CHAPITRE IV

ESSAIS D’ISOLEMENT DES PIGMENTS BACTÉRIENS EMPLOYÉS AU COURS DE NOS TRAVAUX

Méthodes chimiques et physiques de caractérisations des pigments bactériens

1) Méthode chimique modifiée de THUMM.

Ayant affaire à une bactérie chromopare, sécrétant ou produisant un pigment diffusible dans le milieu ambiant et soluble dans l’eau, nous avons tout d’abord pensé pouvoir isoler la substance colorée par des procédés chimiques, adaptés à la technique employée par THUMM (102).

100 gr. du milieu de culture colorés en rouge et filtrés, sont mélangés avec 200 cc. d’alcool à 96°. On laisse reposer pendant 12 heures, en agitant de temps en temps vivement. On obtient ainsi une précipitation des matières albuminoïdes. On filtre et le filtrat clair, fortement coloré, est évaporé à consistance sirupeuse au bain-marie à une température comprise entre <+800 et —+100°. On laisse encore reposer, afin que la précipitation d’autres substances organiques et la cristallisation de quelques sels minéraux s’effectue. On filtre sur un filtre mouillé au préalable. On obtient un liquide fortement coloré, auquel on ajoute avec précaution environ 100 cc. d’alcool; on laisse encore reposer pendant 12 heures et on filtre. Le filtrat (N° 1) renferme seulement des traces du pigment peu solubles dans l’alcool, puis des substances protéiques en petites quantités. Le succinate d’ammoniaque et l’asparagine s’y trouvent en totalité, ainsi qu’une grande partie des sels minéraux.

Le précipité resté sur le filtre se compose par contre presque complètement de la substance colorée, des prôtéines insolubles dans l’alcool et de quelques sels organiques. On le reprend avec un peu d’eau distillée et on filtre. On chasse par un chauffage prudent l’ammoniaque, qui se trouve dans le filtrat coloré et on concentre à consistance sirupeuse.

On précipite alors une deuxième fois le colorant par l’alcool. On le reprend après lavage à l’alcool par de l’eau et on précipite de cette solution au moyen d’une solution aqueuse de chaux (0.112 gr. CaO; 100 cc. H20) l’acide phosphorique à l’état de phosphate de chaux, l’acide sulfurique à l’état de sulfate de chaux et par cette opération la potasse est transformée en hydroxyde de potassium, qui reste dans la solution aqueuse. Le filtrat renferme par conséquent : le colorant, de l’hydroxyde de potassium, et des traces d’hydroxyde de chaux. La potasse est éliminée par concentration au B. M. et précipitation par l’alcool en excès; on obtient un précipité uniquement formé par le pigment et des traces de chaux. On reprend avec de l’eau et on transforme l’hydroxyde de chaux en carbonate de chaux, par passage d’un courant de gaz carbonique dans la solution, et on obtient après filtration une solution rouge renfermant uniquement le colorant. Par concentration et précipitation à l'alcool absolu celui-ci se dépose à l’état de poudre amorphe que l’on peut sécher et examiner.

Ce procédé nous a donné tout d’abord un moyen d’obtenir des traces du produit chromogène, mais on conçoit facilement que par toutes ces manipulations, le colorant a subi sûrement des modifications concernant ses propriétés physiques et chimiques. D’autre part ce procédé est très long; les évaporations au B. M., exécutées plus tard par nous dans le vide à 60 mim. de mercure, sont très délicates et difficiles. Aussi le résultat final est quantitativement si minime, qu’au commencement nous étions obligés d'employer 10 litres de milieu de culture pour obtenir quelques dixièmes de milligrammes de substance amorphe. Une cristallisation du colorant a été impossible à réaliser par ce procédé. C’est pour ces raisons, que nous avons plus tard essayé d’isoler

notre colorant par des méthodes moins brutales et moins laborieuses. se De pe

2) Méthode chimique de GRIMBERT-LASSEUR.

