CHAPITRE II

Action de l'Éosine sur les bacilles vivants.

Nous avons eu aussi recours à une méthode de coloration vitale qui facilite grandement les observations morphologiques, en mettant dans le tube en expérience quelques gouttes d’éosine. Nous avons tout d’abord déterminé les limites de l’action antiseptique de ce corps sur les trois bacilles dont nous nous sommes occupés.

C'était là une expérience préparatoire qui devait étre précédée elle-même de la fixation des caractères de culture et de forme de ces mêmes bactéries sur le milieu normal .

que nous avons choisi. Les expériences suivantes résument ces caractères.

Bacillus subtilis. — Le milieu présente,en 24 heures, un trouble généralisé. C’est la phase où les bacilles se dissocient rapidement après la division ; ils sont mobiles et isolés ; en préparation microscopique, ils se colorent fortement et uniformément dans leur masse. Un mince voile apparaît où ces caractères sont encore manifestes, sauf en ce qui concerne la mobilité des éléments. Au second jour, le voile s’accroit se plisse et s’accole à la paroi du tube ; les bacilles se colorent d’une manière moins uniforme, ils restent unis en filaments. Au troisième jour, les plissements du voile se sont accentués ; les filaments allongés et enchevêtrés commencent à se dissocier, un point brillant apparait dans chaque cellule : la spore se

Us

fornie. Dans les vieilles cultures, un dépôt grisätre apparait au fond du tube: il est composé de bacilles sporulés chez lesquels la forme de la cellule est plus ou moins altérée.

Bacillus anthracis. — Dès le premier jour, on remarque l'apparition de flocons très petits en suspension dans le liquide.

Les bacilles sont réunis en filaments dans une gaîne ; ils se colorent uniformément.

Le second jour, le milieu présente un trouble moins accentué, les bacilles moins uniformément colorables montrent quelques granulations réfringentes, distinctes de la masse protoplasmique.

Au troisième jour, le nombre de ces granulations s’accentue, les filaments se dissocient mettant en liberté les bacilles qui sporulent ; ces spores forment au fond du tube un dépôt blanchâtre vers le quatrième jour.

Bacillus pyocyaneus. — En vingt-quatre heures, on observe un trouble uniforme puis un voile léger. Les bacilles apparaissent nettement séparés et se colorent uniformément. Au second jour, le liquide se teinte légèrement en jaune-vert ; le voile devient plus résistant et s’épaissit, quelques éléments bacillaires renferment des granulations. Le troisième jour, la couleur verte du milieu est plus accentuée, le voile a épaissi, et s’est fortement coloré en vert. Les éléments que l’on rencontre sont en voie de segmentation et donnent des bacilles normaux.

Voici, par comparaison, ce que l’on observe sur le même milieu contenant de l’éosine.

Bacillus subtilis. — Dans un tube contenant 10 gouttes de solution d’éosine, soit 2 gr. 50 pour 1000, ce bacille végète comme dans le milieu normal.

Les granulations protoplasmiques apparaissent colorées en rose. Il s’agit sans doute de corpuscules métachroma-

Pr Joe

tiques de réserve. Un ensemencement fait avec ces bacilles dans un second tube contenant une dose double d’éosine, soit 5 grammes pour 1000, donne des résultats identiques, sauf que les granulations sont plus fortement colorées. Le développement se poursuit ainsi jusqu’à la dose de 12 gr. 50 d’éosine pour 1000. A partir de ce moment, le bacille gagne le fond du tube et y forme des z00glées. Ce changement dans le mode de végétation se poursuit jusqu’à la dose de 25 grammes pour 1000 où nous avons arrêté l'essai sans que la forme cellulaire soit elle-même modifiée. Il résulte de ces expériences que la dose de 2 gr. 50 pour 1000, suffisante comme colorant vital, ne gêne en aucune façon le développement du microbe et n'en modifie aucun caractère morphologique.

Bacillus anthracis. — Cette espèce végète aussi bien en milieu éosiné qu’en milieu normal ; toutefois, la culture se fait dès le premier jour au fond du tube, mais les formes observées ne diffèrent en rien des formes habituelles. Les granulations fixent de plus en plus la couleur à mesure que la dose d’éosine augmente. Au titre de 2 gr. 50 pour 1000, la coloration est suflisamment forte pour une bonne observation,

Bacillus pyocyaneus, — Ce bacille, en milieu éosiné, présente uniquement des éléments normaux ; le voile se forme régulièrement 24 heures après le semis et se montre d'autant plus volumineux que le titre de la solution s’élève davantage. A part cette légère différence, à cent gouttes, soit 25 grammes pour 1000, le bacille ne diffère en rien de ceux qui végètent dans les solutions moins fortes.

