CHAPITRE PREMIER

§ 1. — Examen du sang pur.

La classique méthode qui consiste simplement à déposer une gouttelette de sang- sur une lame de verre, puis à la recouvrir immédiatement d'une lamelle, a été la cause de bien des erreurs. Certes, l'examen microscopique du sang- est chose facile et simple, il exige cependant quelques précautions sans lesquelles il est impossible d'obtenir des résultats rigoureux. Les éléments du sang sont, en effet, d'une grande délicatesse et d'une vulnérabilité en quelque sorte proportionnelle à leur remarquable vitalité.

Les hématoblastes qui, dès leur issue des vaisseaux, deviennent pour ainsi dire agonisants et qui, en continuant à s'altérer, vont faire partie, au bout de quelques moments, du réticulum fibrineux, ne sont pas les seuls éléments sensibles aux agents extérieurs. Les globules rouges — nous en aurons souvent des

G. Hayem . — Du Sang. 1

preuves — sont également des éléments très altérables, dont l'examen doit être fait, autant que possible, à l'abri des atteintes des agents physiques et chimiques.

De tous les éléments figurés du sang, les globules blancs, contrairement aux vues théoriques émises par plusieurs observateurs, sont ceux qui se détruisent le moins facilement et qui conservent le mieux, pendant un temps relativement considérable, leurs propriétés physiologiques.

Ces trois espèces d'éléments figurés peuvent être étudiées dans le sang pur, à l'état humide; à l'état sec; dans les vaisseaux.

A. Sang humide. — Un bon procédé d'examen du sang pur doit remplir les conditions suivantes : permettre à la gouttelette de sang de s'étaler en couche mince et uniforme sans rencontrer d'humidité ni de corps étrangers ; protéger les éléments contre tout traumatisme ; mettre le sang à l'abri de l'évaporation.

Toutes ces conditions sont réalisées par l'emploi d'une petite cellule spéciale que je désigne sous le nom de cellule à rigole.

Cette cellule consiste simplement en une lame de verre un peu plus épaisse que les lames ordinaires, à surface plane, au milieu

Fig. 1. — Cellule à rigole.

a. disque central; b, rigole.

de laquelle on a isolé un petit disque de 4 millimètres de diamètre en creusant une rigole circulaire de 2 à 2,5 millimètres de large

Comme couvre-objet il est indispensable de se servir de lamelles

travaillées, bien planes et non de lamelles ordinaires fabriquées

par le procédé de l'étendage. L'épaisseur de ces lamelles doit varier

suivant le grossissement dont on veut se servir. M. Nachet en

fabrique d'assez minces pour qu'on puisse utiliser les objectifs à

immersion.

Après avoir nettoyé la lame et la lamelle avec beaucoup de soin

à l'aide d'un linge fin imbibé d'éther, on dépose sur la lame, le

(1) Cette cellule dite à rigole est une simple modification de la chambre humide ordinaire.

long du bord externe de la rigole, une petite couche de vaseline. On prend ensuite, avec un agitateur de verre d'un très petit diamètre, une gouttelette du sang à examiner et on la dépose sur le disque qu'on recouvre immédiatement à l'aide de la lamelle. Il suffit ensuite de presser doucement sur les quatre coins de cette lamelle pour obtenir une couche cle sang mince et uniforme.

Pour bien réussir, il importe de déposer très peu de sang sur le disque, sans quoi la couche de sang reste trop épaisse. Les commençants pécheront plutôt par excès que par défaut. Au contraire, ce qui est rare, lorsque la quantité de sang déposé sur le disque est trop infime, on risque, en pressant sur les bords de la lamelle, d'écraser les éléments du sang. Avec un peu d'habitude, on réussit aisément.

La préparation est convenable lorsque les globules rouges se sont mis de champ et se trouvent empilés sur une seule couche ; c'est-à-dire lorsque la lame de sang a précisément dans toute son étendue l'épaisseur du diamètre moyen des globules rouges.' Quand les hématies sont toutes à plat, séparées les unes des autres ou partiellement imbriquées, la préparation doit être refaite, autrement on s'exposerait à prendre pour des modifications dans les caractères des éléments, des particularités dues à l'extrême minceur de la couche sanguine.

B. Sang sec. — On ne saurait trop recommander les préparations de sang desséché. En isolant les uns des autres les éléments du sang, et en les fixant d'une manière définitive, la dessiccation permet de faire des collections de préparations qu'on peut ensuite examiner à loisir et comparer entre elles. D'ailleurs, ainsi que nous le verrons plus loin, ce procédé n'exclut pas l'intervention de certains réactifs propres à mettre en évidence des détails qui échappent à l'examen du sang humide.

Il faut, ici encore, procéder avec méthode si l'on veut tirer tout le parti possible de la dessiccation. Les lames sur lesquelles le sang sera déposé doivent être nettoyées à l'aide de l'acide sulfurique étendu, puis d'eau ordinaire. Après les avoir essuyées, on les fait sécher au-dessus de la flamme d'une lampe à alcool; mais, avant de s'en servir, il faut attendre qu'elles soient complètement refroidies.

Lorsqu'elles sont encore chaudes au moment où l'on étale le

sang", celui-ci se dessèche plus rapidement; mais les éléments sont altérés par l'élévation de la température.

Un certain nombre de lamelles, ainsi qu'un ou plusieurs agitateurs de verre étant préparés, on pique le doigt du malade au niveau de la pulpe à l'aide de la pointe d'une lancette, et on saisit immédiatement une- lame de la main gauche entre le pouce et l'index tandis que de la main droite on tient l'agitateur. Pendant qu'un aide, ou bien la personne même dont on examine le sang", presse doucement sur l'extrémité du doigt piqué de manière à faire sourdre une goutte de sang-, on approche la lame de verre de l'extrémité du doigt, et ces deux temps de l'opération doivent être exécutés de telle sorte que la goutte de sang vienne, à la sortie même de la piqûre, mouiller la lame de verre. On cueille ainsi rapidement une goutte de sang qui doit être immédiatement étalée en couche mince. Il suffit pour cela de faire glisser à plat l'agitateur sur la goutte par un mouvement dirigé de dedans en dehors, c'est-à-dire des doigts de la main gauche vers l'extrémité de la lame.