LASSEUR (103) a publié, en ce qui concerne cette question, une méthode indiquée par GRIMBERT, qui lui a souvent

donné satisfaction et grâce à laquelle il a pu isoler les corps :

colorés produits par 17 formes bactériennes. Parmi ces substances, Îes unes n’avaient pu être obtenues par les

procédés d’extraction habituellement employés, les autres n'étaient extraits que péniblement ou dans des DU défectueuses de rendement.

En raison de l'instabilité de notre colorant et de Ia difficulté de l’obtenir à l’état cristallisé, nous avons cru intéressant d'employer cette méthode. Nous tenons à la décrire ici, malgré qu’elle ne nous ait pas donné entière satisfaction; mais lors des manipulations elle nous a fourni des indices précieux, que nous mentionnerons au cours de notre exposé, et qui nous ont été fort utiles dans la détermination de la nature et des propriétés de notre substance colorée.

Technique

«19 Des milieux de cultures colorés ont été filtrés rapidement et concentrés ensuite au quart de leur volume primitif sous la cloche à vide à la température de “+409, réalisés par chauffage au moyen d’ampoules électriques.

2° Le liquide concentré est ensuite saturé par le sulfate d’ammoniaque à la température de +400.

3° La liqueur saturée est transvasée dans de grands tubes, munis d’un bouchon, percés d’un trou par lequel passe un mince tuyau permettant l’échange des gaz. Ces tubes sont placés au B. M. après avoir ajouté de l’acétone à parties égales.

4° Quand Île B. M. et les liquides en expérience ont atteint +400 on retire les tubes du B. M. et on agite avec précaution pour obtenir une précipitation du sulfate d’ammoniaque. On laisse reposer pour faciliter la séparation des deux liquides.

60 Le solvant est décanté et filtré. On répète l’épuise- | ment une ou plusieurs fois en utilisant les quantités d’acétone beaucoup plus faibles que dans le premier traitement:

79 Les liqueurs d'épuisement sont évaporées. à. passe: pression, puis on putifie par l’action alternative de: l’eau. et de l’alcool à 960.»

Mais comme LaAssEUR l'indique; l’acétone peus ne dénne: souvent pas satisfaction. c’est pour cette raison que nous avons manipulé avec un mélange acétone-alcool à 2/1, et de même au moyen de l'alcool amylique, et en travaillant

dans ces conditions nous avons finalement pu réaliser l’isolement du colorant de notre milieu par une technique appropriée en tenant compte de la nature et des propriétés spéciales du pigment de notre bactérie.

3) Méthode physique de GOPPELSROEDER basée

sur l'analyse capillaire.

Il convient de citer encore ici une méthode basée sur des principes physiques, permettant la séparation et la purification des pigments microbiens : l’analyse capillaire mise au point pour la première fois par GOPPELSRŒDER. (104)

Cette méthode, qui a déjà rendu de grands services, parce qu’elle permet tout d’abord de se rendre compte rapidement, si un pigment vert, violet, orange, etc. correspond à une ou plusieurs substances colorantes. De plus, par la séparation des bandes d’absorption des papiers capillaires employés, on peut facilement obtenir à l’état de pureté des colorants non cristallisables. On peut ainsi obtenir des pigments assez purs, pour faire des analyses spectroscopiques dans la partie visible du spectre et dans l’ultra-violet. Dans la pratique de l’analyse capillaire, on a en outre intérêt à utiliser les différences de vitesse d’ascension capillaire, mais il faut surtout s’efforcer de concentrer les colorants dans des bandes très étroites et aussi éloignées que possible les unes des autres. Les pigments étant généralement assez sensibles à l’action de l’air et de la lumière, il y a intérêt à eflectuer l’analyse dans une atmosphère de gaz inerte ou de manipuler dans des conditions de température et d'humidité égales. Le rôle du solvant est très important, et il faut toujours faire des analyses témoin avec le solvant seul. La substance absorbante joue aussi un rôle capital, et il faut savoir l’adapter à chaque cas particulier. Dans les dernières années l’analyse capillaire a encore gagné beaucoup d'intérêt par suite de la combinaison de cette méthode avec la technique utilisant la propriété fluorescente d’une grande quantité de substances dans là lumière tltra-violette et surtout dans les rayons de Wood, rayons ultra-violets filtrés et nettement limités de 400 à 300 my, et dont la partie principale est située à 366 my.

