II. Bactéries ou schizomycètes

Les premiers, champignons sans véritable mycélium, se développent d’habitude par bourgeonnement, mais ils peuvent, dans des conditions très particulières, donner lieu à la formation de spores, au nombre de 2 à 4 par cellule de levûre.

Les bactéries, dénommées aussi schizophytes, sont caractérisées par des cellules variables de dimensions et de forme, dont le grand diamètre

ne dépasse pas ordinairement 10 millièmes de millimètre (10 p); elles ont également deux modes de reproduction, par scissiparité et par sporulation; ce dernier mode apparaît généralement dans les cas où le milieu devient peu favorable au ferment.

On n’a observé de reproduction sexuée ni pour les levùres ni pour les bactéries. Et pourtant la biologie nous enseigne que, pour les autres êtres, l’accouplement ne doit pas manquer dans le cycle des transmutations, sous peine devoir les espèces s|affaiblir. Les ferments feraient-ils seuls exception à cette loi? Cela n’est pas prouvé, et nous sommes ramenés à cette hypothèse déjà indiquée, d’après laquelle les ferments ne constitueraient qu’un état particulier de quelque organisme supérieur (moisissure ou algue).

Les levûres sont bien connues, au point de vue botanique, depuis le beau travail de Rees ; ce sont indubitablement des champignons, et l’analyse chimique y indique la présence d’une notable proportion de cellulose, moindre cependant que dans les moisissures. Par contre, la levûre renferme une quantité d’albuminoïdes plus grande encore que celles-ci, et à plus forte raison plu» grande que les végétaux supérieurs.

Quant aux bactéries, il est plus difficile de leur assigner une place déterminée dans la classification des êtres vivants.

La plupart des savants, et parmi eux M. Robin et M. Cohn, les rangent sans hésiter parmi les algues; et pour certains d’entre eux, les micrococcus associés en chaînettes, par exemple, cette opinion peut être adoptée.

Mais on peut se demander si l’on doit être aussi affirmatif pour les bactéries douées de mouvement , notamment pour les genres bactérium, vibrio et spirillum?

M. Pasteur a « toujours été porté à considérer les vibrions comme des animaux, à cause des caractères propres de leurs mouvements ». A cet argument, dont la valeur a été contestée, on peut en ajouter aujourd’hui un nouveau, tiré de la composition chimique des bactéries de la putréfaction. A l’état sec, ces êtres sont formés aux quatre cinquièmes et plus de matières albuminoïdes, tandis que les parties insolubles dans la potasse, qui renferment peut-être un peu de cellulose, — la chose n’a pas été démontrée, — s’élèvent à peine à un vingtième, composition qui se rapproche singulièrement de celle d’un tissu animal.

Du reste, la question de la classification des êtres qui sont placés aux confins des deux règnes, et pour lesquels M. Ilaeckel a créé un règne spécial, les protistes, ne peut recevoir une solution mathématique.

Il en est des êtres organisés comme des corps inorganiques : la division des corps simples en métalloïdes et métaux a disparu avec les progrès de la chimie.

De même, moisissures, levûres et bactéries nous offrent un exemple frappant de ce passage graduel du règne végétal au règne animal.

culture des microbes. — L’air et les corps qui nous entourent étant souillés de germes de toute nature, il est de première nécessité d’exclure ces germes, lorsqu’il s’agit d’obtenir une culture pure d’un microbe.

A l’aide d’appareils de forme variée, on débarrasse l’air de ses germes en suspension, avant de le faire arriver au contact du liquide; quant aux spores préexistant dans les liquides, on les élimine par divers procédés de stérilisation. Il faut, en outre, posséder des germes d’un microbe unique et connaître le milieu dans lequel il se développe de préférence. Nous allons examiner ces divers points.