L'agitateur ne doit passer qu'une fois sur le sang. On fouette alors fortement l'air avec la lame couverte de sa petite couche de sang et en quelques secondes la dessiccation est obtenue.

Fig. 2. — Préparation de sang desséché. a, couche de sang sec; h, lamelle fixée aux quatre coius par de la paraffine.

Le succès dépend de la rapidité de la manœuvre, surtout lorsqu'il s'agit d'obtenir les hématoblastes. Avec un peu d'habitude, on mettra moins de trois à quatre secondes pour faire dessécher le sang, depuis le moment où la goutte apparaît à l'air jusqu'à celui où le sang prend l'aspect terne indiquant la dessiccation.

Ce procédé est un des moyens que j'ai le plus employés dans mes études sur les hématoblastes. Gomme ces éléments sont très visqueux, ils adhèrent à la lame de verre dans l'endroit même où la goutte a subi avec elle son premier contact. C'est donc à ce niveau que l'on placera la lamelle (fig. 2). Elle devra être fixée aux quatre coins avec de la paraffine. Ainsi faite, la préparation de

sang desséché se conserve indéfiniment, surtout si on a le soin de la mettre à l'abri de l'humidité. Lorsqu'elle est réussie, les globules rouges et les hématoblastes sont fixés dans leur forme normale ; mais les globules blancs sont aplatis, lamelliformes et sont en général plus larges qu'à l'état humide. Nous verrons plus tard que, chez les animaux dont le sang se coagule très rapidement, les hématoblastes sont si prompts à s'altérer qu'il est difficile de les fixer convenablement par la dessiccation. Avec le sang de l'homme il est en général facile d'obtenir de très bonnes préparations.

G. Examen du sang sur le vivant. — Quand on regarde au microscope les membranes transparentes et vasculaires des animaux à sang froid ou à sang chaud, on voit le sang parcourir les vaisseaux avec une telle rapidité qu'il est impossible de distinguer les éléments du sang. Mais bientôt, dans la plupart des cas, les tiraillements, puis l'irritation subis par les parties soumises à l'étude, amènent un ralentissement du cours du sang ou même des stases, partielles. Il devient alors facile d'observer les éléments du sang à l'intérieur des vaisseaux eux-mêmes. Nous décrirons plus tard les phénomènes produits par la stase et l'inflammation. Pour le moment, nous n'avons à nous occuper que des procédés d'étude. Cependant, nous devons dire dès à présent que dans les opérations faites sur les membranes internes, telles que l'épiploon et le mésentère, les troubles circulatoires et les stases déterminent l'altération d'un certain nombre d'éléments, et particulièrement celle des hématoblastes. On peut éviter cette cause d'erreur en employant le procédé mis en usage par Cohnheim dans ses études sur la stase (1). C'est celui qui m'a permis d'observer dans le sang circulant les hématoblastes de la grenouille.

Malheureusement ce procédé n'est applicable qu'à l'examen du sang dans la membrane natatoire de la grenouille, de sorte qu'en se servant des animaux à sang chaud, chez lesquels le mésentère et l'épiploon sont les seules parties qui se prêtent à ce genre de recherches, il est impossible d'éviter les altérations produites par l'inflammation.

Chez la grenouille, on peut se servir de la membrane natatoire, du mésentère, du poumon, de la langue et de la vessie.

Après avoir curarisé l'animal, on le place sur une planchette

(1) Cohnheim, Ueber venose StauuDg (Virchow's Archiv, XLI, pp. 220-238).

TECHNIQUE

de liège un peu épaisse à laquelle on a donné au préalable une forme spéciale (fig. 3). Une des parties de la planchette, en général la partie gauche, s'adapte sur la platine du microscope où elle est solidement fixée à l'aide des valets. Au niveau du diaphragme elle est percée d'une fenêtre ou d'un trou en rapport avec la partie qui doit être examinée. S'il s'agit du mésentère, on ménage un trou de 6 à 7 millimètres de diamètre dans lequel on enchâsse un petit disque de verre ou simplement un petit anneau de laiton dépassant le liège de 1 ou 2 millimètres. La deuxième portion de

Fig. 3. — Préparation du mésentère de la grenouille.

la planchette qui déborde la platine s'élargit de manière à pouvoir supporter l'animal (fig. 3).

On fait alors la préparation en étalant convenablement au-dessus de la fenêtre la partie membraneuse à étudier et en la iixant à l'aide d'épingles à insectes, de manière à ce qu'elle forme une lame aussi horizontale que possible et modérément tendue. L'étalement de la langue, celui de la membrane interdigitale n'offrent aucune difficulté.

Lorsqu'on veut observer le mésentère, on fait sortir l'intestin par une petite plaie latérale faite à la paroi abdominale et on fixe une anse intestinale autour de la fenêtre circulaire en enfonçant

les épingles à travers l'intestin ; on prend soin de ne pas tirailler le mésentère et de ne blesser aucun vaisseau important. On essuie le sang avec un pinceau et on humecte de temps en temps la membrane avec de l'eau fraîche.

Pour l'étude de la circulation du poumon, on fait une incision à quelques millimètres en dehors du sternum et de préférence à gauche, et l'on attire à l'extérieur tout le poumon de l'animal, de façon à lui faire recouvrir la fenêtre ménagée dans la planchette. On en fixe la pointe de l'autre côté de cette fenêtre à l'aide d'une épingle, et l'on incise le sac pulmonaire avec des ciseaux jusqu'au voisinage de sa racine. On rabat ensuite de chaque côté de la fenêtre les bords de l'incision et on les épingle de manière à étaler ainsi la face interne du sac membraneux. Cette petite opération faite avec rapidité s'accompagne d'une hémorrhagie plus ou moins abondante ; mais il suffit de l'action d'un filet d'eau froide, prolongée pendant une ou deux minutes, pour arrêter complètement la perte de sang.

