SOLUTION DE SULFATE DE CUIVRE
La solution de sulfate de cuivre employée a été faite dans un vase d’Erlenmeyer stérile, puis filtrée sur papier Chardin et stérilisée à nouveau, à l'autoclave. Cette solution renfermait 5 grammes de sulfate de cuivre (SO'Cu, 5 H?0) pour 100 cm° d’eau bi-distillée.
Le milieu nutritif auquel j'ai ajouté le sulfate de cuivre était constitué par de l’eau peptonée à 20 p. 1.000 (pH = 7,2) précipitée, puis filtrée, enfin stérilisée à l’autoclave. Le protocole d'addition du sulfate de cuivre est analogue à celui utilisé par S. Bipzinskr (1926). Je rappelle ci-dessous ce protocole.
Eau pept Eau SO{Cu à 5 % . Susp. bact. Concent. 0/00 MA 7 cm 1,950 cm° 0,050 cm° 1 cm 0,250 B 7 1,925 0,075 1 0,375 (Es 7 1,900 0,100 1 0,500 D 7 1,875 0,125 Î 0,725 E 4 1,850 0,150 il 0,750 F 7 1,800 0,200 1 1,000 G 7 LOUE 0,250 1 1,250 H 7 1,700 0,300 1 1,500 1 7 1,600 0,400 1 2,000 J ti 1,500 0,500 1 2,500 é \ 2,000 0 1 0
L'eau physiologique n’a qu’une raison d’être. Celle de ramener à un volume total et uniforme de 10 cm° le contenu de chaque tube.
Il est bien entendu que j'ai utilisé pour répartir les quantités précitées d’eau peptonée, d'eau physiologique, de sulfate de cuivre à 5 % et de suspension bactérienne, la technique habituelle du Laboratoire de Microbiologie, qui consiste à opérer, à l'abri des poussières atmosphériques, et n’employer que des pipettes graduées au 1/20, stérilisées au four Pasteur, j'ai changé de pipette à chaque solution distribuée (1).
(1) Il est très important d'effectuer le mélange homogène de l’antiseptique et du milieu nutritif sans quoi l’antiseptique tombe au fond du tube, et ne gêne en rien la végétation ce qui constitue une importante cause d’erreur,
PO
RÉSULTATS EXPÉRIMENTAUX
a) Détermination de la dose infertilisante
Après 16 heures d’étuve à 37° C., je n'ai constaté, dans les tubes ensemencés avec Bacillus lactis niger GoRrini, type Ra et type S, et ayant reçu du sulfate de Cuivre dans les proportions énumérées ci-dessus, aucune végétation.
Les tubes témoins montraient :
Culture type Ra: des flocons abondants, un trouble uniforme léger du liquide, et un voile ténu, d’où partaient des trainées d’apparence visqueuse.
Culture type S: un développement en surface extrémement ténu, tombant dans le liquide sous forme de longs filaments blanchâtres.
Culture type Rb, à la concentration 0,250, que nous désignerons pour plus de commodité par la lettre A, figurant au protocole en face de cette concentration, j'ai constaté la présence d’un voile grimpant peu consistant, d'un trouble homogène du tube, et de quelques flocons.
Tube B, un voile grimpant peu consistant, un trouble homogène léger, et des flocons rares et petits.
Tube C, une végétation semblable à celle de B.
Tube D, un liseré blanc sur le tube au-dessus du liquide, pas de voile, ni de trouble important.
Le tube témoin montrait un voile grimpant sur 5 mm. le liquide sousjacent étant à peu près clair.
Après 48 heures d'étuve à 37° C., les cultures présentaient les aspects figurant dans le tableau suivant.
TABLEAU
C7 ie
Sen Oo
TABLEAU XI D Ra Rb S Trouble assez important. Voile remontant chagri- Filaments blanchâtres Flocons. né. Trouble considéra Trouble léger. ble.
Trouble assez important. Voile remontant chagri- Rares filaments blancs. Quelques flocons. né. Trouble important. Tr. très léger. Liquide clair. Voile remontant chagri- Liquide clair. né. Trouble léger.