FERMENTATIONS. — 811

FERMENTATIONS

1° Appareils. — Primitivement, M. Pasteur employait un simple ballon dont le col était effilé en tube étroit et recourbé vers le bas, comme le montre la figure 66 ; l’air, étant obligé de parcourir les sinuosités du tube étroit, dépose contre les parois les germes qu’il tient en suspension. Les liquides les plus altérables, urine, bouillon,

épais de 1 à lcm,5. La figure 68 représente le flacon de M. Pasteur, fermé par une calotte iodée que l’on enlève, au moment de remplir 1 appareil et de faire les ensemencements. Dans d au-

Fig. GO. — Ballon simplo do M. Tasteur.

moût de bière, placés dans un tel ballon, puis rendus stériles par la chaleur, se conservent intacts pendant des années, preuve que les poussières atmosphériques ne peuvent y entrer [Pasteur, Ann. Chim. Phys., (il), t. LXIVJ.

Ce dispositif, très parfait lorsqu’il s’agit d’éprouver et de réfuter la doctrine des générations spontanées, ne se prête guère à la culture des ferments. Le ballon à deux tubulures de la figure 67 est préférable.

L’une des tubulures sert à l’introduction de la semence et est fermée ensuite à la lampe, ou plus

Fig. G'. — Ballon tubulé de M. Pasteur.

simplement par un tube de caoutchouc que l’on peut fermer lui-mème par un bout de baguette de verre ; l’autre tubulure est effilée et recourbée. Un tel ballon est aussi d’un emploi commode, lorsqu’il s’agit de cultiver un microbe aérobie; la courte tubulure sert alors à l’introduction d’air pur, c’est-à-dire débarrassé de germes, soit par filtration sur une couche de coton, soit par le passage à travers un tube chauffé au rouge.

Dans les appareils employés ordinairement aujourd’hui, on se contente de séparer l’air du liquide fermentescible par un tampon d’umianie

Fig. 68. — Flacon Fig. 09. — Flacon de culture de de M. Pasteur. M. Pasteur. Dernier modèle adopté.

très appareils, dont les figures 69, 70. 71, donnent une idée suffisante, on exécute ces opérations en faisant arriver les liquides par des pointes latérales; avant d’ouvrir celles-ci, on a soin de les passer dans une flamme, de les flamber, pour détruire les germes adhérents au verre.

On peut, aussi se servir simplement de petits ballons ordinaires

Fig. 00. — Tube do M. Pasteur.

Fig. 71. — Tube de M. Miquel.

fermés par un tampon de coton ou par une capsule formée de 3 à 4 feuilles superposées de papier filtre, capsule que l’on fixe à l’aide d’un petit anneau en caoutchouc fBrefeld).

Pour remplir ces petits ballons, pour les ensemencer ou prélever des échantillons de leur contenu, on les ouvre dans une caisse spacieuse de verre recouverte intérieurement de-papier filtre humide destiné à fixer les spores en suspension dans l’air; les manipulations se font par deux ouvertures placées sur les côtés de la caisse. Peutêtre vaudrait-il mieux encore faire toutes les opérations dans la chambre de Tyndall, enduite intérieurement de glycérine et abandonnée au repos pendant, quelques jours [Tyndall, les Microbes, p. 55, Paris, 1882].

2° Milieux. — Pour chaque microbe, il s’agit de déterminer d’abord le milieu favori; on y arrive par de nombreuses expériences comparatives en employant successivement des liquides de composition variée.

On trouvera plus loin l’indication de quelques-uns des liquides le plus souvent employés.

FERMENTATIONS

3° Stérilisation. — Il existe deux manières de débarrasser un milieu des germes qu’il renferme : l’action d’une chaleur suffisamment élevée et la filtration sur des filtres très parfaits.

Stérilisation par la chaleur. — Pour détruire tous les germes, il faut porter les liquides à 110°, l’ébullition sous la pression atmosphérique ne suffisant pas toujours (voir plus loin, p. 818). On chauffe, au bain d’air ou mieux au bain d’huile, le liquide dans un ballon de 1 à 2 litres, scellé à la lampe, et l’on maintient pendant une heure ou deux une température de 110°. On laisse ensuite refroidir, on coupe le ballon à la naissance du col et l’on distribue son contenu dans une série d’un des petits appareils de culture figurés plus haut; cette distribution se fait en aspirant directement le liquide par les pointes latérales, flambées, de ces appareils, ou bien, lorsqu’on emploie le flacon de Al. Pasteur, à l’aide d’une pipette flamblée, munie d’un tampon d’amiante dans le tube d’aspiration.