Dans le cas où l'on étudie la circulation, après production de la stase veineuse, d'après le procédé de Cohnheim, on opère de la manière suivante :

Sur une grenouille curarisée, on met à découvert, au niveau de la cuisse, la veine crurale. On passe ensuite au-dessous de ce vaisseau un fil à ligature, en ayant soin d'embrasser en même temps dans l'anse du fil un fragment assez volumineux d'un clés muscles voisins, et l'on serre la ligature à l'aide d'un nœud simple. Les choses ainsi disposées, on observe ce qui se passe dans les vaisseaux de la membrane interdigitale, pendant la stase déterminée par la ligature veineuse. Au bout de vingt à vingtquatre heures, on détache le fil qui a été posé sur la veine et les fibres musculaires voisines, de façon à laisser la circulation se rétablir, et on reprend dans ces nouvelles conditions l'étude des phénomènes intéressants qui se produisent du côté des capillaires.

Dans tous les cas, lorsqu'on conserve les animaux en observation pendant plusieurs heures ou même plusieurs jours, on a soin de les recouvrir de quelques doubles de papier Joseph imbibé d'eau.

Pour faire les mêmes observations chez les animaux à sang chaud, on se sert des petits mammifères : cobayes, jeunes lapins, chats nouveau-nés.

On en obtient facilement l'immobilisation à l'aide d'une injec-

tion sous-cutanée de 10 à 15 centigrammes d'hydrate de chloral, ou bien de 1 à 2 centigrammes de chlorhydrate de morphine. La dose de ces hypnotiques sera naturellement proportionnée au poids de l'animal.

Le dispositif instrumental est le même que pour l'examen du mésentère de la grenouille; mais il doit être mis nécessairement en rapport avec la taille des petits mammifères. La plaque de liège est remplacée par une planchette de bois mince, taillée de telle sorte que d'un côté elle peut supporter l'animal et de l'autre s'adapter à la platine du microscope où elle est retenue par un ou deux valets (fig. 4).

Cette planchette est percée à l'endroit qui correspond au dia-

Fig. 4. — Dispositif pour l'examen de la circulation chez les mammifères.

A, coupe de la planchette de bois; B, coupe de l'anneau de liège; C, disque de verre; D, diaphragme spécial.

phragme du microscope d'un trou d'un centimètre à un centimètre et demi. Sur la surface supérieure de la planchette est fixé un anneau de liège portant un disque de verre faisant une saillie de 3 à 4 millimètres.

C'est sur le disque qu'on étale l'épiploon ou le mésentère, et dans ce dernier cas l'intestin vient s'appliquer sur l'anneau de liège, où il peut être fixé à l'aide d'épingles à insectes.

Comme il est nécessaire d'employer d'assez forts grossissements, on remplace le diaphragme ordinaire par un diaphragme conique (lig. 4, D), dont l'extrémité arrive presque au contact du disque de verre.

L'opération sera faite avec soin et les membranes péritonéales seront protégées contre la dessiccation et le refroidissement à l'aide d'eau tiède légèrement salée à 0,50 ou 0,60 p. 100. Sur la plaie abdominale, à travers laquelle font saillie des anses intestinales, on appliquera plusieurs doubles de papier Joseph trempé dans la même eau (température d'environ 38°). Bizzozero s'est servi d'un dispositif analogue (1).

(1) Bizzozero, Sur un nouvel élément morphologique du sang, etc. (Arch. ital. de biologie, 1882).

Emploi des réactifs sur le sang.

Pour étudier la constitution anatomique des éléments du sang et mettre en évidence leurs propriétés physiologiques, on met en usage un certain nombre de moyens. Ils doivent être distingués en agents physiques et en agents chimiques.

A. Agents physiques. — Parmi ceux-ci nous rangerons la température, les chocs ou pressions mécaniques, l'électricité.

1° Température. — Pour étudier l'influence d'une température plus élevée que la température ambiante, on se sert habituellement de l'appareil imaginé parMaxSchultze(l). A l'occasion des études que nous avons faites, mon ami Ilénocque et moi, sur les mouvements amœboïdes, nous avons fait construire par M. Nachet un appareil qui reproduit presque exactement celui du professeur de Bonn (2).

La pièce principale est une plaque de laiton de plus de 1 millimètre d'épaisseur en forme de fer à cheval.

Le corps même de la plaque a les dimensions de la platine du microscope ; les deux branches du fer à cheval dépassent en avant et de chaque côté la platine ; l'échancrure qui les sépare permet d'éclairer le microscope (fig. 5).

Cette plaque s'adapte solidement à la platine du microscope à l'aide de vis, et en est séparée par deux petites tablettes d'ivoire servant de corps isolants.

Un orifice de 3 millimètres de diamètre situé au centre de la plaque répond à l'ouverture de la platine et reçoit un diaphragme approprié, analogue à celui qui est représenté figure 4.

Tout l'appareil est chauffé à l'aide de deux petites lampes à alcool ayant exactement le même volume, et que l'on place sous les deux branches du fer à cheval; en les rapprochant plus ou moins, la température de l'instrument s'élève ou s'abaisse.

La température du centre de la plaque est indiquée par un thermomètre disposé d'une façon toute spéciale.

Ce thermomètre a son réservoir formé par un tube spiral plusieurs fois enroulé et laissant à son centre une ouverture qui répond à celles de la plaque et de la platine. Le réservoir est fixé

(1) Max Schultze, Ein heizbarer Objettisch u. seine Verwendung beiUntersuchungen des Blutes (Arch. f. microsc. Anat., t. I, Bonn, 18G5). (2j IL

à la face inférieure de la plaque de laiton; il se termine par un tube soudé à angle obtus et s'élève en avant entre les deux branches du fer à cheval, de sorte que l'observateur peut à chaque moment lire la température.

Ce thermomètre doit n'être en rapport qu'avec la plaque chauffée ; on peut le séparer de la platine du microscope par une fine plaque d'ivoire percée en son centre ou simplement par plusieurs doubles de papier.

Lorsqu'il est bien construit, et que l'appareil est bien centré.

Platine chauffante.

il doit donner la température du point même où est placé l'objet à examiner; Pour vérifier si ce résultat est obtenu, on peut employer la paraffine, qui a une température de fusion constante entre 51 et 52° centigrades. On en dépose un petit morceau sur une plaque de verre, comme si on voulait l'examiner, on chauffe, et le thermomètre monte ; il doit marquer 51 à 52° lorsque la paraffine fond. Dans le cas contraire, il faudrait faire des corrections.