Toutes ces cultures, ensemencées sur pomme de terre ou sur gélose, après l’action du milieu éosiné, donnent des bacilles qui perdent rapidement leur colorant vital ; mais, autour du point d’inoculation, on constate une diffusion de

ÉSUOREes

la matière colorante qui peut être très étendue: Aïnsi, dans le repiquage du Bacillus subtilis sur pomme de terre, la couche muqueuse qui se développe, au lieu d’être brunätre comme dans le cas de végétation du bacille normal, est nettement colorée en rose. Cette coloration accompagne cette couche muqueuse sur les deux faces de la pomme de terre. C’est bien, dans ce cas, le bacille qui a aidé à la diffusion de la matière colorante. Si l’on dépose, en effet, une goutte de solution colorante sur pomme de terre, on constate aussi une diffusion de la couleur, mais beaucoup moins étendue que dans le cas présent et n’atteignant jamais les deux côtés. Il faut sans doute expliquer cette diffusion de la matière colorante par les bacilles vivants, en admettant une sorte d’emmagasinement de la matière colorante dans la cellule. Au cours de leur multiplication scissipare sur un milieu solide incolore, les bacilles cèdent peu à peu le pigment emmagasiné et provoquent ainsi la coloration du milieu.

Nous n'avons pu nous arrêter plus longtemps à l’étude de ce curieux phénomène qui mériterait peut-être une étude complémentaire plus suivie.

Le Bacillus pyocyaneus donne, sur gélose inclinée, une teinte rose qui ne vire pas au violet comme dans le cas d’une végétation normale. Sur pomme de terre, ses colonies ont une couleur rose jaunâtre.

En résumé : l’éosine en solution à 2 gr. 50 pour 1000 peut être introduite dans une culture sans y apporter de modifications sensibles. Son action antiseptique est, à cette dose, à peu près nulle ; elle n’amène aucune modification dans la morphologie des Bactéries. Ainsi que l’ont remarqué PÉJu et RayaT « sur l’éosine, les cultures de bactéries naissent colorées, fixant énergiquement la matière colorante du milieu sur lequel elles poussent ».

On peut donc préférer l’éosine comme colorant vital, aux autres couleurs dérivées de la houille qui, au moins pour

me

certaines d’entre elles, d’après les indications de Huaou- NENCQ et EraAuD [42] « paraissent s'opposer au développement des microbes, et atteindre leur virulence ». Cette coloration vitale nous a rendu les plus grands services pour suivre les modifications morphologiques des Bactérles que nous avons étudiées.

Nous donnons, dans les pages suivantes, le résultat de nos observations concernant l’action des divers antiseptiques sur les bactéries.

Il nous faut toutefois préciser les conditions dans lesquelles nous avons entendu apprécier le pouvoir antiseptique des substances étudiées.

On sait que ce pouvoir, qui peut aller jusqu’à causer la mort de la bactérie, en arrête d’abord le développement sans abolir pour cela la vitalité qui peut demeurer à l’état latent pendant un temps variable. Dans ces conditions, la cellule, arrêtée dans son développement, est encore susceptible de le reprendre si les conditions normales de vie lui sont restituées.

Miquez [55], l’un des premiers, attire l'attention sur ce mode d'action des antiseptiques et il a distingué la dose antiseptique, qui tue la bactérie, de la dose infertilisante qui en suspend seulement les manifestations vitales. Une certaine quantité d’antiseptique ajoutée à un milieu le rendra impropre à la vie bactérienne ; cette quantité représentera la dose infertilisante de la substance. MiqueL [55] a montré que la dose infertilisante d’un corps était d’ailleurs différente suivant que l'addition au milieu nutritifen était faite avant l’ensemencement ou après le développe ment. C’est ainsi qu'il faut une quantité plus forte d’antiseptique pour entraver un développement bactérien déjà en évolution que pour empêcher le début de ce développement.

Ce résultat s'explique par le fait que les nombreuses cellules qui constituent une culture prospère absorbent

Do —

une quantité plus notable de la substance que les quelques unités qui constituent un ensemencement à son début.

Quoiqu'il en soit, dans les expériences qui vont suivre, nous ne nous occuperons que de la quantité d’antiseptique qui empêche le développement d’une semence dans un milieu déterminé.

Nous exprimerons cette Dose infertilisante par le poids de substance ajoutée à 1 litre du milieu nutritif normal, et nous la désignerons par le symbole DI. Pour fixer les idées, nous dirons que D I = 1,95 signifie que la semence bactérienne cesse de pouvoir se développer dans le milieu normal additionné de 1 gr. 95 de l’antiseptique par litre de liqueur.

Dose infertilisante normale. — Une première notion devant servir de point de départ à nos expériences a dû être établie, C’est celle de la dose infertilisante normale des quatre antiseptiques étudiés, vis-à-vis de chacune des bactéries mises en expérience. Cette dose est assez constante, elle est exprimée par les chiffres consignés dans le tableau suivant :

B. pyocyaneus. B. sublilis. B. anthracis.

RÉSONCINC nee cr 3 4,02 0,45 Acide salicylique... 1,02 0,68 0,44 Sulfate de cuivre... oil 0,53 0,44 SUDIIME Er etre 0,28 0.07 0,03

Chacun de ces chiffres exprime donc le titre en poids, par litre de’substance antiseptique qui empéche le développement. C’est la dose infertilisante de l’antiseptique pour la bactérie normale, non acclimatée aux antiseptiques.