Cette suite d’opérations peut s’exécuter très vite sous la caisse humide ou glycérinée, dont il a été question ; néanmoins un germe atmosphérique peut tomber dans le liquide. Aussi, avant d’ensemencer les appareils remplis, faut-il avoir soin de les abandonner pendant 8 à 15 jours dans une étuve chauffée à 37-40° pour acquérir la certitude qu’aucune spore vivante ne s’y trouve.

Pour éviter ce transvasement du liquide stérilisé et gagner en outre ce long temps d’épreuve, on a proposé de distribuer le liquide dans les appareils de culture et d’en opérer ensuite la stérilisation. A cet effet, on les place à l’intérieur d’une petite chaudière contenant une certaine quantité d’eau que l’on porte ensuite à 110°. Il est inutile, dans ce cas, de sceller à la lampe les appareils : la pression de la vapeur d’eau empêche l’ébullition des liquides de culture et leur perte en eau. M. Fitz, qui a recommandé tout particulièrement ce procédé, se sert d’une chaudière ayant 54 centimètres de hauteur sur 38 centimètres de largeur, et pouvant recevoir à l’intérieur une ou deux séparations à claire-voie, sur lesquelles on dispose les appareils. Il faut de 30 à

45 minutes pour chauffer la chaudière à 110° et il suffit ensuite de maintenir cette température pendant 30 autres minutes pour opérer la stérilisation [A. Fitz, Deutsch. cliem. Gesellsch., 1882, p. 867J.

Stérilisation par filtration. — Partant de cette observation de MM. Pasteur et Joubert que le sang charbonneux, filtré à travers une couche de plâtre, est devenu imputrescible au contact de l’air et a perdu aussi ses propriétés virulentes [Compt. rend., t. LXXXV, p. 101], MAI. Miquel et Benoist ont imaginé un mode de stérilisation à froid qui fournit des milieux beaucoup plus altérables que les liquides stérilisés par la chaleur. Voici quelques détails sur le procédé opératoire. Le col long et légèrement conique d’un ballon est étranglé à son tiers inférieur. Au-dessous de l’étranglement, on étire à la lampe une pointe fine de 5 à 6 centimètres de longueur. Au-dessus de ce même étranglement, on dispose une bourre d’amiante convenablement serrée, sur laquelle on coule une couche de plâtre gâché, de 7 à 8 centimètres de haut; on emploie, à cet effet, un mélange de 1p,0 d’amiante délayé dans

46 p. d’eau, auquel on incorpore petit à petit 52p,4 de plâtre à modeler. Après la prise du plâtre, qui exige plusieurs minutes et rejette un peu d’eau, l’appareil est séché pendant une à deux semaines dans l’étuve à 40°, puis porté lentement à 170-180°, opération qui a pour but de détruire les germes et de recuire le plâtre. Fnsuite on imbibe d’eau le tampon de plâtre re-

FERMENTATIONS

cuit, pour l’hydrater de nouveau, on ouvre la pointe latérale et l’on fait pénétrer par là dans 1 appareil 40 à 50 centimètres cubes d’eau stérilisée à 110°. On chauffe celle-ci à l’ébullition pendant cinq minutes, après quoi on scelle à nouveau la pointe latérale. La vapeur d'eau en se condensant produit un bon vide et l’appareil est alors prêt à fonctionner. Un liquide placé audessus du tampon suintera au travers, aspiré par le vide, et abandonnera tous les germes, à la condition cependant que le tampon de plâtre adhère bien au verre et ne présente aucune voie de passage trop large.