Les principes de l’analyse capillaire ont par conséquent dû être normalisés et standarisés. C’est DANCKWORTT et PFAU (105) qui ont employé ces méthodes pour analyser la chlorophylle et des substances actives renfermées dans différents produits de pharmacie galénique, tels que teintures, extraits et alcaloïdes. Les principes et techniques sont les suivants :

Les auteurs emploient le papier-filtre comme absorbant; par l’ascension d’un liquide sur du papier-filtre deux phénomènes physiques interviennent :

1° La capillarité; 29 J/absorption.

Par suite de ces deux phénomènes, il se forme des zones constituées par différentes substances, qui de cette façon peuvent être séparées. Ceci a déjà été constaté par FRÉDÉRIC SCHŒNBEIN (106) en 1861. C’est lui aussi qui recommande cette méthode pour l’analyse qualitative des solutions colorées. Un de ses élèves GOPPELSROEDER a ensuite mis au point cette méthode et lui a donné le nom d’analyse capillaire. Dans la suite les auteurs suivants : KUN'IZ, KRAUSE, STOHMANN (107), PLATZ (108) et d’autres ont encore perfectionné cette méthode. Dans la pratique on emploie du papier-filtre très pur; le meilleur est le papier-filtre N° 598 de SCHLEICHER et SCHULIL. Il est nécessaire d’effectuer avec la même sorte de papier des expériences de comparaison, parce que la hauteur maxima de l’ascension dépend de la qualité du papier. On coupe le papier en bandes dans le sens de la longueur des fibres et en général il est recommandé d'employer des bandes de 2 cm. 1, de largeur, et de 30 cm. de longueur. Ces bandes sont alors suspendues au moyen d’une baguette de verre à l’embouchure du tube à essai ou d’un becher de hauteur et de largeur convenables, de façon que la bande trempe par sa partie inférieure de 2 cm. dans le liquide à examiner. On ferme alors hermétiquement les récipients et on expose le tout à des températures -et à des conditions physiques égales. On note l’ascension par minute et l’ascension terminale; après 24 heures ces bandes sorit finalement séchées, après avoir effectué. les observätionsnécessaires et elles peuverit ainsi être conservées et Servir de test. DANCKWORTT et PFAU ont ensuite combiné cette méthode avec l'examen de Îa fluorescence de la substance

à étudier dans les rayons ultra-violets en employant Îles rayons de WOoD pour caractériser la présence de traces de chlorophylle dans des extraits de drogues ou de teintures. :

Si on fait passer les bandes de papier-filtre imprégné à travers une couche d’éther sous la lampe de quartz, on constate par la présence de traces de chlorophylle une zone rouge intense due à cette substance. Ensuite la zone se décolore et la solution éthérée se colore en rouge. REICH et HAITINGER (109) ont employé cette méthode pour différencier les vins des cidres. ERNST et JENTSCHITSCH (110) l’ont employée pour l’analyse de drogue figurant dans la pharmacopée autrichienne. On peut donc facilement se rendre compte de l’importance de ces méthodes, qui combinées, peuvent d’un côté servir à séparer plusieurs substances, notamment des colorants, et de l’autre pour la caractérisation et l’analyse qualitative de ces produits. Mais on a de suite remarqué l'inconvénient de ces méthodes, car dans l’interprétation des phénomènes de fluorescence on est plus ou moins sujet à des erreurs subjectives.