D id. Pas de voile. Troubie id.
du liquide.
id. Liquide clair. id.
| id. id. id. J dE Flocons abond. Trouble Voile grimpant peu con- Développement en surfadu liquide. Voile tén1 sistant haut de 5 mm. ce très ténu tombant tombant en trainées Pas de trouble. dans le liquide sous dans le liquide sous- forme de long filamert jacent. .:: : blanc.
Après 10 jours d'observation, je n’ai constaté aucune apparence de végétation dans les tubes restés clairs après 48 heures d’étuve à 37° C. Nous arrivons aux concentrations infertilisantes suivantes :
Type Ra: 0,5 0/00 de SO{Cu.
Type Rb: 0,75 0/00 de SO{Cu.
Type S: 0,5 0/00 de sulfate de cuivre.
Ces doses me permettent de classer les trois types dissociés en deux %
groupes : Ra-S et Rb.
b) Détermination de la dose mortelle de SO'Cu
Pour trouver la dose mortelle de sulfate de cuivre, j'ai réensemencé sur eau peptonée tous les tubes qui n’avaient pas poussé dans l'expérience précédente.
Après 48 heures d’étuve à 37° C., j'ai fait les observations suivantes:
Type Ra: tous les tubes présentent un trouble liquide, avec flocons et
SATA filaments blanchâtres. Pour les deux concentrations les plus faibles (0,5 et 0,725), voile extrêmement ténu.
Type Rb: tous les tubes présentent un voile remontant à plis très profonds et bourrelets extrêmement nets; l’action de l’antiseptique semble avoir été de renforcer les caractères spécifiques du type.
Type S: tous les tubes présentent un trouble, léger pour les concentrations de 2 et 2,5 pour mille; les autres concentrations présentent en outre un voile d'apparence visqueuse tombant aisément au fond en traînées blanchâtres. :
Le protocole précédent ne permet donc pas d'atteindre les doses mortelles de sulfate de cuivre. J'en ai donc établi un second que j’expose ciaprès.
—————————papZpZEZELELEL
Eau peptonée Eau physiol. Phénol à 5 % Suspens. Concentr. — — = == °/00 a TEE 14 cmÿ 0.6 cm? 1 cm° 3 b 7 12 #7 10/6 1 3 c 7 1 LC). 1 5 d 7 0,8 1,2 1 6 e WT 0,6. 1,4 1 À f 7 0,4 1,6 1 8 g 7 0,2 1,8 1 9 h 7 0 2 1 10 D 7 2 0 1 0
Après 24 heures, ces tubes ne présentaient aucune apparence de végétation. Donc la dose infertilisante était bien atteinte dans l'expérience cidessus. Réensemencés sur milieu neuf (eau peptonée à 2 %), ces tubes présentaient après 24 heures :
Type Ra: À la concentration de 3 pour mille (a), on observe un trouble homogène très net et quelques flocons ; à la concentration de 4 pour mille (b) on perçoit un trouble homogène plus faible, mais néanmoins très visi-
- ble, et quelques rares flocons; le tube c est absolument clair. Le témoin présente un voile d'apparence visqueuse tombant dans le
liquide en longs filaments, et un trouble des 2/3 supérieurs du milieu nutritif.
Type Rb: tous les tubes réensemencés présentaient un voile remontant plissé et un trouble homogène, ainsi que des flocons abondants. Le témoin présentait le même aspect,
TR ns
Type S: les tubes réensemencés ne montraient aucune apparence de. végétation.
Le témoin présentait un trouble du liquide des 2/3 supérieurs et des flocons abondants.
Cette expérience nous montre que: -
La forme dissociée Ra ne supporte pas 5 p. 100 de SO‘Cu:
Bacillus lactis niger Gorini S, plus sensible encore ne supporte pas 3 p.100-de SO‘Cu;
Alors que le type Rb n’est pas tué même par 10 p. 100 de SO{Cu.