D'ailleurs, quand on examine le sang humain, il n'y a pas d'inconvénient à obtenir quelques oscillations lentes entre 38 et 42° centigrades.

On emploie en Allemagne d'autres appareils dans lesquels la température est donnée par un courant d'eau chaude ou d'eau froide, suivant les résultats que l'on veut obtenir.

M. Polaillon (l)a, de son côté, donné la description d'un appareil fondé sur le même principe.

Mais ces instruments ne peuvent fournir des résultats nets et permettre un examen prolongé que si l'on a soin de mettre la préparation à l'abri de la dessiccation.

Pour atteindre ce but, on emploie la chambre humide de von Recklinghausen, ou bien on ajoute à la préparation un liquide n'altérant pas les propriétés des objets à examiner.

La chambre humide inventée par von Recklinghausen (2) est d'une construction facile. La figure ci-jointe représente celle que nous avons employée, M. Hénocque et moi (fig. 6).

Elle se compose d'un manchon de verre (c) coupé dans un verre de lampe ou dans un large tube assez volumineux pour recevoir le tube du microscope ; d'un manchon de caoutchouc (ci) en forme de cône tronqué, engainant par en haut le cylindre dans lequel glisse le tube du microscope, et

s'appliquant par en bas, sur la circonférence du tube de yerre. Le caoutchouc permet par sa souplesse de lever ou de baisser la chambre; on pourrait le remplacer par de la baudruche. La section inférieure du tube de verre est érodée et repose sur une lame de verre (a) qui doit également être dépolie, excepté dans son centre, où l'on place l'objet à examiner recouvert ou non d'une petite plaque (Z>); (e) représente le microscope glissant dans la chambre.

Pour maintenir l'humidité dans l'appareil, on garnit intérieu-

(1) Polaillon, .fciude sur les ganglions nerveux périphériques, p. 58; Paris, 18C5.

(2) Von Recklinghausen, Virchow's Archiv, etc., t. XXVIII, p. 1G3; 1863.

Fig. 6.

a, lame de verre ; b, lamelle ; c, manchon de verre ; d, manchon de caoutchouc ; <?, tube du microscope.

rement le tube de papier non collé, que l'on mouille légèrement.

L'emploi de cette chambre est indispensable toutes les fois qu'on veut examiner longtemps une préparation faite à l'aide du procédé ordinaire. Elle devient inutile lorsqu'on emploie la cellule à rigole décrite précédemment (§ 1, A).

L'examen du sang à une basse température peut s'effectuer à l'aide des appareils dans lesquels on fait circuler un courant d'eau froide. On peut également utiliser la platine de M. Schultze. Il suffit pour cela de recourber par en bas les extrémités de la plaque en fer à cheval et de les faire plonger dans des mélanges réfrigérants. Dans mes études sur les hématoblastes, j'ai simplifié ce manuel en pratiquant mes examens de sang en hiver, par une température basse, dans une chambre non chauffée ou dont les fenêtres étaient ouvertes. C'est précisément pour éviter ce procédé peu hygiénique et permettre de faire les observations en tout temps que les appareils à réfrigération sont utiles.

2° Agents mécaniques. — Quand on a obtenu une bonne préparation de sang pur dans la cellule à rigole, il est très facile de se rendre compte des effets produits par le traumatisme.

Il suffit d'exercer, à l'aide d'une pointe mousse, une compression sur la lamelle au niveau de la rigole pour rompre les piles, éparpiller les globules rouges et, si on le veut, les aplatir entre les deux lames de verre. En agissant de même au niveau du disque, c'est-à-dire directement sur la couche de sang, on altérera les globules rouges dans un point limité de la préparation, ce qui permettra de comparer les globules altérés aux éléments voisins restés intacts.

3° Électricité. — Les petits fils ou lames métalliques nécessaires pour conduire l'électricité jusqu'au contact d'une gouttelette de sang peuvent être adaptés à la chambre humide à rigole. On ménage à cet effet dans la lame de petites rainures, de manière à éviter le soulèvement de la lamelle. La seule difficulté est d'amener exactement l'extrémité des petites pièces métalliques jusqu'au bord de la gouttelette de sang.

On peut d'ailleurs étudier l'action des courants de pile ou des décharges statiques et faradiques sur le sang contenu à l'intérieur des vaisseaux. On opère sur des veines fraîchement détachées du corps d'un animal après avoir eu soin d'y placer des ligatures de manière à ce qu'elles restent pleines de sang.

B. Agents chimiques. — L'intervention des agents chimiques, parmi lesquels il faut compter les matières colorantes, joue un très grand rôle dans l'étude histologique du sang. Elle remplit, en effet, divers buts : dilution du sang et par suite écartement, isolement des éléments ; détermination de la structure et des qualités histo-chimiques des éléments et de leurs diverses parties ; mise en évidence de certains caractères pathologiques.

1° Dilution du sang. — Les éléments du sang sont tellement nombreux que, pour les observer isolément les uns des autres, on a imaginé des liquides diluants. Les premiers observateurs se sont servis de sérosités naturelles, se rapprochant plus ou moins exactement par leur composition du plasma sanguin, dans l'espoir de n'apporter ainsi aucune modification histologique aux éléments. Ces sérosités ou liquides indifférents conservent, en effet, d'une manière convenable, les hématies et les globules blancs; ils facilitent particulièrement l'étude des mouvements amœboïdes.

Mais ce qu'on ne savait pas avant mes recherches, c'est que, précisément à cause de leur similitude avec le plasma, ils n'empêchent pas les hématoblastes de s'altérer. On ne se doutait pas d'ailleurs de l'existence dans le sang d'un élément vulnérable au point de se modifier immédiatement hors des vaisseaux dans le sang pur, lorsque von Recklinghausen imagina un prétendu procédé de culture du sang in vitro, sur lequel on s'est appuyé pendant des armées pour admettre la transformation des globules blancs en globules rouges.