Ces différents chercheurs essayent de distinguer Îles diverses couleurs de la fluorescence; mais on trouve toujours de grandes différences dans les résultats. Et c’est ainsi que le développement des recherches analytiques par les rayons de Woop ont bientôt conduits à un moyen de mesure quantitative. Si on veut analyser quantitativement la fluorescence se produisant avec les rayons de Woop, il faut tenir compte de la couleur de l’intensité lumineuse et éventuellement aussi de la déviation polarimétrique de la lumière réfléchie. Par conséquent, pour l'interprétation des couleurs et de l’intensité dans la lumière ultra-violette filtrée, on est forcément amené à employer la spectrographie, et dans ces recherches il faut d’ailleurs tenir compte de la concentration des solutions de l’expérience. Un grand pas en avant a-été fait dans cette-voie par les travaux de R: FABRE (111) et de: ses élèves. On emploie à cet effet un spectrophotomètre. Si on examine lintensité spectrale de la fluorescence d’une substance à une concentration donnée, on obtient une série de courbes. Il semblerait qu’on puisse mettre en rapport direct ces courbes avec la teneur de ces solutions à matière fluorescente. Mais l’intensité de la fluorescence n’est cependant pas proportionnelle à la concentration de solution. Il existe par

contre une concentration optima pour laquelle l’action de la fluorescence atteint un maximum. Par conséquent 2 solutions d’une concentration différente doivent avoir une courbe de fluorescence identique, dont les ordonnées sont égales et les abscisses équidistantes de loptimum.

Si on a déterminé la courbe d’une solution à examiner et si on répète la même opération avec une solution diluée de moitié, on peut facilement se rendre compte du point maxima, et on peut exactement déterminer la concentration de la solution. Partant de ce principe BAYLE, FABRE et GEORGE (112) ont déterminé les courbes et les dilutions optimas pour l’hydrastinine, la quinine, la fluorescéine, la narcotine, Îa vératrine, la cotarnine, la papavérine, etc.; l'intensité de la fluorescence a toujours été exprimée en chiffres par comparaison avec le salicylate de soude; pour celui-ci l’unité a été fixée à 20. ANDANT (113) de même emploie la spectroscopie et la fluorescence combinée pour la détermination des alcaloïdes pulvérulents. Son travail, très intéressant, se différencie des autres par l’emploi de différentes zones de rayons pour les radiations, par exemple : 3650, 3130, 2537 À. Il obtient ainsi, en partant d’un même alcaloïde, différentes courbes et peut, par ce moyen, distinguer des alcaloïdes qui présentent pour une irradiation définie des courbes identiques. De cette façon la {héobromine par exemple est moins fluorescente que la caféine, si la longueur d'onde des rayons énergétiques diminue.

Nous avons tenu à insister ici assez longuement sur les travaux de ces auteurs, puisque nous voulons attirer l’attention sur le profit que l’on peut tirer de la pratique analytique physique en général et dans l’étude des pigments en particulier, par l’emploi des phénomènes de fluorescence ; ainsi ces travaux ont apporté des résultats très intéressants pour l’industrie des colorants, la toxicologie pharmaceutique et les recherches physiologiques et criminelles.

Nous voyons que par la combinaison de l'analyse capillaire, de la fluorescence et de la spectrophotométrie, on obtient par voie physique avec une grande facilité, un aperçu exact sur la composition et la structure d’un grand nombre de substances qui, par voie chimique, ne sont que très difcilement analysables, étant données les quantités minimes, dont on dispose ou bien la sensibilité vis-à-vis des réactifs chimiques, ou encore par la complexité de leur structure.

Nous avons par conséquent beaucoup regretté, que par suite des difficultés financières existant dans nos laboratoires, nos recherches sur ce terrain ont été très limitées. Car l’acquisition des appareils spectrophotométriques, dont se servaient BAYLE, FABRE, GEORGE et ANDANT, nous était impossible.

Nous étions par conséquent plus ou moins contraints d’expérimenter et d’analyser notre pigment par les méthodes chimiques.

Nous avons réussi néanmoins à caractériser et à classer notre pigment et nous nous réservons de compléter dans un travail ultérieur cette lacune en ce qui concerne les méthodes physiques.

Nous nous excusons auprès du lecteur d’être très bref dans l’examen physique du pigment du Bacillus Catrulli SARTOR YI.