C. Les Anthocyanes

Nous tenons à donner dans ce chapitre un petit historique sur les travaux qui ont été effectués concernant ces trois sortes de pigments bactériens, recherches de longue haleine, démontrant en même temps l’évolution de la Bactériologie vers les sciences physico-chimiques et biochimiques.

A. La Prodigiosine

Les travaux fondamentaux sur le bacillus prodigiosus et son pigment ont été effectués, si nous respectons l’ordre chronologique, par Bartholomeo B1z1o en 1819, par ERDMANN (79) en 1886, par SCHRŒTER (80) en 1875, par GRIFFITH (81) en 1892, par SCHEURLEN (82) et SCHOTTELIUS (83) (1887 à 1806), par SCHNEIDER (84) en 1887, par ROSENBERG (85) en 1897. Puis vient en 1902 l'important mémoire de Krarr (86). Pendant très longtemps les études de cet organisme et de son pigment sont restées stationnaires. C’est seulement en 1927 que LASSEUR et GIRARDET (70) ont repris l'étude du pigment. Ces auteurs ont examiné la prodigiosine surtout au point de vue de ses propriétés physiques et ils étudient minutieusement le spectre d'absorption de ce colorant en le comparant avec le pigment du Bacillus kihensis et celui de loxy-chlororaphine réduite.

Malheureusement LASSEUR et GIRARDET n’ont pas réussi, non plus, à faire cristalliser la prodigiosine et ils se sont contentés de travailler avec le colorant purifié et obtenu par extraction alcoolique et éthérée. La substance brun-

rougeâtre, offrant des reflets métalliques, lorsqu'elle est en suspension dans l’eau, est purifiée par l’analyse capillaire. Cette matière permet aux auteurs de constater que les pigments sécrétés par le Bacillus hiliensis et le Bacillus frodigiosus paraissent identiques et qu’il existe un rapprochement très net entre la prodigiosine et le pigment violet du Bacillus violaceus, tout d’abord par la bande commune de fa prodigiosine avec l’oxy-chlororaphine réduite : À — 537,4 et ensuite par les trois bandes de l’oxychlororaphine identiques à celles du pigment violet: — À 704,8; À = 637,6; À — 587.

En outre dans l’ultra violet, la prodigiosine et le pigment violet ont encore deux bandes communes : À — 280; À — 266.

Ainsi nous trouvons un premier rapprochement entre ces pigments bactériens, paraissant à première vue bien difiérents. Mais le seul moyen de classer définitivement ces colorants et de se faire une idée exacte de la synthèse biologique de ces pigments par les bactéries mêmes, réside dans l'étude chimique. À ce point de vue les travaux récents de WREDE et HETICHE (87) ont marqué uh grand pas en avant; malheureusement ces travaux ne sont pas encore terminés au moment où nous écrivons ces lignes; toujours est-il que ces auteurs sont arrivés pour la première fois à isoler à l’état cristallin le pigment du Bacillus prodigiosus, qu’ils ont pu préparer une série de sels purs et mettre au point les réactions permettant la caractérisation de ces combinaisons; ils ont constaté que le pouvoir tinctorial de la prodigiosine était très élevé et que les expériences faites antérieurement avec les substances chromogènes non cristallisées portaient sur des solutions renfermant environ 20/, du pigment. La prodigiosine pure est soluble dans les liquides lipoïdiques, insoluble dans l’eau; la solution neutre ou alcaline passe par addition d’acide du jaune au rouge. La prodigiosine était libérée des corps bactériens par destruction de ceux-ci dans des solutions alcalines diluées, puis extraite de cette solution par l’éther de pétrole. I/extrait jaune, ainsi obtenu, fournit le pigment par précipitation à l’état de sel chlorhydrique. Celui-ci est dissous en solution alcoolique, puis on précipite avec une solution à 5°/, d’acide perchlorique le sel perchlorique, qui est très bien cristallisé. Le perchlorate de prodigiosine est ensuite employé pour régénérer la prodigiosine libre, qu’on obtient en plaquettes amorphes; celles-ci pré-

sentent un éclat vert rappelant la fuchsine. De la base purifiée et libérée des cendres on peut préparer des sels magnifiquement cristallisés au moyen de l'acide perchlorique, lacide picrique, l’acide salicylique et l’acide benzoïque. Le sel de l’acide tartrique se distingue de tous les autres par sa solubilité partielle dans l’eau. La formule moléculaire établie par ces auteurs serait définitivement C2H%5N30O, Ac (Ac — acide monovalent).

Le professeur FORMANEK, ayant analysé ces sels spectroscopiquement, a constaté que le perchlorate de prodigiosine en solution alcoolique présente deux bandes d’absorption :

5375 À. E. et 5010 À. E.

en solution toluénique : 5413 À. E. et 5050 À. E.; en solution tétrachlorique : 3430 À. FE. et 5055 À. EF.