Nous pouvons dire dès maintenant que c'est précisément dans le sang pur, maintenu à la température du corps, que les hématoblastes subissent le plus rapidement et le plus complètement leurs transformations et que, par suite, les liquides de dilution simple (indifférents) retardent ou même parfois empêchent ces modifications, lorsqu'ils sont ajoutés au sang en très fortes proportions. Nous verrons, en effet, plus tard qu'un des meilleurs parmi ces liquides (le sérum iodé) fixe, du moins pour un certain temps, tous les éléments du sang, y compris les hématoblastes, lorsqu'on n'ajoute qu'une partie de sang pour 200 ou 250 parties de sérum.

La dilution simple, se proposant uniquement l'écartement, la séparation des éléments du sang, devra être effectuée à l'aide de l'addition, à une partie de sang, de une à 4 ou 5 parties au plus de liquide indifférent.

On peut employer le sérum du sang, mais à la condition expresse de l'emprunter à un animal de la même espèce, les liquides des cavités séreuses, tels que l'humeur aqueuse, la sérosité du péricarde, le liquide de l'ascite, celui de l'hydrocèle. Mais ces sérosités ont l'inconvénient de se putréfier rapidement. Aussi, pour obtenir un liquide de laboratoire que l'on puisse avoir constamment à sa disposition, Max Shultze a-t-il eu l'idée de conserver, à l'aide de l'iode, le liquide amniotique de la vache (1).

Pour une once de ce liquide on ajoute environ six gouttes de teinture d'iode concentrée; il se produit un léger trouble, une coloration ambrée, puis le mélange devient clair; au bout d'environ vingt-quatre heures, on ajoute encore quelques gouttes de la solution iodée, et plus tard, si le liquide se décolore complètement, quelques gouttes encore, jusqu'à ce que le sérum reste jaune clair. C'est le sérum iodé.

La solution de sulfate de soude à 5 p. 100, celle de chlorure de sodium à un taux variant de 0,50 à 0,75 p. 100, n'altèrent pas, à faible dose, les globules blancs et peuvent également servir à diluer le sang pour faire l'étude des mouvements amœboïdes.

2° Application directe des réactifs sur le sang. — Lorsqu'on veut étudier la manière dont se comportent les différents éléments du sang au contact des réactifs chimiques, on mélange directement le sang avec ces substances.

Ce mélange peut s'obtenir de diverses manières.

Si l'on se propose de faire agir la substance chimique sur tous les éléments à la fois, on fait le mélange en proportions définies ou non du sang et de la substance d'essai dans un verre de montre ou dans une petite éprouvette, et on effectue avec une goutte de ce mélange une préparation ordinaire qu'on borde avec de l'huile.

C'est ainsi qu'on peut étudier les effets de l'eau, des solutions neutres, acides, alcalines et les réactifs qui fixent en les coagulant plus ou moins complètement les éléments du sang, l'acide osmique par exemple. On opère de même, lorsqu'il s'agit d'étudier une matière solide, mais soluble dans le sang, telle que le sucre.

Lorsqu'à l'aide de ce procédé on cherche à se rendre compte des effets produits par une solution très étendue et par suite renfer-

(1) Max Schultze, Die Anwendung mit Iod., etc. {De V emploi des sérosités animales iodées dans les recherches histologiques, etc.) (Arch. fiirpath. Anat. et Phys., t. XXI, p. 263, 1864).

niant un très petit nombre d'éléments, il faut avoir soin, après avoir déposé la goutte du mélange sur la lame de verre, d'attendre une ou deux minutes avant de placer doucement la lamelle. Les éléments déposés sur la lame restent alors accumulés au centre de la préparation, ce qui en facilite l'étude.

Au contraire, lorsqu'on ajoute au sang des parties infinitésimales de substance étrangère, il convient d'employer de préférence la cellule à rigole décrite à propos de l'examen du sang pur.

11 est parfois intéressant de suivre sous le microscope l'action progressive du réactif. A cet effet, après avoir fait une préparation de sang ordinaire, on en dépose une goutte sur un des bords de la lamelle.

Eu pénétrant par capillarité, le réactif refoule le sang à l'extrémité opposée de la préparation, de sorte que l'on peut parcourir successivement les zones dans lesquelles le sang se trouve mélangé avec une quantité variable de substance active.

On évitera le soulèvement de la lamelle par une trop grande quantité de véhicule en en fixant préalablement les quatre coins à l'aide de paraffine. Ce procédé est particulièrement applicable à l'étude des effets de l'eau et de l'acide acétique.

3° Application des réactifs colorants après fixation préalable des éléments du sang. — La plupart des solutions colorantes employées en histologie sont faites à l'aide de liquides (eau, alcool, etc.), qui altèrent plus ou moins profondément les éléments histologiques. Aussi ne sont-elles utilisées que sur des objetspréalablement fixés par d'autres réactifs. Il faut donc procéder pour le sang comme pour l'étude des tissus, c'est-à-dire rendre les éléments insolubles ou inaltérables avant de faire agir les réactifs colorants.

Cependant certains mélanges s'opposant à la dissolution des éléments sont également capables de dissoudre diverses matières colorantes, et l'on peut ainsi obtenir des liquides remplissant un double but. Le liquide que j'emploie pour la numération des éléments du sang, et dont je donne plus bas la formule (liq. A), peut servir de véhicule à diverses matières colorantes, et particulièrement à une certaine proportion d'éosine soluble dans l'eau. Après avoir ajouté une petite quantité de cette substance dans le liquide, on filtre et on obtient ainsi un réactif colorant se portant surtout sur les globules rouges et quelques-unes des granulations des globules blancs.

16 PREMIÈRE PAUTIE. — TECHNIQUE.

Bizzozero a fait connaître récemment un liquide qui aurait également la propriété de fixer les éléments du sang- et d'en colorer certaines parties. C'est un mélange de solution de chlorure de sodium à 0,75 p. 100 avec une solution aqueuse concentrée de violet de méthyle. On conserve séparément les deux solutions et on fait le mélange au moment de s'en servir (1). Ce liquide altère sensiblement les hématies et les hématoblastes, qui y disparaissent au bout de quelques heures, tandis que le violet colore légèrement en bleu le noyau des globules blancs. Nous aurons l'occasion de revenir sur ces effets.