Ceci n’est pas pour nous surprendre, puisque le type Rb présente des formes de résistance, et, BIDzINSKI, dans sa thèse faite au Laboratoire (1926) constatait déjà « que la membrane des spores semble imperméable au sulfate de cuivre ».
Une expérience ultérieure devait d’ailleurs me prouver que des spores de la forme dissociée Rb ayant subi l’action du sulfate de cuivre (solution à 20 %) et réensemencées sur eau peptonée, « repartaient » sans avoir paru souffrir de leur contact avec l’antiseptique.
Les résultats obtenus dans l’étude des doses mortelles nous permettent donc de retrouver les deux groupes déjà signalés au sujet des doses infertilisantes: d’une part les types Ra et S, d'autre part, le type Rb.
2° Je viens de décrire l’action du sulfate de cuivre sur la végétation de Bacillus lactis niger GORINI. Je vais maintenant schématiser les modifications de forme que peuvent offrir les trois types dissociés sous l’action de cet antiseptique. ;
Avec le type S en général les plastides sont isolées ou réunies en diplobacilles, tandis que les éléments bactériens des types Ra et Rb restent accolés en chaîne de cinq à treize éléments pour Rb et de six à vingt éléments pour Ra. La modification la plus importante que l’on observe semble être l’apparition de formes très petites, de colorabilité faible. La modification des dimensions est surtout sensible sur le diamètre du cylindre. Un lecteur non prévenu pourrait être tenté de ramener à une impureté la présence de ces plastides modifiées, mais je ne suis pas le seul auteur aui ait fait cette remarque, car déjà A. Dupaix (1933) avait observé des faits analogues avec Bacillus caryocyaneus.
Action comparative du phénol sur les trois types dissociés
Dans une première série d'expériences nous sommes arrivés à classer les trois types dissociés en deux groupes Ra-S et Rb, qu'il s'agisse des
Lot doses mortelles ou des doses infertilisantes. Avec le phénol, seule la dose mortelle permet d'établir cette même classification.
Lorsqu'il s'agit de déterminer la dose infertilisante on est obligé de comparer l’action d’une substance vis-à-vis de l'espèce microbienne expérimentée, mais aussi à l'égard de Bactéries qui depuis de longues années ont servi de matériel pour l'étude du pouvoir antiseptique, c'est ainsi que j'ai été amené à étudier l’action du phénol sur B. pyocyanique PeA de la collection du Laboratoire de Microbiologie et à constater que la dose infertilisante trouvée (1 pour mille), et la dose mortelle ( 1,5 pour mille)
étaient à peu de chose près les mêmes que celles publiées par J.-G. Mar- CHAL (1932).
Dans l'étude du pouvoir antiseptique deux choses sont à considérer :
1° Evaluer le pouvoir toxique d’une substance par rapport à celui d’une autre substance parfaitement bien étudiée, c'est ce que l’on fait fréquemment dans les pays de langue anglaise lorsqu'il s'agit de déterminer l’action bactéricide du phénol (A. Dupaix, 1933).
2° Afin de se familiariser avec la technique qu'il aura à utiliser l’auteur a toujours intérêt à étudier une même substance non seulement sur les espèces microbiennes, mais encore sur une Bactérie qui a fait l’objét de très nombreux travaux. Et c’est pour cela que j'ai rapporté un peu plus haut les résultats obtenus avec le B. Pyocyanique PeA.
Recherches nouvelles
a) TECHNIQUE EMPLOYÉE
1° L’obtention de cultures pures a été réalisée à l'aide du procédé décrit antérieurement (1).
2° Solution de phénol. — Elle a été effectuée dans un vase d'Erlenmeyer, stérilisé au four Pasteur et renferme 5 grammes de phénol MERCK dissous dans 100 cm° d’eau bi-distillée.
3° Le milieu nutritif était constitué, comme pour l'étude précédente, par de l’eau peptonée à 20 p. 1.000, de DHES272:
(1) Voir l’action du Sulfate de Cuivre sur B. lactis niger Gorini.