La filtration ne s’opère pas rapidement; pour l’urine normale, pour les épanchements pathologiques’ non purulents, elle exige de 6 à 24 heures. Le sérum sanguin étendu, le blanc d’œuf dissous dans l’eau, les sucs végétaux sont dans le même cas; le lait pur ou mélangé de plusieurs volumes d’eau ne filtre pas du tout.

On distribue les liquides ainsi obtenus dans les petits appareils comme cela a été dit., et l’on s’assure de leur stérilité en les exposant à 37-40° pendant 2 à 3 semaines [P. Aliquel et L. Benoist, Bull. Soc. chim., t. XXXV, p. 552].

Ce mode de stérilisation présente l’inconvénient de fournir des liquides saturés de sulfate de calcium; ce que l’on peut éviter en employant des filtres en porcelaine dégourdie, d’une épaisseur suffisante, comme cela se pratique dans les laboratoires de Al. Pasteur et de AI. Gautier.

Du reste, son application répond à des cas très spéciaux : celui où il s’agirait, par exemple, de cultiver certains microbes très délicats, ou de faire germer des spores très vieilles dans les recherches sur la numération des bactéries atmosphériques.

4° Germes purs. — Plusieurs méthodes peuvent être suivies pour obtenir les germes d’un microbe unique.

On peut mettre à profit :

a. L’inégale résistance des spores ou du microbe à l’action de la chaleur. Exemples : séparation du Bacillus ureæ et du Micrococcus ureæ, séparation des Bacillus œthylicus et butylicus.

b. Les différences de la température la plus favorable au développement des microbes.

c. La nature d’aérobie ou d’anaérobie des microbes.

d. L’inégale vigueur de développement des divers microbes; il y a des espèces vigoureuses et des espèces faibles.

e. L’inégale facilité de développement dans différents milieux; étant donné un mélange de microbes ensemencés dans un milieu déterminé, l’espèce qui se trouve dans les conditions les plus favorables prospérera particulièrement et finira par arrêter le développement des autres. Le rapport entre le nombre des cellules de chaque espèce après la culture ne sera plus le même qu’avant, et si l’on répète la culture plusieurs fois en ensemençant du liquide frais chaque fois avec une trace du liquide de la -précédente culture, on parviendra à développer surtout l’un des microbes âu détriment de tous les autres ; ceux-ci finiront par disparaître.

En faisant varier la nature du milieu, on pourra faciliter à volonté le développement de tel ou tel microbe. C’est sur l’application de ce principe darwinien de la lutte pour l’existence que M. Pasteur a fondé la méthode de purification des microbes par cultures successives. Dans ces expériences, il faut observer certaines précautions, que nous indiquerons plus loin (p. 821). Exemple : séparation des levûres et des bactéries par culture sur des moûts acides (Pasteur), ou sur des moûts alcoolisés de 5 à 8 combinée avec l’application d’une température de 10 à 12°

(Traube); les bactéries se développant à peine dans ces conditions sont rapidement éliminées.

f. Il se peut qu’aucune de ces méthodes appliquée seule ne conduise à une culture absolument pure; il faut alors en combiner plusieurs ou employer le procédé suivant, qui consiste à introduire dans le milieu stérilisé un seul germe ou une seule cellule du microbe.

On fait arriver au contact du liquide un certain volume d’air, soit en ouvrant brusquement dans l’atmosphère un ballon vide d’air et contenant le liquide stérilisé, ou bien eu faisant barboter l'air dans le liquide.

On abandonne le liquide au contact de l’air ; souvent un seul germe y pénétré et se développe.

On ensemence le liquide avec une goutte d’eau commune, qui souvent contient un germe unique.