La fixation préalable des éléments du sang peut s'effectuer par voie humide ou par voie sèche.

Je ne connais que deux liquides qui soient capables de fixer d'une manière définitive les éléments du sang. Tous deux produisent le durcissement, par coagulation, des matières albuminoïdes qui entrent dans leur constitution. Le premier, bien connu en histologie pour ses propriétés fixatrices, est une solution d'acide osmique plus ou moins concentrée.

La solution à 1 p. 100 est celle qui convient le mieux pour le sang des mammifères.

Le second liquide est celui qui contient, comme agent coagulant, du bichlorure de mercure, substance dont les propriétés nous ont été révélées par les formules de Pacini.

Celui que j'emploie sous le nom de liquide A a la composition suivante :

Eau distillée 200 grammes.

Chlorure de sodium pur 1

Sulfate de soude pur 5 —

Bichlorure de mercure 0sr,50

Lorsque le sang est mélangé avec ce liquide dans la proportion de 1 p. 100 au plus, tous les éléments y deviennent indestructibles par suite d'une sorte de coagulation. Il se produit là une action chimique ayant une certaine analogie avec celle du tannage.

Abandonné au repos, le mélange laisse déposer les éléments durcis et l'on peut alors décanter le liquide, laver les éléments et les soumettre à l'action des matières colorantes, telles que l'éosine et l'hématoxyline. Comme l'indissolubilité de tous les élé-

(1) Bizzozero, loc. cit.

ments du sang" exige un séjour prolongé de ces éléments dans le réactif, en opérant la décantation à des époques variant de deux à vingt-quatre heures, on obtient des réactions diverses qui facilitent l'étude de la structure des hématies.

Le même liquide peut servir à la fixation des éléments anatomiques contenus dans les membranes vasculaires. C'est grâce à lui qu'on peut reconnaître la présence des hématoblastes dans les cellules vaso-formatives des jeunes mammifères (1).

On obtient de très belles préparations en procédant de la manière suivante :

On détache chez un jeune animal vivant (lapin, chat, cochon d'Inde) le grand épiploon en le sectionnant à sa base avec des ciseaux, et on le fait tomber immédiatement dans le liquide A. Au bout de vingt à trente minutes, on le lave avec de l'eau distillée et on peut déjà, en l'étalant à l'aide d'un pinceau sur une lame de verre, l'examiner au microscope. Mais il est préférable de colorer au préalable les éléments.

La membrane flottant dans l'eau distillée est balayée en tous sens sur ses deux faces à l'aide d'un petit pinceau de blaireau. On entraîne ainsi les éléments épithéliaux. On l'étalé alors avec soin, sur une lame de verre, en évitant les plis, et on y fait tomber quelques gouttes de solution neutre d'auréosine. C'est le liquide colorant qui rétracte le moins les éléments ; il peut être remplacé soit par une solution d'éosine soluble dans l'eau, soit par une solution de pyrosine.

Lorsque la membrane a pris une coloration suffisante, ce qui a lieu au bout de trois à quatre minutes, on la lave de nouveau avec de l'eau distillée et on la colore avec une solution d'hématoxyline dans l'eau alunée. Au bout de quelques minutes, on lave de nouveau avec de l'eau distillée et on termine ensuite la préparation avec de la glycérine (2).

On peut préparer de la même manière la queue du têtard quand on se propose d'étudier dans cet organe le développement des vaisseaux.

D'ailleurs le liquide A peut rendre, d'une manière générale, de

(1) lui.

(2) C'est à Wissozky (de Kasan) que l'on doit la méthode de double coloration par l'hématoxyline et l'éosine : Ueber das Eosin als Reagens auf Hàmoglobin... {Arch. f. mikros. Anot., t. XIII, p. 479, 1876).

G. Hayem. — Du Sang. 2

grands services en histologie toutes les fois qu'il s'agit d'étudier à l'état frais des éléments cellulaires délicats.

La formule de ce liquide peut êlre modifiée lorsqu'on veut obtenir une fixation moins complète des hématies, et par suite se débarrasser ultérieurement, après décantation à l'aide des réactifs dissolvants, d'une partie ou de la totalité de l'hémoglobine.

J'indiquerai bientôt, à propos du dénombrement des éléments du sang, quelques-unes de ces modifications. J'ajouterai ici, pour être complet, que l'urine diabétique dont je me sers pour cette dernière opération peut être utilisée également pour l'étude histologique des hématies et des hématoblastes, bien qu'elle ne fixe pas d'une manière définitive comme le fait le liquide A les éléments du sang.

Examinons maintenant les procédés de coloration qui peuvent être appliqués aux préparations faites par dessiccation.

Lorsque les globules rouges sont dispersés sur une lame de verre et desséchés par le procédé décrit précédemment (§ 1, B), il suffit de souffler sur la lame pour que l'humidité de l'air expiré entraîne la dissolution de l'hémoglobine. Cette substance est donc restée extrêmement soluble. Mais alors même qu'au lieu d'air humide on emploie de l'eau, il est facile de reconnaître que le lavage rapide de la préparation entraîne uniquement l'hémoglobine. Les stromas et une mince pellicule insoluble persistent et restent adhérents à la lame de verre. On peut donc se débarrasser à volonté de l'hémoglobine et étudier ensuite l'action de diverses matières colorantes sur le stroma.

Voilà déjà un procédé d'étude.

Mais si l'on veut conserver les éléments intacts tout en les colorant, il faut, ou bien verser sur le sang1 sec une matière colorante ne dissolvant pas l'hémoglobine, ou bien rendre préalablement l'hémoglobine insoluble.

Le premier résultat est atteint par l'usage de l'eau iodo-iodurée, le second par Faction des vapeurs d'acide osmique.

