {staphylocoques, streptocoques), qui, eux, tiennent le Grani.
Fig. 418.— Crnchat li
I ;d'apr6s Berriiiçuii). ^^M
Aspect. — ' En grain de café, disposés par deux, se regardant par leui mrfaeu plati-. En amas, jamais en chaînettes. Le plus souvent inlracel
378 TECH.\ÎQVES MÉDICALES CÉNÊIiALES
Méningite cérébro-spinale. — Liquida céplialo-rachidicii centrifuge : culoL étalé sur larties.
La thionine phéniqufic donne d'excellentes préparations. Comme le gon(iL-o(|uc, le rnéTiinyiHTiqnr nr lirn' pris le (',\-,,n
''ff^
Fi|r. 420. — Pus â pneumocoques (d'après BPïnricon).
Aspect. — Cocci, le plus souvent en" diplotoques, aplatis au nivet leur surface de contacl. Ils siint le plus souvent inlracetlulaires. lis forment J des Jimas plus ou moins nombreux, mais pas do chaînettes.
Syphilis. Treponema pallidum. — Pratiquement, e'est dans le s
TECHNIQUE BACTERIOLOGIQUE 379-
le produit de raclage du chancre induré que le praticien aura surtout à reihcrclier le spirochéte de la syphilis.
l'jg. m. — Pneumocoques dans le pus (d'après Bcznnçon).
û) La sérosité mélangée de sang, obtenue sur le bord de la lame (ou lamelle;, est étalée sur wm: luiitc porli'-cihjct sois^neusonicnt dégraissée à
Pig. 423. — l'nciiinobiioilles,
l'alc'uol-élher. La préparation est fixée en la passant trois fois sur la flamme et colorée rapidement au moyen d'un mélange préparé exlemporanément:
SoluUoD de GieniBB X il XV guullea.
Solution de carbonale de BOude ù I p. 1000... X —
Ehu dislillèe 10 centimèlrL'S cubes.
qu'on verse sur la lame en'quatre ou cinq fois en iliautTant chaque fois ' légèrement.
Les apii-ochètea sont recherchés à rimmcrsioii.
b) On peut colorer lentement par immersion, |iondaiil Irois quart» ; d'heure dans le même mi^lange.
c} Sabrazf'3 a recommandé un proci^di^ simple que voici:
Co procédé consiste h utiliser simplemenl la fuchsine phéniquée de ZMilv' qui se trouve sur toutes les tahlea de lalioratoire et qu'on étend de 3 à ^ 5 parties d'eau distillée. Qu'il s'agisse de préparations desséchées depniÉj
TECHNIQUE BACTÉRIOLOGIQUE
quelques instants ou dtîjà depuis plusieurs heures, on met une goutte de cette solution colorante au milieu d'une lamelle et on renverse cette
r Vk*^«^
Cf jf^^
ft^» v*c
>il»
Fig. 425. — Méuingocoqiios (d'iiprÈs Bezançon).
lamelle chargée sur le Trotlis bien étalé à la surface d'une lame, sec, mais non fixé au sens histologique du mot. Instantanément, les spirochètes
du frottis se colorent en rouge net ; cette teinte est cependant terne par rapport à celle des autres microbes. L'examen à un fort éclairage [bec
Aller, IcuLîlie convergpnte, Abbe, diapbragnie moyen, immersion hiiileiise), i à un grossissGinent de 80(1 à I (X)n diamrlri'p. permet une très facile ]
Fig. 427. — Bacille de Ducroy. Chancre
recherche des apirochètes de Schaudinn dans ces préparations, dont lac ■ coloration se renforce encore dans les lifnros qui suivent.
i'ig, 428. — Sang. — Bncillc du fliarlion.
Aapect. — Petit élément filiforme, ayant 10 à 15 tours de spires scrré^ | réguliers et fins. Souvent accolés, souvent en Y,
TECHNIQUE BACTÉRIOLOGIQUE
Bacille de Ducrey (chancre inoii). — Pus tJtalc sur lame.
<.!oloration h la-Miionine. Ne prend pas le Gram.
Aspect. — ■ Bacille d'aspect caraclérislique. — Chalneltes de court bâtonnet,
lé3 arrondies et doni le centre se colore moins que les ex
réinilès
taoo
Fig. 1-29. — Tétanos (d'après Bezançon).
Bactéridie charbonneuse (charbon). — Une goutte de Bviosité prise au niveau de la pustule maligne est, étalée sur lame.
Coloriilion fi la thionine phéniquée. Prend le Gram.
Aspect. — Bâtonnet caraclérislique, assez' long et épais, isolé ou on courtes '.{chaînettes ; extrémités nettement coupées à anele droit.
Bacille de Nicolaler (tétanos). — Examen dirent du jius étalé sur lames.
Coloration par la thionine.
Prend le Gram.
Bacilles allongés et fins (rarement sporulés).
