ONE

FrG. 1.

Diagramme obtenu par la réunion exacte de tous les points

déterminés par pholométrie (papier Whatman n° 1, coloration noir amide 10 B).

Sérum normal.

: b FIG. 2. — a) Tracé obtenu par leclure photométriaue d'une bande d’électrophorése vierge rendue transparente (papier Whatman n° 1). — b) Tracé oblenu par lecture pholométriaue d'une

bande d'électrophorèse colorée el décolorée dans les conditions habituelles (papier Whatman n° {, coloration noir amide 10 B).

La figure 1 montre un tracé de sérum normal let qu'il est obiénu par la réunion exaele de tous les points déterminés par photométrie et la figure 2 les tracés oblenus avec la bande blanche et la bande colorée el décolorée.

On voit ainsi l’ordre de grandeur des varialions du tracé impulables à l'inégalité du papier. On constate que ces irrégularités ne sont pas dues à une adsorplion du colorant par le fond du papier-fillre puisque la bande colorée-déco-

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lorée ne montre pas de variations plus grandes que la bande vierge.

Les écarts constatés sont de l'ordre de 0.02 à 0,03 unités photométriques. Ils peuvent cependant atteindre exceplonnellement 0,06 à 0,09 unités. On réalise leur importance relative en pensant que le pic des albumines correspond généralement à 1 unité, et celui des y globulines à 0,2-0,3 unités.

Des lors, il est important de repérer visuellement les fractions sur la bande colorée et sur le diagramme pour ne pas risquer de créer des sous-fractions illusoires. La mesure directe des élongations des fractions visibles sur la bande et leur report sur le diagramme constitue un procédé sûr de repérage exact.

Choix du colorant.

Nous avons ulilisé la coloration au noir amide 10 B parce que ce colorant donne les résullats le mieux en accord avec ceux de l'électrophorèse selon Tiserits. On comprend facilement l'intérêt qu'il y à à l'utiliser pour un travail de recherches. Cependant, de nombreux auleurs (21), (14), (53) se servent du bleu de bromophénol dont l'emploi est plus simple, mais il exige l'intervention d’un facteur de correclüon (mulüplication du pourcentage d’'albumines sériques par 2,35 si l’on prend la somme des chiffres trouvés pour chacune des globulines égale à l'unité}. Ce facteur de correction peut être soumis à de nombreuses critiques si l’on songe que l’adsorplion du colorant peut ne pas être la même entre deux fractions globuliniques où seulement entre deux globulines provenant lune d’un sérum normal et l'autre d'un sérum pathologique (27). Ce facteur est réduit à 1,15 dans la coloration au noir amide 10 B : il affecte les globulines si l’on prend le pourcentage d’albumines égal à Punité. BENHamoU et PoroNovskr (8) estiment que, dans la coloralion au noir amide 10 B, seules les globulines nécessitent un coefficient de correction de 1,25 (!. Pour notre part, nous avons renoncé à appliquer un coefficient de correction, quel qu'il soit.

D'autre part, la coloration au bleu de bromophénol exige une quantité de protéines plus importante que celle au. noir amide 10 B (20 mm’ au lieu de 8 à 10 pour le cas d’un sérum), ce qui n'est peut-être pas un inconvénient dans l'analyse d’un sérum, mais constitue une gêne lorsque l’on dispose d’une solulion protéique en faible quantité on peu concentrée (cas des protéines tissulaires)

La technique de coloration au bleu de bromophénol que nous avons essavée et qui donne de bons résultats est la suivante (21) :

a) immerger pendant 10:minules la bande séchée dans une solution à 1 %o de bleu de bromophénol dans l'alcool absolu saturé de chlorure mercurique,

b\ laver 10 minutes à l’eau courante, c) Sécher.

C’est un procédé pratique et rapide qu'il est très intéressant d'utiliser en clinique pour l'examen des sérums. fl présente l'inconvénient que nous signalons plus haut d’introduire un coefficient de transformation arbitraire, et pour un travail de recherche, nous lui préférons la coloration au noir amide 10 B, plus longue et plus délicate, avec expression directe du pourcentage des surfaces déterminées par planimétrie.

Procédés de lecture photométrique.

Nous avons eu l'attention attirée sur ce point par les différences des modes opératoires préconisés par les constructeurs de deux appareils d'utilisation courante en France : Jouan et Elphor H.

Si Jouax utilise une simple photométrie à sec de la bande placée entre deux plaques de verre; par contre ELprror rend cette bande transparente par un mélange d'huile de paraffine et d’a-bromo-naphtalène (technique de GRraïsmax et FHanNIG).

La source lumineuse trop faible du photomètre Elphor ne permet pas une évaluation à sec des bandes d’électrophorèse.

La photométrie comparée d'une même bande, rendue transparente par le mélange Transparenzol, avec les deux tvpes de photomèlre nous conduit à des résultats quasi identiques tant au point de vue proportions que forme de la courbe.

Mais si l’on compare, avec le pholtomèlre de Jouax, la même bande à sec et après l'avoir rendue transparente, on aboutit à des différences notables :

a) dans la forme de la courbe qui montre des sommels plus nets dans le cas d’une photométrie à sec,

b) dans les proportions des différentes fractions. Les albumines sont augmentées nettement par rapport aux fractions globuliniques si lon rend la bande transparente. Voici un exemple de résullats obtenus : :

nee

Bande n° 1 (colorat. noir amide) :

Y B Oo Gr Alb.

a) à sec 29,2 127 8,0 5,9 43,6 b) après transparence 28,2 10,8 7 41 49,9

Bande n° 2 (coloral. Bl. Bromoph.) :

Y B Oo ΠAlb..

a) à sec 33,9 17,9 15,6 7,8 24,8 b) après transparence Sn l 19 à 10 Le 6,4 40,1

Les différences importantes ainsi conslalées nous permeltent de dire qu'il est impossible de comparer des résullats d'électrophorèse sur papier qui n'ont pas été oblenus dans des conditions rigoureusement identiques. C’est ce que nous précisons plus loin en réalisant des séries d’électrophorèses qui constituent une sorte d'élalonnage des condilions opératoires.

La déterminalion du pourcentage des fractions par évaluation photométrique de l'intensité des taches se heurte encore à une autre crilique. On lui reproche de ne pas donner sur le diagramme une reproduction fidèle des taches oblenues sur la bande. En effet, chaque tache n’a généralement pas la même intensité de coloration au centre du papier el sur les bords où se produisent divers phénomènes qui provoquent un ralentissement de la migralion par rapport à la zone centrale qui constitue alors un « front » de migralion. Ces phénomènes de bord peuvent être facilement évilés si l’on se sert d’une bande de papier-filtre assez large permetlant de déposer la goutte de solution protéique bien au centre de la piste de départ {sur un front de 1 em. pour une bande de 4 cm. de largeur). Le photomètre Elphor H, qui balaie toute la largeur de la bande, évalue alors la totaulé de chaque tache et la critique d’une évaluation partielle de l'intensité lombe. Par contre, il n’en est pas de même avec cerlains photomètres qui ne permettent de lire qu'une zone centrale très réduite de la bande.

D'autres criliques surgissent à l’occasion de la consléuchon des courbes de Gauss el de la planimétrie, Nous v reviendrons plus loin.

Conclusion,

I ressort des conslalalions ci-dessus que lon est en droit d'atlendre de bons résullals, Irès constants, de la pholométrie des bandes après coloration à condition de suivre une lechnique fidèle et bien établie. La comparaison des résullals oblenus par des techniques différentes s'avère impossible.