La solution iodo-iodurée doit avoir une coloration brune assez intense. Après en avoir déposé à l'aide d'un agitateur une bonne goutte sur le sang sec, on laisse tomber doucement sur cette goutte une lamelle. Toutesles parties qui renferment de l'hémoglobine prennent immédiatement une coloration acajou foncé, qui a une tendance à tirer sur le violet quand la solution iodée est

trop concentrée. C'est le moyen le plus simple et le plus sûr qu'on puisse employer quand on recherche s'il existe des globules rouges à noyau dans le sang des mammifères. En se servant d'une solution de gomme épaisse et fortement iodo-iodurée, on peut conserver les préparations sans craindre l'évaporation de l'iode.

Rien de plus facile que de mettre à profit les propriétés fixatrices des vapeurs d'acide osmique.

On place la préparation de sang desséché sur le goulot d'un flacon débouché contenant une solution saturée de cette matière, de manière à ce que la couche de sang soit tournée vers l'intérieur du flacon. Au bout de quelques minutes l'hémoglobine est rendue insoluble, et l'on peut traiter les éléments par une matière colorante : éosine, hématoxyline, picro-carminate d'ammoniaque.

Il importe toutefois de savoir que les éléments desséchés, fixés par les vapeurs d'acide osmique, ne se laissent plus colorer par certaines substances, entre autres par le violet de méthyle. J'ai fait à cet égard une remarque intéressante qui m'a permis d'utiliser toutes les matières colorantes sans redouter la dissolution de l'hémoglobine.

Cette remarque porte sur la manière différente dont se comportent les éléments fraîchement desséchés et ceux qui le sont depuis quelque temps déjà. Quand on conserve une préparation de sang desséché, non recouverte par une lamelle, pendant un temps suffisant, soit au moins pendant un mois, on voit que les globules et les hématoblastes ne se laissent plus attaquer par une solution aqueuse de violet de méthyle. Le réactif les colore alors d'une manière plus ou moins intense, il se fixe notamment sur l'hémoglobine des hématies devenues insolubles. Les globules blancs eux-mêmes se sont modifiés ; le réactif qui, dans les préparations fraîches, dissout une partie du protoplasma et se porte avec. avidité sur les noyaux, les pénètre à peine sans les dissoudre et ne colore plus les noyaux que d'une manière fort imparfaite. Il est probable que les éléments desséchés ont subi au contact de l'air une sorte d'oxydation qui les empêche d'être attaqués par l'eau. L'albumine du plasma est devenue elle-même plus résistante et ne fixe plus de matière colorante.

La chaleur possède également des propriétés fixatrices qui permettent d'utiliser immédiatement les préparations desséchées. Dès

que le sang est fixé sur la lame de verre par dessiccation (§ 1, B), on chauffe cette lame en la plaçant au-dessus de la flamme d'une lampe à alcool. On la porte ainsi pendant quelques instants à une température voisine de 100°. Les éléments préalablement bien fixés par la dessiccation rapide ne s'altèrent pas; mais ils subissent, sous l'influence de la chaleur, une modification analogue à celle dont ils sont le siège quand ils ont été abandonnés un temps assez long à l'état sec.

Les solutions aqueuses ou alcooliques des matières colorantes peuvent alors être employées sans que l'hémoglobine se dissolve.

Je signalerai en terminant le procédé de double coloration qui a été proposé par C. Cole pour la préparation des éléments du sang des animaux à globules rouges nucléés (1).

J'ai pu l'appliquer au sang des animaux à globules non nucléés, en prenant soin de me servir de préparations anciennes ou de chauffer les lames de sang desséché avant de verser les réactifs sur le sang.

Les solutions de Cole sont les suivantes :

Solution A.

Éosine . 0&r,325

Eau distillée 6*r,80

Alcool 6*r,80

Dissolvez l'éosine dans l'eau, puis ajoutez l'alcool.

Solution B.

Vert de méthyle (aniline méthyl. verte) 0^r,130

Eau distillée 30 grammes.

On commence par déposer sur le sang quelques gouttes de la solution A. Au bout de cinq à six minutes on lave, on laisse sécher, puis on se sert de la même manière de la solution B.

C'est avec le sang des animaux à sang froid qu'on obtient les meilleurs résultats.

Ces moyens d'étude dans lesquels on fait agir les réactifs colorants sur des éléments préalablement desséchés peuvent être également appliqués à l'étude des éléments de la moelle des os et delà rate.

(t) C. Cole, vol. II, 1884.

§ 3. — Préparation du réticulum fibrineux par lavage

et coloration.

Dans le sang- normal étalé en couche mince, le réticulum fibrineux est très incomplètement visible et dans le sangphlegmasique, alors que ce réticulum est très épaissi, on ne peut encore l'apercevoir qu'au niveau des espaces plasmatiques. De là la nécessité pour étudier le réseau de fibrine de faire une préparation spéciale.

Après avoir déposé une goutte de sang au centre d'une lame et l'avoir recouverte d'une lamelle couvre-objet, on laisse la préparation dans une chambre humide pendant plusieurs heures jusqu'à ce que la coagulation soit bien effectuée. On sait que pour obtenir une chambre humide convenable il suffit de placer le long des parois d'un cristallisoir à bord dépoli plusieurs doubles de papier Joseph imbibé d'eau et de placer le cristallisoir retourné en manière de cloche sur un plateau de verre dépoli. Lorsque le sang est bien coagulé, on dépose sur un des bords de la lamelle une goutte d'eau, puis on laisse pendant quelques minutes encore la préparation dans la chambre humide. On peut alors, en se servant de papier à filtrer, placé sur le bord de la lamelle opposé à celui où l'on dépose l'eau, faire passer à travers le caillot un courant d'eau qui entraîne les globules rouges et la presque totalité des leucocytes et isole ainsi le réticulum fibrineux.

Lorsqu'on juge que le lavage est bien complet, on substitue à l'eau pure soit de l'eau iodo-iodurée, soit une solution alcoolique au tiers de sulfate ou de chlorhydrate de rosaniline, et l'on obtient de la sorte la coloration des fibrilles et des amas d'hématoblastes altérés, situés au niveau des principaux carrefours du réseau.

Pour rendre cette préparation plus facile et plus régulière, on peut se servir d'une lame sur laquelle on a creusé deux rigoles parallèles, rectilignes, disposées dans le sens de la longueur et laissant entre elles une sorte de travée.