Mais le moyen le plus parfait consiste à compter sous le microscope le nombre de cellules dans une goutte d’un liquide renfermant des microbes, à étendre ensuite une goutte semblable d'une quantité suffisante d’eau stérilisée pour que 5 à 10 gouttes du mélange ne contiennent qu’une seule cellule, et enfin à ensemencer une cinquantaine de ballons, remplis d’un liquide stérilisé, chacun avec une goutte du mélange. Lorsqu’on expose ensuite ces ballons à la température la plus favorable au développement du microbe, 5 à 10 environ entreront en fermentation et il y a une très grande probabilité pour que quelques-uns, n’ayant reçu qu’un seul germe, fournissent une culture pure du microbe, qu’il est facile de perpétuer ensuite.

C’est en suivant cette dernière méthode que M. Fitz est arrivé à cultiver à l’état de pureté le Bacillus butylicus.

il. — MOISISSURES.

Caractérisées par un mycélium fin, ramifié, et des filaments simples ou rauieux portant des spores, qui s'élancent dans l’air et dont la forme variée sert à les classer, les nombreuses moisissures vivent à la surface des milieux nutritifs. Elles consomment de notables proportions d’oxygène et agissent comme agents de destruction, de combustion complète. A la surface du globe, elles ont pour mission de faire disparaître les produits engendrés par les bactéries de la putréfaction qui apparaissent avant elles.

Leur rôle chimique est donc simple. Un pénicillium, par exemple, vivant sur un milieu contenant de l’acide tartrique, produit du gaz carbonique, des acides formique et acétique, et une petite quantité d’acide succinique.

Sucres, acides, alcools, arnides, etc. sont ainsi oxydés. Les modifications droites et gauches des corps optiquement actifs ne succombent pas avec une égale rapidité, et l’on sait le parti que M. Le Bel, appliquant la méthode de M. Pasteur, en a tiré pour la séparation de deux alcools amyliques secondaires (méthyl-propylcarbinol), qui d’après ses vues théoriques devaient être doués du pouvoir rotatoire. Du Pénicillium glaucum se développant à la surface d'une solution étendue de cet alcool secondaire oxyde plus facilement l’alcool dextrogyre et laisse un alcool déviant fortement à gauche le plan de la lumière polarisée [J.-A. Le Bel, Bull. Soc. chim.,t. XXX11I, p. 106]. Le même procédé l’a conduit à la découverte de l’alcool amylique dextrogyre [Ibid., t. XXXI, p. 104].

Certaines moisissures peuvent aussi agir comme véritables ferments, mais cela seulement lorsqu’on les prive d’oxygène (pénicillium, aspergillus, mucor). Dans ces conditions anormales,

leur vie est du reste languissante et s’éteinsouvent rapidement. Nous avons exposé et comt menté ces faits plus haut. Ajoutons cependant que, d’après les expériences deM. Gayon [ Compt ■ rend., t. LXXXVI, p. 52], le Pénicillium glaucum et VAspergillus niger peuvent faire fermenter ainsi non seulement la glucose, mais aussi la saccharose, qu’ils ont le pouvoir d’intervertir d’abord.

D’autres mucédinées (Mucor mucedo, M. circinelloides, M. spinosus, Bhicopus nigricans), au contraire, ne possèdent pas ce pouvoir inversif.

Le M. racemosus ne fait fermenter le sucre de lait qu’après inversion par un acide ; il n’attaque ni l’inuline ni le lactate de calcium [Fitz, Deutsch. chem. Gesellsch., 1876, p. 1352].

Les moisissures vivent dans les milieux acides, souvent très acides (40 grammes d’acide tartrique et plus par litre d’eau), pourvu que cette forte acidité ne soit pas due à un acide minéral puissant. Le milieu doit contenir, en outre, une matière hydrocarbonée (sucre), de l’ammoniaque, de la potasse, de l’acide phosphorique, de la magnésie, etc.

Souvent la silice, le fer, la chaux et une trace de zinc sont très utiles, sinon indispensables.

L’azote peut, d’après M. Fitz, être fourni sous forme d’acide azotique.

Les intéressantes expériences de M. Raulin rendent très probable que chaque moisissure, pour atteindre son maximum de développement, a besoin d’un milieu d’une composition toute particulière. Ainsi, VAspergillus niger trouve tous ses éléments nourriciers dans le milieu suivant, que M. Raulin est parvenu à composer à la suite de nombreux essais et qui est même plus favorable que les milieux complexes d’origine organique sur lesquels la plante se développe spontanément.

