STI
20) Lavages
A) Conditions de centrifugation.
Par la remise en suspension d'un culot dans 1e saccharose 0,88 M les valeurs de d ot n se trouvent modifiées ct augmentéess; l'homogénéisation dù tissu on effot avait provoqué une dilution de la solution de saccharose: lés constantes de sédimentation dans le milieu neuf sont diminuécs de 20 p.cent environ et le facteur UW°Et doit être augmenté de 20 p.cent. Ce résultat peut être obtenu en augmentant soit la vitesse de 10 p.cent soit la durée de 20 p.cent.
On prendra par exemple. les conditions suivantes:
lavages des noyaux 10 minutes à ‘1100 t/m lavages dos mitochondries 30 minutes à 17000 t/m
RP 3 4 PR SR RO he Panier : CORP TX * Vitesse correspondant pour l'International à une accélération maxima de 24.000 g. Une centrifugation de 20 minutes dans ces conditions ne sédimenterait totalement que.les particules de constante süpérioure à 18,5 x 107 LE \ #* Vitesse correspondant à une accélération maxima pour l'International de 40.000 g.
**# Accélération maxima pour le SPINCO, 145,000 g.
lavages des microsomes I 2 h 10
22000 t/m lavages des microsomæs II 3 h 20
B) Nombre re de lavages.
Lors de la contrifugation initiale, une fraction donnée, dont la constante de sédimentation minima est S, est toujours contaminée par la sédimentation partielle des particules inférieures. Si l'on désigne par f la proportion sédi= montée des particules on au bout de n lavages cette proportion sérea-réduits 2 fre Connaissant Lis LICE donc aisé de détorminer le nombre EE lavages noce einen pour amener la contamination au-dessous d'une valeur donnée. En général, dans un tube incliné entièrement plein, on ne connaît pas exactement f, mais pour une particule de constante S',frost! peu différent mais toujours supérieur au rapport
st comme consoquence de l'accroissement de la force centrifuge avec le rayon de rotation. On pourra donc prendre comme väicür minima de f, le rapport à. I1 est évident d'autre part que l'impureté sera d'autant plus difficile à éliminer que sa constante de sédimentation est plus grande, il suffit donc
(sf ne l'élimination des plus grossos particules contaminantes
Noyaux :
| — -11 (1 és 11 7 ° ° DO O0D0 ELU 51 = 100x 10 (la valeur minima de f sera 0,01). Un soul lavage suffira pour ne laisser dans le culot que moins de 1 p.cent des grosses mitochondries,
Mitochondries:
Le rapport = est voisin de 0,5. La contamination exprimée
on pourcentage des plus gros microsomes de la fonction I sera de: 1
12,9 p.cent au bout de 2 lavages ca p.cent au bout de 4 lavages eu p.cont au bout de 5 lavages nl cent SU Dout. dé 6 lavaces.
Deux lavages sont nettement insuffisants et 11 faudra, suivant le degré de pure té désiré, effectuer au minimum de quatre à six lavagcs.
Microsomes TL:
| ht Le rapport + est ici de 0,6, la contamination par les gros microsomes de la fraction II sera de | |
2e p.cent au bout de 2 lavages :< 5 p.tent au. bout de 5 lavages < 2 p.cent au bout de 7 lavages CaAlLep,cent au bout 06 6 Llavagesr
Dans ce cas cinq lavages seront souvent: encore îinsuffisants. |
Il semble bien que les auteurs de tecmmiques de centrifugations fractionnéos n'aient pas eu jusqu'ici conscience de l'importance de ce facteur. La nécessité de très nombreux lavages est cependant un fait que l'expérience suivante met claîrement en évidence. ;
Les microsomes obtenus par une centrifugation de 2 heures à 40.000 g/ au centrifugeur International ont été - sounis successivement à quatre lavages dans les mêmes conditions de centrifugation: *
ee ee me D Se M de M eue ms — ——— 5 —— ee me De fous Po Dot me one me De D D D ee DS M MS DS ee Me qe ee ee me me en me ms ie Me me mc seu
Azote total Azote total Azote du culot (u&) | du surnagoant (ug)| enlevè p.cent
1 Maovases AT OGE 2e lavage : 1 .884 BOMIAVAUOS | 2 111,509 4e lavage | 1.380
+ os re mt ts st té mé ot pt D cé et D dt US D D De mn ét on mm ee en te D em ne D nn os ét le ne né De D D ee D One Mt me ee mi ne
ee ee ie D D De de ee (Re ES mn OS NS OS ee M eu ve ea
HOGEBOOM (41) donne un exemple analogue de lavage de mitochondries,
Re nn PE a As
* Pour évitor une destruction partielle des structures, les culots, avant chaque nouvelle centrifugation, ont 6té remis on suspension par une agitation de dix minutes au moyen d'un agitateur à palette,