Aspect. — Dans les cultures, la sporulation est fréquente el l'on peut comparer le bacille à un clou ou à une baguette de tambour.
Bacille diphtérique. — On
examine des frottis de fausses membranes, d'exsudats. pharyngés, de mucus nasal.
Coloration par la thionine ou le bleu de Roux.
On met sur la préparation une goutte de colorant et on pose par-dess
DipUK
|irè>i UegLis
une- lamelle. (In examine aiissUôi à l'immersion : le hacille de Lofllcr coltirepluB vile et d'une façon plus intense que les autres.
En cas de doute, Taire un Gram, sans trop déeoiorer ; le l'iicill^ de Lûtller garde le Gram.
Aspect. — On voit des bfitonnets, généralement assez tongs, parfois courts, en amas irréguliers.
F.n cas ih résullal négalif, faire une eulhire sur si!runi d« breuf coagulé. Mettre à l'étuve à 37°.
Au bout de seize à dix-huit heures, on voit de petites colonies grisâtres, en tache de liougie.
Bacille fusiforine et spirille de Vincent, — Frottis, sur lames, de i fausses nicniliranes ou d'exsuclats pria sur une ulcération.
Coloration à la tliiunine phcnîquée.
Le bacille tusiforme est un bâtonnet renflé au centre, en fuseau, ne prenant pas le Gram (le bacille de Lôfller prend le Gram).
Flg. 431. — Angine de Vincunl {d'après Be^anvon).
Les spirilles que l'on trouve associées au bacille (usiforme sont plus I volumineuseiiquele tréponème delà syphilis, qui, d'ailleurs, ne secolorfi I pas par ces colorations usuelles.
Staphylocoque (furoncles, anthrax, phlegmons, etc.). — Pus étalé sur lames.
Coloration par ta thionine. Prend le Gram,
aspect, — Cocci en amas, en grappe de raisin.
Streptocoques (érysipèle, fièvre puerpérale, etc.), — Pus étalé sur
TECHNIQUE BACTÉRIOLOGIQUE .185
Colnraliiiii pai- la thionine. Pr»?nd généralement le Grani, mais pas toujours.
(. — ChaliioUes de au-rï. longues pt Hpx
T'ii;. 432. — Pus à staphylocoques (d'après BezBngnn).
Peste. — [.e liacille de la peste, surtout facile à obtenir sur frottis tle la pulpe des bubons des pestiférés, est court, trapu, se colorant faellenient par les couleurs d'aniline et ne prenant pas le Gram.
Aspect, — Le cenlre du bacille se colorant beaucoup moins que les extrômités, il en résulte un aspect tout à tait caractéristique d'un bâlonnet court légèrement uvoîde à extrémilés colorées, à centre clair.
Inoculation. —1.^ cobayes et les rais, particuIièrRment sensibles à l'iiiocu-B
lationpesleuscdela pulpe'des btibons pestiférés, meurent en peu de jours avec 1 une septicémie pesleuse avec adéntipalliies (arcies de bacilles spécifiques. I
ei bouillon (il'Hprëa Bczaii^on).
Choléra, — Bechercher à la surlace des selles un petit flocon blanchâtre, ] ayant l'apparence d'un grain de riz, grain dit riziforme. En détacher ua J
fragment, en laire des Trottis : l'un sera coloré au bleu phéniqué de KQlutJ l'autre traité par la méthode de Gram. Les vibrions cholériques ne tiennent pas |p Gram. Ils se colorent très facilement par la fuchsine de Ziehl.
Aspect. — ^^ Microorçanisme en forme de bacille très court légèrement^ recourbé sur Iui-m6me : bacille virgule.
Il peut être vu sans coloration à un fort grossissement : ainsi examini,!
TECHNIQUE BACTÉRIOLOGIQUE 385
est lrf« mobile ; des bncillcs juxLaposës bout à bout peuvent se préseuti-i sous forme plus allungei- en torme it'S.
Kig. 430. ^ Uysi-nlerie umibieiiiiu [pri^làvotneril dans les sfllcs).
Dysenterie. — Bacille de la dysenterie. — On le trouvera dans les selles
des sujets atteints de dyseiitnric bacillaire, surtout dans la première
fe>v
Fig. I.'IT. —T.
.,„l,ri, |..,.'
h.irc (]) relèvement da
ns lo> aolles).
semaine de la maladie. Elans les cas chroniques on le trouvera au moment
des poussées aiguSs.
388 TECHNIQUES MÉDICALES GÉNÉHALES
Aspect. — Bâtonnet Irôs mobile à Torl grossisscmenl. sans coluniLionJ ayaiil à peu près le même aspect que le colibacille, II ne tient pas le GraïaJ
Amibes. — La dysenterie aiiiibiecne s'est révi^léc au cours de la guerr d'une fréquence insoupçonnée. On trouvera tous les détailb technique) nécessaires à la reehcrche de ces parasites et de leurs kystes au chapitn de la s^méiologie du tube dî^stit consacré A l'examen des selles.