Entre les rigoles et le bord externe de la lame, on a ménagé un dépôt d'argent, de sorte qu'en se servant d'une lamelle travaillée, bien plane, il est facile d'avoir une couche de sang régulière et d'une épaisseur uniforme.

De plus, la lame et la lamelle ne pouvant arriver au contact en aucun point, le lavage du caillot est rendu plus facile. C'est le procédé qui m'a servi dans mes études sur les altérations du pro-

cessus de coagulation dans les maladies, et qui m'a permis, en me fournissant des préparations comparables entre elles, défaire une sorte de dosage microscopique de la fibrine.

Dans le sang normal de l'homme et d'un grand nombre d'animaux supérieurs, le réticulum est le plus souvent si délicat qu'il se détruit en grande partie pendant l'opération du lavage. La lame à rigole est alors indispensable. On peut, au contraire, s'en passer toutes les fois que le réticulum est épaissi par le fait d'un état pathologique.

§ 4. — Recherche des corps étrangers dans le sanget en particulier des microbes.

Les remarquables travaux accomplis dans ces dernières années sur les germes animés considérés comme causes de maladies et particulièrement les recherches de M. Pasteur et de ses élèves doivent nous faire attacher une grande importance à tous les procédés capables de mettre en évidence ces petits organismes microscopiques dans le sang ou dans les humeurs.

On doit se préoccuper avant tout d'opérer de manière à ne pas introduire dans les préparations de corps étrangers venant du dehors. Mais comme un certain nombre de microbes sont très petits et peu réfringents, il faut également recourir à des moyens particuliers d'éclairage et de coloration.

Le sang pur sera examiné dans la cellule à rigole; mais on emploiera pour le recueillir les précautions indiquées par M. Pasteur.

Tous les instruments dont on aura besoin seront soumis à un flambage préalable; le doigt du malade sera nettoyé à l'aide d'alcool et séché avec un morceau de linge flambé qui restera appliqué sur la peau jusqu'au moment de recueillir le sang.

L'atmosphère des hôpitaux étant remarquablement impure, pour transporter les instruments flambés jusqu'au lit du malade, j'ai fait construire un petit appareil disposé de la manière suivante.

Sur un plateau de verre dépoli se trouvent fixés de petits supports métalliques sur lesquels on peut mettre la lame et la lamelle ; au-dessous de la lame on peut glisser une petite pince, une lancette et un agitateur de verre. Le tout est recouvert d'une cloche ou cristallisoir à bord dépoli. Tous les instruments, le plateau de verre, le cristallisoir sont flambés avec soin dans le laboratoire et

le tout, formant un espace bien clos, est transporté auprès du malade. On soulève alors doucement la cloche pour prendre les instruments dont on a besoin, on dépose la gouttelette de sang sur le disque de la cellule et on la recouvre immédiatement de la lamelle. En général, on écarte ainsi toute cause d'erreur.

Cependant il est clair qu'un tel procédé, dans lequel il est impossible d'éviter complètement le contact de l'air, ne peut être d'une rigueur absolue.

On peut néanmoins se servir de préparations faites avec beaucoup de soin dans la cellule à rigole pour cultiver du sang. A cet effet, dès que la préparation est terminée, on fait passer par capillarité entre la lame et la lamelle une goutte d'huile préalablement portée à 150°, et après avoir enlevé l'excès d'huile on borde avec de la paraffine.

La préparation est alors déposée à plat dans une étuve maintenue à une température voisine de 40° et on l'examine à loisir an microscope. On réussit très bien à conserver ainsi du sang humain pendant plusieurs jours et même pendant des semaines sans qu'il s'y développe d'organismes inférieurs.

Lorsqu'il est nécessaire de faire intervenir des matières colorantes pour mettre les microbes en évidence, on donnera la préférence aux préparations de sang desséché. Ces préparations seront soumises aux manipulations indiquées dans le § 2.

J'ai obtenu ainsi, particulièrement avec l'eau iodo-iodurée, de bonnes préparations des bactéridies charbonneuses. Mais il est utile de faire observer que pendant l'agitation de la lame de sang à l'air un bon nombre de particules qui flottent dans l'atmosphère peuvent rester fixées au milieu des éléments du sang.

Il est donc bien certain, comme l'a fait remarquer souvent M. Pasteur, que les divers procédés d'examen du sang sont très inférieurs aux moyens de culture qu'il a fait connaître. On ne doit cependant pas les dédaigner complètement et il est clair qu'ils peuvent rendre service lorsqu'on recherche la présence dans le sang d'un malade d'une espèce bien connue et bien définie, telle par exemple que la bactéridie charbonneuse. Mais lorsque l'examen du sang donne des résultats négatifs, on n'est pas en droit d'en conclure que le malade n'est pas atteint d'une maladie engendrée par un germe organisé. Outre que le microbe ou sa semence peut échapper à l'examen microscopique, il faut se rappeler que bon

nombre des germes capables d'infecter l'organisme ne pénètrent dans le sang que pour être déposés dans certains tissus.

Lorsqu'on n'a pas à se préoccuper, dans la recherche des microbes, de la conservation des éléments du sang, on peut employer tous les procédés applicables aux autres liquides organiques, notamment ceux qu'Ehrlich conseille pour la recherche du microbe de la tuberculose. On opère, en pareil cas, sur une couche de sang un peu épaisse qu'on laisse sécher sous la cloche précédemment décrite, à l'abri des impuretés de l'air.

Nous savons maintenant que suivant la manière dont on procédera on pourra conserver l'hémoglobine in situ ou au contraire s'en débarrasser. En général, pour éviter la précipitation des matières colorantes en présence de l'hémoglobine en partie dissoute dans le réactif, on fera bien de fixer préalablement les globules rouges. A cet égard le chauffage des lames sera généralement préférable aux vapeurs d'acide osmique, puisque celles-ci entravent l'action de la plupart des matières colorantes.

Les solutions devront varier suivant l'espèce de microbes dont on fait la recherche. Les plus employées sont la solution iodoiodurée suffisamment concentrée (charbon) ; les solutions à divers titres de violet de Paris (impaludisme) ; les solutions de fuchsine (tuberculose); les solutions de violet de Paris (septicémie).