Voici la composition du liquide Raulin :

Eau l,5008r

Sucre candi 70

Acide tartrique 10

Az H3 2

Acide phosphorique (PJ Os) . . . 0,4

Acide sulfurique (SU3) 0,25

Silice 0,03

Potasse (K20) 0,4

Magnésie 0,2

Oxyde de zinc 0,04

Oxyde de fer 0,03

Des spores pures i’Aspergillus niger, ensemencés sur ce liquide contenu dans des vases plats et chauffé à 35° dans l’air humide, donnent au bout de 6 jours une récolte de 25 grammes de cette mucédinée.

La présence de tous ces éléménts est nécessaire pour constituer le milieu le plus favorable. Vient-on à en supprimer un, le végétal se développe moins vigoureusement et la récolte diminue. Elle tombe à ^ lorsque c’est la potasse qui fait défaut, à tfj après suppression de l’ammoniaque, à yj-, quand l’acide phosphorique manque, et enfin à lorsque le liquide ne renferme point de zinc. L’action d’une si faible quantité de cet élément est très remarquable.

Les faits suivants ne le sont pas moins. Certains sels minéraux sont éminemment vénéneux pour VAspergillus.

Le chlorure platinique, par exemple, ajouté au liquide nourricier à la dose de j— , empêche le développement delà plante; yiîVïï de chlorure mercurique ou T^0 de nitrate d’argent agissent de même.

11 est impossible de faire végéter VAspergillus dans des vases en argent, quoique par des réactifs chimiques on puisse à peine constater une

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trace d’argent dans la dissolution [J. Raulin, Thèses de la Faculté des sciences de Paris, 1870].

Les spores de moisissures ne se développent bien que dans les milieux acides; il suffit de les neutraliser ou de les rendre alcalins pour ralentir ou arrêter la végétation. Si le liquide contenait des germes de bactéries, ceux-ci ne tardent pas à se développer dans ces nouvelles conditions. Quelquefois la bactérie vit en parasite sur la moisissure et lui fait prendre souvent une coloration particulière; d’autres fois elle tue la moisissure.

Ce fait explique pourquoi l’organisme animal est fermé à ces spores qui abondent dans l’air et nous pénètrent partout. Les mucédinées de la teigne (favus), de l’herpès circiné et tonsurant, de la mentagre, etc., ne se montrent qu'à la peau dont les sécrétions sont acides.

Cependant il semble, d’après les expériences toutes récentes de Grawitz, que, par des cultures successives dans des milieux de moins en moins acides et finalement alcalins, on peut modifier graduellement les allures du Pénicillium glaucum, qui acquiert la possibilité de s’adapter à ces nouvelles conditions.

Tandis que les spores de pénicillium primitif, injectées dans le sang, meurent rapidement, les spores du végétal modifié par la culture germent et se développent dans le sang, et les filaments mycéliens produisent dans les tissus des iufiltrations pathologiques très singulières [Grawitz, Arch. pathol. Anat. Physiol., t. LXXXI, p. 355].

Mlle Nadina Sieber a soumis à l’analyse immédiate les moisissures qui se développent sur des liquides contenant, indépendamment des sels nutritifs, du sucre et de la gélatine, ou bien du sucre et du sel ammoniac. La récolte renfermait à la fois 1 ’Aspergillus glaucus, du Pénicillium et du Mucor mucedo. 11 est regrettable que l’auteur n’ait pas fait d’abord de cultures pures, pour analyser une végétation homogène; néanmoins les résultats méritent d’être cités :

Moisissures

sur sucre

et sel

gélatine.

ammoniac.

Eau

Matières solubles éther..

tl, 2

— — alcool.

Albuminoïdes

Cellulose

Cendres

[Nadina Sieber, Journ. prakt. Chem. (2), t. XXIII, p. 412].