Par la suite le professeur FORMANEK conclut que la prodigiosine n’a rien de commun avec un dérivé rosanilique. Aussi la résistance à la photolyse n’est pas réelle : des bandes de papier-filtre colorées au moyen des sels se décolorent assez vite à la lumière du jour. L’intensité de coloration est à peu près analogue à celle des sels purs de fuchsine.

Au moment où nous écrivons ces lignes l’étude de a prodigiosine n’est pas plus avancée, mais nous voyons que les constatations de LASSEUR et GIRARDET ont été vérifiées et il n’est plus douteux aujourd’hui que la prodigiosine soit en parenté étroite avec l’oxychlororaphine ; en comparant les formules globales à présent établies :

oxychlororaphine CHUHUN3O

prodigiosine C2H%N30O il semble que la prodigiosine soit un homologue supérieur de l’oxychlororaphine et nous aurons par conséquent des pigments rentrant dans un même groupe de colorants et rapprochant les Bacillus chlororaphis, Bacillus violet, Bacillus prodigiosus.

B. La Pyocyanine «On ne peut pas étudier, dit LASSEUR, le Bacille Pyocyanique sans évoquer immédiatement le nom de C. GESs- SARD (88) et rappeler une partie des belles recherches de ce savant. »

GESSARD a démontré que le Bacillus pyocyaneus peut produire 4 pigments :

une matière colorante bleue : la pyocyanine de FORDOS,

une substance colorée fluorescente,

une matière colorante rose ou rouge,

un pigment rouge-brun mélanique.

La fluorescence s’observe dans les cultures de plus de 50 espèces bactériennes et n’a donc aucune valeur de diagnostic. Les pigments rouges et noirs ne définissent pas suffisamment l’espèce pyocyanique. Seule la pyocyanine est spécifique et caractérise le Bacille pyocyanique. C’est la raison pour laquelle nous limiterons notre étude à cette matière chromogène.

Forpos (89) a déjà pu obtenir cette substance cristallisée. Nous n’insisterons plus sur ces procédés, car dans un travail de haute valeur WREDE et STRACK (90) ont pu isoler Îa pyocyanine en toute pureté; ils ont enfin défini la constitution et la composition exacte de cette substance et finalement ils sont arrivés à réaliser sa synthèse. Nous allons donc dans ce chapitre décrire aussi brièvement que possible les travaux et les résultats de ces savants.

Pour obtenir un maximum de pigment les auteurs ont pu constater que le milieu de culture doit être ajusté à un pH initial de 7,4. Dans ces conditions la production de la matière colorante atteint un maximum. La présence de 1 % de peptone dans le milieu de culture est en outre inutile. IÎ semble se produire une réduction du colorant, donnant naissance à un produit incolore qui, par agitation à l’air, prend Îa teinte bleue typique. L’extraction de la substance colorée a été effectuée par le chloroforme comme dans le procédé de FORDOS-GESSARD.

La meilleure méthode pour séparer le colorant de la solution chloroformique, est sans aucun doute celle qui fait usage de l’acide picrique en solution chloroformique. Le picrate formé précipite alors presque complètement à l’état de fines aiguilles. Par cristallisation dans l’alcool absolu, on peut alors l’obtenir à l’état de pureté. De la même façon on arrive à préparer le picronolate. En décomposant le picrate par acidification au moyen de f’acide chlorhydrique et extraction de l’acide picrique par le chloroforme, on obtient une

solution de chlorhydrate de pyocyanine, qui donne par évaporation de beaux cristaux. Le sel de chlorhydrate est soluble dans l’eau et dans l’alcool. La solution aqueuse est employée pour la préparation de superbes cristaux de cAloroaurate et de chloro-platinate, dont la formule globale est : CXH2N40?2,H2PtCI6. La composition de la pyocyanine indiquée par LEDDERHOSE (01) (1888) avec la formule : CHHUN2O, et par MADINAVEITIA en 1916, qui examine le chlorhydrate de pyocyanine et propose alors la formule brute suivante : C6H5%N10C5O3, sont donc tous les deux à rejeter et la formule brute doit être définitivement : C%H2N402. La pyocyanine se décompose à + 60°, Le poids moléculaire a été déterminé dans l’acide acétique cristallisable, dans lequel la base est facilement soluble en formant le sel acétique. Le poids moléculaire semble donc être 424. Le colorant est très peu résistant à l’action des réactifs oxydants, car le permanganate de potassium ou l’eau oxygénée détruisent la couleur en très peu de temps. La réduction s’effectue très facilement; .on obtient une combinaison incolore, qui par agitation à l’air, redevient de nouveau bleue. Comme réactif réducteur on peut employer : le glucose ou l’hydrosulfite de sodium en solution alcaline. Par contact prolongé avec les acides dilués, la couleur de la pyocyanine se transforme en rouge vineux très prononcé. De cette solution rouge on ne peut plus extraire la substance chromogène au moyen du chloroforme. Il s’est formé un nouveau corps : P'Hémipyocyanine.

Les auteurs ont pu, de cette façon, en préparant le chloroaurate de l’hémipyocyanine, démontrer que la molécule de pyocyanine a une constitution symétrique et que sa dé-

CH N eo